黨文芳，李雪艷，楊紅梅，楚 敏，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫(kù)爾，李玉國(guó)，婁 愷，史應(yīng)武,3,4

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所 ,烏魯木齊830091；3.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊830091)

0 引 言

【研究意義】真菌作為構(gòu)成土壤微生物群落的重要組成部分之一，同時(shí)作為土壤中大部分微生物生物量的來(lái)源[1]，再加上棉花黃萎病是一種土傳真菌引起的病害，所以土壤真菌的種類、定殖率和定殖量等因素都將成為直接影響真菌對(duì)宿主植物效應(yīng)的關(guān)鍵因素。新疆棉花黃萎病的加劇成為制約新疆棉田產(chǎn)量及棉花纖維品質(zhì)的因素之一。棉花黃萎病是一種土傳真菌病害，目前，用于防治棉花黃萎病報(bào)道最多也最有發(fā)展前景的防治辦法為生物防治。了解新疆棉田根際土壤微生物動(dòng)態(tài)變化對(duì)于生防微生物的篩選及其應(yīng)用都能提供很好的理論依據(jù)。棉花黃萎病根際土壤真菌定量分析對(duì)揭示棉花根際土壤真菌影響黃萎病發(fā)生、以及微生態(tài)調(diào)控黃萎病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】劉會(huì)梅等[2]評(píng)價(jià)了傳統(tǒng)的土壤真菌分離和計(jì)數(shù)方法：分離工作量大，耗時(shí)多；直接計(jì)數(shù)法估計(jì)的真菌總數(shù)低于實(shí)際存在，間接計(jì)數(shù)法存在不能區(qū)分這些真菌是死菌還是活菌的問(wèn)題，不能全面反映土壤真菌的實(shí)際情況。顧美英等[3]以棉田黃萎病發(fā)病植株與健康植株根際土壤作為對(duì)象，以稀釋平板法研究了根際土壤微生物的數(shù)量變化情況。高峰等[4]利用巢式PCR技術(shù)對(duì)土壤中病原菌進(jìn)行了初步定性檢測(cè)，而對(duì)于定量還未做具體研究。有關(guān)分子生物學(xué)的很多方法在細(xì)菌檢測(cè)中應(yīng)用的很多，而在真菌中應(yīng)用的則相對(duì)較少[5]。隨著 PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展應(yīng)用[6-7]，植物各組織中內(nèi)生真菌的含量測(cè)定已多采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR)法[8-11]，結(jié)果顯示，該方法可以實(shí)時(shí)的對(duì)內(nèi)生真菌的變化情況進(jìn)行較全面的分析。2011 年，肖蕊等[11]用SYBR Green I 熒光定量 PCR 檢測(cè)方法對(duì)土壤中棉花黃萎病病原菌進(jìn)行定量，并對(duì)該方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是一種方便、快速、準(zhǔn)確、用樣量小、非微生物培養(yǎng)的定量方法[12-14]，其檢測(cè)原理是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在整個(gè)監(jiān)測(cè)進(jìn)程中利用熒光信號(hào)積累來(lái)反應(yīng)體系變化，后通過(guò)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析未知樣品的一種方法[15-20]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)同樣也可用于土壤真菌的定量檢測(cè)。研究新疆棉田根際土壤真菌熒光PCR技術(shù)定量及其時(shí)空動(dòng)態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立棉田根際土壤真菌定量分析的方法，對(duì)新疆主要棉花生態(tài)區(qū)棉花根際土壤進(jìn)行調(diào)查，明確其根際土壤真菌分布規(guī)律及其與黃萎病病原菌數(shù)量的關(guān)系[17]。

1 材料與方法[18]

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

分別在棉花的4個(gè)生育期(苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期)對(duì)新疆北疆地區(qū)的石河子(SHZ)、烏蘇(WS)和精河(JH)；南疆地區(qū)的庫(kù)爾勒(KEL)、圖木舒克(TMSK)和阿拉爾(ALE)；東疆地區(qū)的哈密(HM) 7個(gè)植棉區(qū)進(jìn)行土樣采集。以棉株根際10～15 cm深的土壤為采樣標(biāo)準(zhǔn)，分別標(biāo)明為棉花病株還是棉花健株，采樣后用直徑為2 mm的篩網(wǎng)過(guò)篩、混勻后裝入密封袋中保存在4 ℃冰箱中，待測(cè)。

