(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106； 2.成都列五中學(xué)， 四川 成都 610007)

卷葉貝母(FritillariacirrhosaD.Don)屬于百合科多年生草本植物，生長(zhǎng)在海拔2 800～4 700 m的高山灌叢或草地中[1]，喜在冷涼氣候條件下生長(zhǎng)，具有耐寒、喜濕、怕高溫、喜蔭蔽的特性。卷葉貝母具有清熱潤(rùn)肺，化痰止咳之功效，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等癥狀，以卷葉貝母為原料的中成藥達(dá)100種以上[2]，卷葉貝母是稀有的治療咳嗽的良藥。近年來(lái)，由于卷葉貝母價(jià)格昂貴，加之無(wú)計(jì)劃的盲目采挖，自然資源已日趨枯竭，其價(jià)格也不斷上漲。

隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物上的廣泛應(yīng)用，其已成為保護(hù)瀕臨滅絕的野生藥用資源和生產(chǎn)替代品的關(guān)鍵手段[3]。組織培養(yǎng)技術(shù)生長(zhǎng)周期短，繁殖率高，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。卷葉貝母植物的入藥部位是其鱗莖，筆者按照2015年藥典方法測(cè)定了野生卷葉貝母植株的鱗莖和根器官中的總生物堿含量，發(fā)現(xiàn)鱗莖中的總生物堿含量為0.068%，而根中的總生物堿含量為0.071%，比鱗莖稍高。因此本實(shí)驗(yàn)采用卷葉貝母的根進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)研究，以期獲得生長(zhǎng)快、有效成分含量高的優(yōu)質(zhì)愈傷組織，為進(jìn)一步開(kāi)展卷葉貝母大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分提供良好的材料，從而很好地緩解卷葉貝母藥材資源短缺問(wèn)題，同時(shí)也可為卷葉貝母的遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自四川省阿壩自治州的野生卷葉貝母植株根，經(jīng)成都大學(xué)中藥鑒定室鑒定為卷葉貝母(FritillariacirrhosaD.Don)。

1.2 方 法

1.2.1外植體不同消毒時(shí)間的篩選

選取生長(zhǎng)2年以上、生長(zhǎng)狀況良好的卷葉貝母植株根，先用濃度為0.03%的升汞液將根表面沖洗干凈后，放在18 ℃的條件下陰干4 h，再放在超凈臺(tái)上，采用在每100 mL的0.1%升汞溶液中滴加0.7 mL濃度為0.4%聚乙二醇辛基苯基醚溶液進(jìn)行消毒處理，并用無(wú)菌水洗5次，最后用無(wú)菌濾紙吸干材料表面的水分，在超凈臺(tái)上進(jìn)行消毒的時(shí)間分別為1，3，5，7，9 min，編號(hào)為A 1～A 5。

將消毒后的根，接種于MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1培養(yǎng)基上，各培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂5.5 g·L-1，pH值為6.0，在溫度15 ℃，每天光照6 h和光照強(qiáng)度為1 800 lx的條件下培養(yǎng)(下同)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的染菌率和啟動(dòng)率。

1.2.2不同激素配比對(duì)根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

切取已消毒的卷葉貝母根尖1.5 cm，接入改良的MS基本培養(yǎng)基(無(wú)機(jī)物硝酸氨的含量減半)中，并且添加細(xì)胞分裂素異戊烯基腺嘌呤(2 iP)的濃度范圍設(shè)定為0.5～1.5 mg·L-1，生長(zhǎng)素萘乙酸(NAA)的濃度范圍設(shè)定為0.3～1.0 mg·L-1，共配制12種培養(yǎng)基，編號(hào)分別為B 1～B 12，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

1.2.3不同激素配比對(duì)根愈傷組織增殖的影響

選取培養(yǎng)的質(zhì)地較緊密和顏色為白色的愈傷組織，切成0.6 cm3團(tuán)塊大小轉(zhuǎn)接入B 5+多效唑1.0 mg·L-1+活性炭1.5 mg·L-1的基本培養(yǎng)基中，再附加生長(zhǎng)素2,4-D 的濃度范圍為1.0～4.0 mg·L-1，細(xì)胞分裂素KT 0.1～1.0 mg·L-1，共配制10種培養(yǎng)基，編號(hào)分別為C 0～C 9，在溫度18 ℃，每天光照3 h和光照強(qiáng)度為400 lx的條件下增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的增殖情況。

1.2.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

染菌率(%)=(染菌外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

啟動(dòng)率(%)=(啟動(dòng)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

愈傷組織增殖倍數(shù)=收獲的重量/接種的重量。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體不同消毒時(shí)間的研究

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)外植體進(jìn)行有效的消毒處理是非常重要的。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)卷葉貝母植株根生長(zhǎng)在土壤中的狀況，選擇先采用濃度為0.03%的升汞液沖洗根表面后，再在超凈臺(tái)上采用改良的升汞液進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)卷葉貝母根外植體的消毒影響

