焦慧澤, 陸世清, 侯 迪, 張前前*

(1. 欽州海關(guān)國家燕窩及營養(yǎng)保健品監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(欽州), 廣西 欽州 535000; 2. 中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 山東 青島 266100)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類人工合成的模擬天然除蟲菊素的新型殺蟲劑, 占全球殺蟲劑市場(chǎng)的20%左右[1],具有殺蟲譜廣、快速、高效等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于害蟲防治工作[2]。茶是我國的傳統(tǒng)飲品,但目前茶葉的生產(chǎn)中存在農(nóng)藥濫用現(xiàn)象,其中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥濫用尤為嚴(yán)重[3]。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的某些種類(如溴氰菊酯等)有致癌、致畸和致突變作用[4,5],因此建立茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥測(cè)定新方法具有重要意義。

目前,針對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的測(cè)定方法主要有氣相色譜-電子俘獲檢測(cè)器(GC-ECD)[6-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9,10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11-13]、薄層色譜法[14]、高效液相色譜法(HPLC)[15,16]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[17,18]等。相比較其他方法,LC-MS/MS具有不需要耗時(shí)長的程序升溫過程、不需要復(fù)雜的衍生化處理、假陽性率低、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì),符合當(dāng)前檢測(cè)要求的快速、準(zhǔn)確、高效原則。目前尚未見LC-MS/MS測(cè)定茶葉中氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的報(bào)道。

加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction, ASE)在萃取過程中對(duì)萃取溶劑加壓,使其在高于沸點(diǎn)溫度時(shí)仍可保持液態(tài),而液體的溶解能力遠(yuǎn)大于氣體的溶解能力,同時(shí)提高的溫度也能有效降低目標(biāo)物分子與基質(zhì)間的作用力[19],因此該方法有有機(jī)溶劑用量少、快速、基質(zhì)影響小、萃取效率高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本文將ASE與LC-MS/MS有機(jī)結(jié)合,優(yōu)化了萃取、凈化過程及色譜-質(zhì)譜條件參數(shù),可快速、準(zhǔn)確、高效地測(cè)定茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-8040超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配電噴霧離子源(ESI)(日本Shimadzu公司), APLE-2000加速溶劑萃取儀(北京吉天儀器有限公司), KQ-700DE超聲波清洗器(昆山舒美公司), JHD-12A全自動(dòng)氮吹儀(上海極恒公司), HSC-12B水浴氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司), T18 digital Ultra-Turrax均質(zhì)器和MS3 digital渦旋振蕩器(德國IKA公司),高速離心機(jī)(H1850,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司), Arium comfort Ⅰ超純水裝置(德國Sartorius)。

生物芐呋菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L)均購于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司,GCB/NH2固相萃取柱(500 mg/500 mg, 6 mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司), Florisil固相萃取柱(1 g, 6 mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司),乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷(色譜純,德國Merck公司),甲酸(色譜純,上海麥克林生化科技有限公司),氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純,廣東光華科技股份有限公司)在500 ℃馬弗爐中灼燒4 h后置于干燥器中冷卻至室溫備用,乙酸銨(分析純,廣東光華科技股份有限公司)。

1.2 樣品前處理

1.2.1ASE萃取

準(zhǔn)確稱取5 g已粉碎的茶葉樣品(精確至0.01 g),上加速溶劑萃取儀,移入已加入2 g硅藻土的34 mL萃取池中,再覆蓋1 g硅藻土。萃取溫度80 ℃,萃取壓力10.34 MPa(1 500 psi),加熱5 min,以正己烷-丙酮(2∶1, v/v)為溶劑靜態(tài)萃取5 min,沖洗體積為60%萃取池體積,60 s氮?dú)獯祾?循環(huán)一次,萃取完成。收集提取液,于全自動(dòng)氮吹儀中在40 ℃氮吹濃縮至小于3 mL,加入少量正己烷溶解壁上殘?jiān)?待凈化。