1.1.2 主要試劑

試劑：Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生物工程股份有限公司)。

1.1.3 主要儀器

儀器：Eppendorf Centeifuge 5417R型離心機(jī)(美國(guó)默飛世爾科技公司)；DW-40L188型醫(yī)用低溫保存箱(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)；T Personal型PCR儀(杭州博日科技有限公司)；DYCP-31E型電泳儀(北京六一儀器廠)；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；Epoch型超微量微孔板分光光度計(jì)(濟(jì)南利科醫(yī)療器械有限公司)；Roche LightCyclerR480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司)。

1.2 方 法[9]

1.2.1 棉花根際土壤微生物基因組總DNA的提取

利用土壤基因組DNA抽提試劑盒對(duì)棉花病株根際土壤和棉花健株根際土壤基因組總DNA進(jìn)行提取。將提取的DNA樣品保存在-20℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

應(yīng)用真菌通用性引物0817F (5'- TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')和1196R (5'- TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')對(duì)土壤基因組總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，探針用 FAM 和 BHQ1，同時(shí)設(shè)不加模板的為陰性對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。根據(jù)反應(yīng)的Ct值、最佳退火溫度及擴(kuò)增效率(接近100%)對(duì)擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得到熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：模板5 μL，引物各0.8 μL，F(xiàn)S Essential DNA Probes Master 10.0 μL，探針0.4 μL，總體系為20 μL，95℃預(yù)變性10 min；95℃變性25 s，50℃退火120s，72℃延伸90s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的制備與鑒定[19]

對(duì)最佳擴(kuò)增條件下得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，將純化的土壤真菌擴(kuò)增物構(gòu)建質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取上述陽(yáng)性質(zhì)粒DNA，再用超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的OD值，進(jìn)而計(jì)算質(zhì)粒的濃度。把已獲得的質(zhì)粒稀釋成不同濃度，用熒光定量檢測(cè)已稀釋的不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在Roche LightCycle 480軟件內(nèi)拷貝數(shù)據(jù)，用Origin 8.5軟件作圖并生成方程，建立Ct值與棉花根際土壤真菌濃度之間的線性關(guān)系。

1.2.5 樣品的RT- qPCR檢測(cè)

在最優(yōu)擴(kuò)增條件下對(duì)不同地區(qū)和生育期的棉花根際土壤真菌DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用RT-PCR對(duì)擴(kuò)增后的根際土壤真菌進(jìn)行定量檢測(cè)，將得到的每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的Ct值帶入上述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算棉花在不同生長(zhǎng)期及所對(duì)應(yīng)地區(qū)的根際土壤真菌的含量(copies/g FRW)。

1.2.6 棉花黃萎病病原菌的RT-qPCR

構(gòu)建棉花黃萎病病原菌RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程的建立。其中以棉花根部組織總DNA為模板，進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，同時(shí)設(shè)無(wú)棉花黃萎病菌的空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 棉花黃萎病病原菌與根際土壤真菌的相互關(guān)系

定量檢測(cè)7個(gè)采樣點(diǎn)棉花根部黃萎病病原菌和根際土壤真菌。用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient, PCC)分析黃萎病病原菌與根際土壤真菌的相關(guān)性，在SPSS 22軟件中進(jìn)行PCC分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

研究用Origin 8.5和Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)作圖，SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[20]

根據(jù)已知重組質(zhì)粒全序列計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為8.92×105copies/g (FRW)，以10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，獲得8.92×105～8.92×105copies/g (FRW) 6個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。將6個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，將LightCyclerR480系統(tǒng)軟件得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。圖1,圖2

研究表明，曲線的相關(guān)性系數(shù)R2=0.993，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與循環(huán)數(shù)Ct之間的相關(guān)性較強(qiáng)；曲線的截距為30.797，斜率為-2.165 1。故棉花根際土壤真菌的DNA起始濃度對(duì)數(shù)值與Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2.165 1x+30.797，其中x為根際土壤真菌DNA起始濃度的對(duì)數(shù)值，y為擴(kuò)增反應(yīng)Ct值。圖2

圖1 10倍梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線
Fig.1 Real-time PCR amplifacation curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

圖2 10倍梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.2 RT-q PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 不同生育時(shí)期新疆棉花黃萎病病株根際土壤真菌數(shù)量

