朱雪峰，田文剛，熊顯鵬，薛 飛，張 莉，朱華國(guó)

(石河子大學(xué)/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003)

0 引 言

【研究意義】隨著我國(guó)科技的進(jìn)步，棉花種植技術(shù)日益成熟，我國(guó)目前已經(jīng)進(jìn)入棉花高產(chǎn)國(guó)行列[1]。雖然我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是仍有許多問(wèn)題亟待解決[2]。如干旱與鹽漬化是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要的非生物脅迫因素，影響棉花產(chǎn)量與棉纖維質(zhì)量，造成棉紡織業(yè)成本上升[3-4]。培育抗鹽堿能力強(qiáng)的棉花新種質(zhì)成為育種新目標(biāo)，而培育出這些新種質(zhì)需要以棉花生物學(xué)作為理論基礎(chǔ),以棉花功能基因組學(xué)來(lái)解析調(diào)控農(nóng)藝性狀的基因網(wǎng)絡(luò)[5]。近年來(lái)發(fā)展迅速的基因編輯技術(shù)為挖掘與檢驗(yàn)調(diào)控棉花農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因提供了新的思路，而且為創(chuàng)建新的棉花種植資源提供了新的手段[6]。研究多胺氧化酶基因?qū)μ岣呙藁鼓婺芰τ幸欢ǖ睦碚摵蛯?shí)踐意義。而CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，為研究多胺氧化酶基因提供了便捷、可靠的手段。【前人研究進(jìn)展】基因編輯技術(shù)可以改變基因組序列，定點(diǎn)編輯目標(biāo)基因，是人們驗(yàn)證特定基因功能的一種手段[7]。CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-as-sociated protein)系統(tǒng)是一種新興起的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，它是基于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)原理改造而成的一種全新的人工核酸酶系統(tǒng)，因其操作簡(jiǎn)單，編輯效率高，已被廣泛應(yīng)用于包括植物在內(nèi)的多種生物中[8]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的原理是Cas9蛋白可以在由crRNA與 tracrRNA 形成的sgRNA 的引導(dǎo)下，切割靶標(biāo)基因，形成DSBs (double-stranded DNA breaks)，通過(guò)生物體內(nèi)的NHEJ (non-homologous end joining)修復(fù)機(jī)制引起基因突變[9-10]。CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)體系中 U6 或 U3 啟動(dòng)子是驅(qū)動(dòng)sgRNA 轉(zhuǎn)錄的重要元件,最近利用擬南芥U6啟動(dòng)子在棉花(GossypiumhirsutumLinn, 陸地棉)中已成功建立了高效CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)體系[11-13]。多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)是指催化腐胺、亞精胺和精胺等多胺類(lèi)物質(zhì)氧化降解的酶類(lèi)。在研究模式植物擬南芥(Arabidopsis,thaliana) PAO基因的功能及其調(diào)控途徑的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其有5個(gè)PAO同源基因[14]，控制擬南芥的多胺代謝。在金盞花中，外源添加亞精胺可以調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶活性與脯氨酸含量，外源添加精胺可以增強(qiáng)金盞花過(guò)氧化氫酶活性，提高抗鹽能力[15]。精胺含量的上升能有效提高三葉草的抗旱能力[16]。添加外源亞精胺可以增強(qiáng)玉米對(duì)干旱脅迫的耐受性[17]。前期研究中發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)GhPAO3基因可以降低擬南芥體內(nèi)的精胺含量，從而提高擬南芥的抗鹽能力[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】所使用的表達(dá)載體為pRGEB32-7載體，可以串聯(lián)多個(gè)tRNA+靶標(biāo)+gRNA，從而提高突變效率，植物自身的RNase P和RNase Z可以分別切割tRNA的5’端和3’端，可以將多個(gè)靶標(biāo)的gRNA釋放，與目標(biāo)序列互補(bǔ)后， Cas9/ gRNA會(huì)在PAM前3 bp左右的位置精確切割靶DNA雙鏈。通過(guò)CRISPR系統(tǒng)將靶標(biāo)切斷后，生物會(huì)啟動(dòng)自身修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)后產(chǎn)生突變，導(dǎo)致目標(biāo)基因功能沉默。研究多胺氧化酶基因,提高棉花抗逆能力?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以棉花為材料，篩選合適靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)三次重疊延伸PCR與一次酶切連接后，構(gòu)建敲除GhPAO3基因的CRISPR/Cas9的載體。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