編號(hào)消毒時(shí)間/min染菌率/%啟動(dòng)率/%A1132.5371.51A2310.5680.55A35082.35A47065.56A59037.50

注：接種30 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以根體積產(chǎn)生膨大計(jì)為啟動(dòng)的外植體。

從表1可以看出，采取不同的消毒時(shí)間對(duì)卷葉貝母根外植體的染菌率和啟動(dòng)率都有顯著影響。從觀察根外植體的染菌狀況來(lái)看，隨著A 1到A 5消毒時(shí)間的逐漸遞增，外植體的染菌率表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，其中在A 3至A 5的消毒時(shí)間段，根外植體都沒(méi)有出現(xiàn)染菌，接種30 d后統(tǒng)計(jì)的染菌率都為0%；而從卷葉貝母根外植體的啟動(dòng)狀況來(lái)看，隨消毒時(shí)間由A 1到A 5的逐漸遞增，根外植體的啟動(dòng)率呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中在A 3的消毒時(shí)間內(nèi)，根外植體的啟動(dòng)率最高達(dá)到82.35%，而在A 5的消毒時(shí)間根外植體的啟動(dòng)率最低，僅為37.50%，并且通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到5 min時(shí)，根外植體呈現(xiàn)出明顯的升汞中毒現(xiàn)象，外植體質(zhì)地變得松軟，生長(zhǎng)也停滯。這是因?yàn)樯疕gCl2為重金屬鹽類，其作用機(jī)制是HgCl2與微生物蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合而使微生物失活，但同時(shí)對(duì)植物也會(huì)造成傷害[4]。因此，從降低卷葉川貝根外植體的染菌率和提高其啟動(dòng)率兩方面來(lái)綜合考慮，應(yīng)選取A 3即5 min的消毒時(shí)間，在此條件下外植體的污染率為0%，而啟動(dòng)率為82.35%。

2.2 不同激素配比對(duì)根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取表1中的A 3即5 min消毒時(shí)間對(duì)卷葉貝母根進(jìn)行消毒處理后，接種在含有不同濃度異戊烯基腺嘌呤(2 iP)和NAA的組合的12種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)。

表2 不同激素配比對(duì)根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

編號(hào)激素質(zhì)量濃度/(mg·L-1)2iPNAA誘導(dǎo)率/%B10.5030.45B20.50.343.56B30.50.653.72B40.51.060.27B51.0068.56B61.00.372.30B71.00.685.41B81.01.080.31B91.50 60.23B101.50.371.36B111.50.677.49B121.51.053.49

由表2可以看出，由不同濃度的2 iP和NAA組合的培養(yǎng)基配方，對(duì)卷葉貝母根外植體的愈傷組織誘導(dǎo)影響較大。當(dāng)2 iP濃度為0.5 mg·L-1不變時(shí)，B 1～B 4隨著NAA濃度逐漸升高，誘導(dǎo)率逐漸增加，其中B 4時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到60.27%；而當(dāng)2 iP濃度為1.0 mg·L-1不變時(shí)，B 5～B 8隨著NAA濃度逐漸升高，其愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，其中以B 7的誘導(dǎo)率為最高，為85.41%；當(dāng)2 iP濃度為1.5 mg·L-1不變時(shí)，B 9～B 12隨著NAA濃度逐漸升高，其愈傷組織誘導(dǎo)率也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中以B 12的愈傷組織誘導(dǎo)率低，為53.49%，這說(shuō)明盡管NAA具有促進(jìn)卷葉貝母根外植體產(chǎn)生愈傷組織的作用，但是高濃度的NAA還是有其抑制作用，這一結(jié)果與付文奇等[5]、康微等[6]的研究結(jié)果相同。

當(dāng)NAA濃度為0.3 mg·L-1時(shí)，B 1、B 5、B 9隨著2 iP濃度逐漸升高，誘導(dǎo)率呈先增后減的趨勢(shì)，這一結(jié)果表明，低濃度的2 iP能促進(jìn)卷葉貝母根愈傷組織的誘導(dǎo)，而高濃度則抑制愈傷組織的誘導(dǎo)。使用的激素種類、濃度及培養(yǎng)條件對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)有很重要作用，實(shí)質(zhì)是培養(yǎng)基中的外源激素被植物吸入植物體內(nèi)，再和內(nèi)源激素共同作用誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織[7]。綜合分析表2可以看出，B 7培養(yǎng)基MS+2 iP 1.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1是誘導(dǎo)卷葉貝母根愈傷組織產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基配方；觀察發(fā)現(xiàn)，卷葉貝母根外植體在培養(yǎng)7 d時(shí)，在根基部的切口處出現(xiàn)了明顯的膨大，在培養(yǎng)15 d后開(kāi)始有呈白色較緊密的愈傷組織產(chǎn)生，在培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其愈傷組織的誘導(dǎo)率為85.41%。