研究表明，在棉花四個(gè)生育期(苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期)，棉花病株根際土壤真菌數(shù)量最大值出現(xiàn)在吐絮期。庫(kù)爾勒棉花病株根際土壤真菌在苗期達(dá)到最大，為4.23×104copies/g FRW，苗期到蕾期直線下降，隨后變化趨勢(shì)不大；阿拉爾棉花病株根際土壤真菌在苗期至蕾期逐漸增加，隨后逐漸減小，在吐絮期達(dá)到最小，為1.41×10-4copies/g FRW；哈密棉花病株根際土壤真菌從苗期到花鈴期呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，花鈴期到吐絮期直線增長(zhǎng)，吐絮期達(dá)到最大，為6.16×104copies/g FRW；精河棉花病株根際土壤真菌在苗期最小，石河子、烏蘇、精河和圖木舒克棉花病株根際土壤真菌在苗期到花鈴期變化趨勢(shì)不大，花鈴期到吐絮期逐漸增加。圖3

圖3 不同生育時(shí)期棉花黃萎病株根際土壤真菌數(shù)量變化
Fig.3 Variation of number of fungi in rhizosphere soil of cotton infected by Verticillium wilt at different growth stages

2.3 新疆不同地區(qū)棉花黃萎病株根際土壤真菌數(shù)量

研究表明，總體來(lái)看新疆棉花病株根際土壤真菌數(shù)量的空間變化是東疆大于南疆大于北疆。石河子、烏蘇和精河在吐絮期棉花病株根際土壤真菌較多，首先是烏蘇，其次是精河，最后是石河子；庫(kù)爾勒棉花病株根際土壤真菌在苗期最多，為4.23×104copies/g FRW；圖木舒克和阿拉爾的棉花病株根際土壤真菌在整個(gè)生育期都表現(xiàn)較少，哈密棉花病株根際土壤真菌在吐絮期呈現(xiàn)最多，為6.16×104copies/g 。圖4

圖4 不同地區(qū)棉花黃萎病株根際土壤真菌數(shù)量變化
Fig.4 Variation of number of fungi number in rhizosphere soil of cotton infected by Verticillium wilt at different regions

2.4 棉花根際土壤真菌與黃萎病菌數(shù)量的相互關(guān)系

采樣點(diǎn)石河子的花鈴期、阿拉爾的吐絮期其棉花根部病原菌分布較多，但根際土壤真菌分布較少，其他地區(qū)表現(xiàn)為棉花根部黃萎病病原菌分布較高的采樣區(qū)同時(shí)期其根際土壤真菌分布也較高。在所測(cè)的七個(gè)樣點(diǎn)中，苗期棉花黃萎病病原菌和根部土壤真菌的分布均較低。北疆棉花根部黃萎病病原菌分布的最大值較多出現(xiàn)在花鈴期，而南疆和東疆一般出現(xiàn)在棉花吐絮期。石河子、烏蘇均在花鈴期棉花黃萎病病原菌分布最高，但在吐絮期根際土壤真菌分布最高。采樣點(diǎn)阿拉爾的棉花根際土壤真菌數(shù)量分布在整個(gè)生育期的吐絮期為較小，而同期黃萎病病原菌數(shù)量分布最高。表1

研究表明，北疆精河和東疆哈密棉花根際土壤真菌數(shù)量與黃萎病病原菌數(shù)量的PCC分別高達(dá)0.989和0.993，呈顯著正相關(guān)。而南疆圖木舒克棉花根際土壤真菌數(shù)量與黃萎病病原菌數(shù)量的PCC為0.880，呈正相關(guān)。北疆石河子和烏蘇、南疆庫(kù)爾勒和阿拉爾棉花根際土壤真菌與黃萎病病原菌的PCC分別為-0.252 和-0.305、-0.539和-0.777，均呈負(fù)相關(guān)。表2

表1 棉花不同地區(qū)和生育期根部所帶黃萎病病原菌數(shù)量及根際土壤真菌含量
Table 1 Number of pathogens of Verticillium wilt and rhizosphere soil fungi in roots of cotton in different regions and periods (copies/g FRW)