使用的CRISPR/Cas9植物基因敲除載體是pRGEB32-7(來(lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金雙俠課題組)，所用菌株為大腸桿菌E.coliDH5α，農(nóng)桿菌菌株LBA4404。

1.1.2 主要酶及試劑

Ex-Taq酶(TaKaRa 公司)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京全式金公司)、BsaⅠ(New England Biolabs公司)、Exnase Ⅱ(南京諾唯贊公司)。

1.2 方 法

1.2.1GhPAO3 基因敲除靶位引物序列設(shè)計(jì)

GhPAO3基因靶標(biāo)選擇參考了CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，通過(guò)上傳GhPAO3基因外顯子序列，搜索并選擇分?jǐn)?shù)較高的序列。選出的序列進(jìn)行Blast，確定具有特異性的序列，則選擇由該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)得到的引物。

1.2.2 小片段的擴(kuò)增與連接

設(shè)計(jì)好的引物送公司合成(北京六合華大公司)，純化級(jí)別為PAGE。通過(guò)兩次PCR得到兩個(gè)靶點(diǎn)的小片段，由于引物的5’端加入了接頭，PCR產(chǎn)物中將會(huì)帶有接頭的互補(bǔ)序列，通過(guò)第三次PCR可以將兩個(gè)小片段連接起來(lái)。PCR擴(kuò)增體系為20 μL體系，反應(yīng)條件：95℃,4 min；95 ℃，30s；55℃，30s；72℃，20s，3個(gè)循環(huán)；95℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，27個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。通過(guò)在引物的5’端加入接頭，使PCR產(chǎn)物帶有互補(bǔ)序列的接頭，通過(guò)第三次PCR使兩個(gè)獨(dú)立的PCR產(chǎn)物借助接頭經(jīng)Taq酶延伸成為融合片段。圖1,表1

圖1 重疊延伸
Fig.1 Overlapping extension
表1 第一、二次PCR體系
Table 1 First and second PCR system

20 μL體系20 μLsystem第一次PCR (μL) 第二次PCR The first PCR (μL) The second PCR (μL)ddH2OBufferdNTPSprimerASprimerEx Taq模板16.1 220.3pRGEB32-7s 0.2 GhPAO3-1as 0.2 pGTR4質(zhì)粒16.10.20.3GhPAO3-2s 0.2 GhPAO3-2as 0.21pGTR4質(zhì)粒1

注：pGTR4質(zhì)粒為中間載體質(zhì)粒，來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金雙俠教授課題組

Note: pGTR4 plasmid is an intermediate vector plasmid from Professor Jin Shuangxia of Huazhong Agricultural University

1.2.3 載體酶切與連接

取pRGEB32-7載體，使用限制性核酸內(nèi)切酶BsaⅠ進(jìn)行單酶切。100 μL酶切體系，其中pRGEB32-7載體15 μL，10x cut smart Buffer 10 μL，BsaⅠ 酶4 μL，ddH2O補(bǔ)足至100 μL。37℃酶切5.5 h，可以適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間，使反應(yīng)更充分。連接載體使用一步法，其中目的片段100 ng，線性化表達(dá)載體100 ng，Exnase Ⅱ 酶1 μL，CE Buffer 2 μL。37℃水浴30 min，冰浴5 min。連接產(chǎn)物可以-20℃長(zhǎng)期保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶點(diǎn)選擇與引物合成