2.3 不同激素配比對(duì)根愈傷組織增殖的影響

選擇由2.2 誘導(dǎo)獲得的質(zhì)地較緊密、顏色為白色的愈傷組織，切成0.6 cm3團(tuán)塊大小轉(zhuǎn)接入表3的10種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)根愈傷組織的增殖倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同激素配比對(duì)根愈傷組織增殖的影響

編號(hào)激素質(zhì)量濃度/(mg·L-1)KT2,4-D增殖倍數(shù)/倍C00.00.01.87C10.11.02.09C20.13.02.59C30.15.01.96C40.31.02.79C50.33.03.26C60.35.03.01C70.51.02.65C80.53.02.84C90.55.02.57

由表3可知，將根愈傷組織接入未加激素的C 0培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)30 d后的愈傷組織增殖倍數(shù)僅為1.87倍，是上述10種培養(yǎng)基中最低的。說(shuō)明植物激素對(duì)卷葉貝母根愈傷組織的增殖生長(zhǎng)有重要的促進(jìn)作用。當(dāng)KT濃度為0.1，0.3，0.5 mg·L-1保持不變時(shí)，隨著2,4-D濃度逐漸升高，C 1～C 3，C 4～C 6，C 7～C 9均呈現(xiàn)出由低升高再降低的趨勢(shì)，說(shuō)明2,4-D在低濃度對(duì)愈傷組織增殖有促進(jìn)作用而高濃度抑制其生長(zhǎng)，與涂紅艷等[8]的研究結(jié)果一致；隨著2,4-D濃度的增加，培養(yǎng)的愈傷組織褐化情況加重，這是由于高濃度的2,4-D對(duì)愈傷組織有一定的毒效應(yīng)。

當(dāng)2,4-D為3.0 mg·L-1保持不變時(shí)，隨著KT濃度逐漸升高，C 2、C 5和C 8增值倍數(shù)分別呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明低濃度KT對(duì)愈傷組織增殖有一定促進(jìn)作用，而高濃度KT反而抑制愈傷組織生長(zhǎng)；同時(shí)在C 7～C 9中，褐化程度明顯減小，說(shuō)明高濃度的KT有明顯減輕褐化作用[9]；上述不同濃度激素的培養(yǎng)基中均能形成愈傷組織，其中倍數(shù)最大的方案為附加KT 0.5 mg·L-1和2,4-D 3.0 mg·L-1，此時(shí)增殖倍數(shù)為3.26倍。綜合考慮愈傷組織增殖倍數(shù)及生長(zhǎng)情況可以得出，C 8培養(yǎng)基MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1最適于卷葉貝母愈傷組織的增殖，產(chǎn)生生長(zhǎng)健康、無(wú)褐化和玻璃化現(xiàn)象的愈傷組織。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用卷葉貝母根為外植體，經(jīng)適宜的消毒和誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)后，成功地誘導(dǎo)出愈傷組織，成功地實(shí)現(xiàn)了卷葉貝母愈傷組織的快速增殖培養(yǎng)，本研究對(duì)利用生物技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)母藥物有效成分奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。從消毒時(shí)間篩選、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選、增殖培養(yǎng)基篩選等方面進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，是誘導(dǎo)外植體脫分化的重要因素[10]。細(xì)胞生長(zhǎng)素能影響細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和分化，有利于外植體脫分化形成愈傷組織，而細(xì)胞分裂素能降低愈傷組織的誘導(dǎo)率，抑制愈傷組織的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇外源激素的種類、濃度及不同的激素組合對(duì)外植體細(xì)胞誘導(dǎo)以及增殖發(fā)生具有顯著影響，這是因?yàn)榧に厥侵参矬w內(nèi)的微量信號(hào)分子，其濃度以及不同組織對(duì)激素的敏感性控制了植物的整個(gè)發(fā)育進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)主要選取2年生以上的卷葉貝母根為外植體，實(shí)現(xiàn)了其愈傷組織誘導(dǎo)與增殖；另外，嘗試選用1年生的卷葉貝母根進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過(guò)程中很少有外植體啟動(dòng)和愈傷組織產(chǎn)生的情況，這說(shuō)明選擇處于不同生長(zhǎng)時(shí)期的外植體材料對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)也有十分重要的影響；在對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理時(shí)，相同條件下若將根切開(kāi)接入培養(yǎng)基，染菌率會(huì)大大增加，而啟動(dòng)率無(wú)明顯提高，所以外植體的處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有著一定影響；同時(shí)，將根以平放方式放在培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率明顯優(yōu)于豎直方式插入培養(yǎng)基，這說(shuō)明選擇接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有著重要作用；另外，在進(jìn)行愈傷組織卷葉貝母增殖培養(yǎng)時(shí)，選擇進(jìn)行增殖的愈傷組織不能切割太小，但是創(chuàng)傷面要盡量小，這樣更有利于愈傷組織的快速增殖。