Sampling sites苗期Seeding stage蕾期Bud stage花鈴期Flower stage吐絮期Boll opening stage病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根際土壤真菌Rhizosphere soil fungusSHZ118388.025 11771 186.645131 0060.372 60921 7109 983.443WS42.102 277249 451759.508 3131 200137.637 358 0882 0437.36JH46.60E-0514 302609.216 423 376301.179 228 52716 550.69KEL942 258.66515.25 144.1762 4025 361.2781 1145 244.056ALE4732 175.9338 7584 378.19333 1271 836.5775 767 6150.000 141TMS871 578.373806.92 254.67283 470298.614 3853 0605 141.67HM2323 142.353699.67 123.0341 8273 960.062483 46261 603.6

表2 不同采樣點(diǎn)棉花根際土壤真菌與棉花黃萎病原菌數(shù)量的PCC
Table 2 PCC of the number of fungi and cottonVerticilliumwiltin the rhizosphere soil of cotton at different sampling points

Sampling locationsSHZWSJHKELALETMSHMPCC-0.252-0.3050.989*-0.539-0.7770.8800.993*

研究表明，各生育時(shí)期棉花根際土壤真菌數(shù)量與黃萎病病原菌數(shù)量均呈負(fù)相關(guān)。其中花鈴期棉花內(nèi)生真菌與黃萎病病原菌的 PCC為-0.620，其相關(guān)度較高。其他根際土壤真菌與黃萎病病原菌之間相關(guān)性均較低，如苗期棉花根際土壤真菌與黃萎病病原菌的 PCC 僅為-0.153。表3

表3 棉花不同生育期根際土壤真菌與棉花黃萎病原菌數(shù)量的PCC
Table 3 PCC of rhizosphere soil fungi and cottonVerticilliumwiltpathogens in different growth stages of cotton

Growth stagesSeedling stageBud stageFlower seasonBoll opening stagePCC-0.153-0.401-0.620-0.327

3 討 論

目前，對(duì)于我國(guó)棉花內(nèi)生真菌的研究還處于起步階段，可見(jiàn)的報(bào)道也很少，我國(guó)棉花根際土壤真菌的報(bào)道更是少之又少。土壤作為棉花黃萎病土傳災(zāi)害的來(lái)源，探究其與棉花黃萎病的關(guān)系是很重要的。2010 年，Tellenbach等[21]建立了植物內(nèi)生真菌的方法。史應(yīng)武等[17]建立了有關(guān)新疆棉花內(nèi)生真菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)報(bào)道，張濤等[18]建立了有關(guān)新疆棉花根際土壤細(xì)菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)報(bào)道，李雪艷等[22]建立了有關(guān)新疆棉花內(nèi)生細(xì)菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)借鑒他們的方法開(kāi)展新疆棉花根際土壤真菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。除此之外，我國(guó)尚未報(bào)道過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)棉花根際土壤真菌的研究。

4 結(jié) 論

新疆棉花病株根際土壤真菌數(shù)量在時(shí)間和空間上變化不盡相同，數(shù)量在空間變化上是東疆大于南疆大于北疆；數(shù)量在時(shí)間變化上是吐絮期最大，花期最小。但具體的變化趨勢(shì)仍然不明朗，有待更系統(tǒng)全面的研究；且在不同的植棉區(qū)棉花病株根際土壤真菌的差異很大，這也說(shuō)明了不同植棉區(qū)的土壤環(huán)境差異很大，該文只是初步探討了新疆棉花黃萎病株根際土壤真菌的變化趨勢(shì)，有關(guān)不同土壤環(huán)境對(duì)真菌的適應(yīng)性還有待進(jìn)一步的研究。

新疆棉花根際土壤真菌數(shù)量與黃萎病病原菌數(shù)量有一定的相關(guān)性，但總體上這種相關(guān)性在棉花不同生態(tài)區(qū)及其各個(gè)生育期并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，只是說(shuō)明兩者在棉花不同生態(tài)區(qū)表現(xiàn)為正相關(guān)，而在不同生育期則表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。在棉花不同生育期，根際土壤真菌數(shù)量與黃萎病病原菌數(shù)量呈較高的負(fù)相關(guān)性可能是因?yàn)殡S著棉花生育時(shí)期的推進(jìn)，黃萎病病原菌在棉花根部大量繁殖，對(duì)棉花根際土壤的營(yíng)養(yǎng)條件造成很大破壞，同時(shí)形成空間及營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致根際土壤真菌不能很好的生長(zhǎng)和繁殖。