根據(jù) CRISPR/Cas9 技術(shù)原理，在GhPAO3基因的外顯子上，根據(jù)CRISPR-P網(wǎng)站給出的序列，選擇一段20 bp的序列(5′-TATAATCGAATACCTCGCGT-3′)作為靶點(diǎn)。該序列3′端PAM序列為CGG，Cas9蛋白將在其上游3 bp左右精確切割靶DNA雙鏈。根據(jù)該靶點(diǎn)得到相應(yīng)引物，并在引物后添加接頭，方便后續(xù)連接實(shí)驗(yàn)。表2

表2 PCR相關(guān)引物
Table 2 PCR related primers

引物名稱(chēng)Primer name引物序列Primer sequenceGhPAO3-1asGhPAO3-1sGhPAO3-2asInfPAO3aspRGEB32-7sInfpRGEB32-7sU6-7sTATCGACACTTAAGAACtgcaccagccgggaa (靶標(biāo)1互補(bǔ)序列)GTTCTTAAAAAGTGTCGATAgtttagagctagaaata (靶標(biāo)1序列)ACGCGAGGTAT TCGATTATAtgcacagcggaat (靶標(biāo)2互補(bǔ)序列)ttctagctctaaaCACGCGAGGTATTCGATTATA (靶標(biāo)2互補(bǔ)序列)CAGCACATAACTGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAGCAGCACATAACTGGCAAACAAATGTGCCACTCCAAAGACATCAG

注：小寫(xiě)部分為載體固定序列，引物pRGEB32-7s、U6-7s與InfpRGEB32-7s為載體通用引物

Note：The lower case is the vector-fixed sequence, and the primers pRGEB32-7s, U6-7s and Inf pRGEB32-7s are the universal primers for the vector

2.2 靶位點(diǎn)片段的驗(yàn)證

以中間載體pGTR4質(zhì)粒為模板，分別以pRGEB32-7 s 、GhPAO3-1 as 和GhPAO3-2s 、GhPAO3-2 as為引物，進(jìn)行第一、二次PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，兩次PCR條帶大小分別約為150 bp與200 bp(圖2A)。以前兩次PCR產(chǎn)物為模板， InfpRGEB32-7 s與InfGhPAO3 as為上下游引物進(jìn)行第三次PCR，連接兩個(gè)小片段。PCR條件為：95℃，4 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，20 s，27個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，條帶大小約為400 bp(圖2B)。圖2

圖2 A圖是第一與第二次PCR產(chǎn)物電泳圖，條帶大小分別為100 bp與250 bpB圖是第三次PCR產(chǎn)物電泳圖，條帶大小約為400 bp
Fig.2 Figure A is the first and second PCR product electropherogram, the size of stripe is 100 bp and 250 bp respectively.Figure B is the third PCR product electropherogram,the size of stripe is about 400 bp

2.3 酶切驗(yàn)證與感受態(tài)的轉(zhuǎn)化

酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到線性pRGEB32-7載體條帶，大小約為16 kb(圖3A)。將得到的條帶進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物測(cè)濃度后用于載體連接。

取2～5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，重組后的pRGEB32-7載體帶有卡那抗性，挑取4～5個(gè)單克隆，用于PCR陽(yáng)性檢測(cè)并送菌液測(cè)序。PCR陽(yáng)性檢測(cè)使用引物為通用引物U6-7s與InfPAO3as(圖3B)。送PCR驗(yàn)證正確的菌液去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確。圖3

圖3 A圖為載體酶切電泳結(jié)果；B圖為陽(yáng)性菌液鑒定電泳
Fig.3 Figure A shows the results of vector digestion electrophoresis；Figure B is the positive bacterial solution identification electrophoresis results

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

對(duì)含有測(cè)序正確的pRGEB32-7載體的菌液提質(zhì)粒，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)，菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性后甘油保存于-80℃，用于后續(xù)棉花轉(zhuǎn)化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

3 討 論

所用的Cas9中間載體為pGTR4載體， tRNA + gRNA組合序列已經(jīng)被插入pGTR4載體中，兩個(gè)小片段可以從該載體中擴(kuò)增出來(lái)，兩個(gè)小片段連接在一起可以構(gòu)成完整的tRNA+靶標(biāo)+gRNA。因?yàn)樵诤铣梢飼r(shí)添加了接頭序列，在連接的過(guò)程中更為便捷，從而整體簡(jiǎn)化了操作過(guò)程。與新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的pCAMBⅠA1300載體相比較[19]，操作更為簡(jiǎn)單，只需要三次PCR與一次酶切連接便可構(gòu)建出敲除目標(biāo)基因的Cas9表達(dá)載體。

目前，以基因編輯為基礎(chǔ)的反向遺傳學(xué)技術(shù)是基因改造與研究的手段之一[20]。基因組編輯通過(guò)特異性結(jié)構(gòu)識(shí)別目標(biāo)基因，改造基因DNA來(lái)改變基因組中的特定基因，從而定點(diǎn)修復(fù)致病基因[21]或定點(diǎn)插入一個(gè)基因或DNA元件[22]，也可以定點(diǎn)編輯正常基因，對(duì)正?；蜻M(jìn)行敲除、結(jié)構(gòu)修飾，利用該技術(shù)研究單一基因在體內(nèi)的功能。目前常用的基因編輯技術(shù)有鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，簡(jiǎn)稱(chēng)ZFN)、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和CRISPR/Cas9。與其他兩種技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)有著脫靶率相對(duì)較低，編輯效率高的優(yōu)點(diǎn)。棉花中一直存在基因組較大，轉(zhuǎn)化比較困難等問(wèn)題，所以在基因編輯方面進(jìn)展緩慢，只有CRISPR/Cas9技術(shù)在棉花中有報(bào)道。

在研究棉花基因功能中，常用的基因沉默方法有病毒介導(dǎo)的棉花基因沉默體系(virus-induced gene silencing,VIGS)、RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)與基因編輯技術(shù)。VIGS技術(shù)屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，能使靶標(biāo)基因在mRNA水平上顯著降低，從而降低靶標(biāo)基因的表達(dá)量。RNAi技術(shù)是RNA水平的沉默，可以使靶標(biāo)基因產(chǎn)生的mRNA降解，從而使靶標(biāo)基因表達(dá)量下調(diào)。與VIGS和RNAi技術(shù)相比較， CRISPR/Cas9技術(shù)是基因組水平上的敲除，具有編輯效率高，沉默準(zhǔn)確性高，能穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)。

構(gòu)建棉花GhPAO3基因的Cas9表達(dá)載體具有較大研究?jī)r(jià)值。研究系統(tǒng)介紹了定向構(gòu)建一個(gè)編輯棉花多胺氧化相關(guān)基因GhPAO3的CRISPR/Cas9載體的方法，為研究GhPAO3基因奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為研究CRISPR/Cas9載體構(gòu)建提供參考。

4 結(jié) 論

中間載體為pGTR4，表達(dá)載體為pRGEB32-7，篩選標(biāo)記是卡那霉素篩選標(biāo)記。在GhPAO3基因序列中選出合適的靶標(biāo)，設(shè)計(jì)引物。通過(guò)三次重疊延伸PCR，構(gòu)建出tRNA+靶標(biāo)+gRNA的序列，使用限制性核酸內(nèi)切酶BsaⅠ 對(duì)表達(dá)載體pRGEB32-7進(jìn)行一次單酶切，采用一步法將構(gòu)建出的tRNA+靶標(biāo)+gRNA序列連接在線性化的表達(dá)載體pRGEB32-7上，將靶基因的靶點(diǎn)序列插入載體中，構(gòu)建出敲除棉花GhPAO3基因的Cas9表達(dá)載體。