1.2.2固相萃取凈化

取GCB/NH2+Florisil串聯(lián)柱,在GCB/NH2柱上方裝約1 cm高的無水硫酸鈉,并依次用5 mL正己烷-丙酮(9∶1, v/v)活化、5 mL正己烷平衡。將待凈化液移入活化后的小柱,用10 mL正己烷-丙酮(9∶1, v/v)溶液分兩次洗脫,收集洗脫液,置于40 ℃水浴中氮吹近干,用1 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?過0.22 μm濾膜后待上機(jī)。

1.3 色譜、質(zhì)譜條件

1.3.1液相色譜條件

色譜柱:Shim-pack GIST C18柱(50 mm×2.1 mm, 2 μm);流動(dòng)相:A為5 mmol/L乙酸銨+0.1%(v/v)甲酸水;B為甲醇;梯度洗脫條件:0～2 min, 20%A; 2～3.5 min, 20%A～10%A; 3.5～7 min, 10%A; 7～8 min, 10%A～20%A; 8～10 min, 20%A。柱溫:40 ℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI;掃描方式:正離子掃描;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:15 L/min; 去溶劑管溫度:250 ℃;加熱塊溫度:400 ℃;檢測(cè)器電壓:1.74 kV;噴嘴電壓:4.5 kV;碰撞室氣體壓力:230 kPa;檢測(cè)模式:MRM。其他質(zhì)譜參數(shù)(母離子、子離子、Q1預(yù)偏置電壓、碰撞能量、Q3預(yù)偏置電壓)見表1。

表 1 10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)

CE: collision energy; * quantitative ion.

2 結(jié)果和討論

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了以甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相時(shí),ESI源正、負(fù)模式下10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的響應(yīng),實(shí)驗(yàn)表明,ESI+下10種農(nóng)藥的響應(yīng)明顯優(yōu)于ESI-,因此選用ESI+對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行測(cè)定。

流動(dòng)相組成對(duì)LC-MS/MS的檢測(cè)影響較大,在對(duì)流動(dòng)相為甲醇-水和乙腈-水的一級(jí)質(zhì)譜的解析中發(fā)現(xiàn),除生物芐呋菊酯、氟胺氰菊酯和甲氰菊酯有豐度較高的[M+H]+外,其余7種農(nóng)藥的加和離子主要為[M+NH4]+和[M+Na]+,且[M+Na]+豐度最高,但以[M+Na]+為母離子時(shí),無法得到穩(wěn)定且豐度較高的子離子,因此考慮在水相中添加乙酸銨和甲酸以增強(qiáng)[M+H]+和[M+NH4]+的豐度以用于定量分析。向水相中添加一定乙酸銨至5 mmol/L和甲酸(0.1%, v/v),發(fā)現(xiàn)在加入乙酸銨或甲酸后,相對(duì)應(yīng)的[M+H]+以及[M+NH4]+的豐度均較未加入時(shí)有顯著提高,比較了有機(jī)相分別為甲醇和乙腈時(shí)的加和物離子信號(hào)響應(yīng),結(jié)果表明應(yīng)用甲醇時(shí)的離子化效率優(yōu)于乙腈。比較了有機(jī)相為甲醇,水相分別為5 mmol/L乙酸銨、0.1%(v/v)甲酸、5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸、10 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸時(shí),各化合物加和離子的豐度以及信號(hào)響應(yīng),試驗(yàn)得出水相為5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸時(shí)其離子化效率最高;同時(shí)優(yōu)化了該流動(dòng)相條件下的梯度洗脫程序,優(yōu)化后的色譜條件見1.3.1節(jié)。

在優(yōu)化好的色譜條件下對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的子離子、四極桿預(yù)偏置電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化。選擇信號(hào)強(qiáng)度高、響應(yīng)穩(wěn)定、質(zhì)荷比較大的2個(gè)碎片離子作為子離子。在MRM模式下針對(duì)四極桿預(yù)偏置電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化,試驗(yàn)表明,Q1預(yù)偏置電壓、Q3預(yù)偏置電壓、CE分別在10～22 V、13～29 V、11～39 V范圍內(nèi),質(zhì)譜對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值最優(yōu)。最終優(yōu)化結(jié)果見表1,優(yōu)化條件下的色譜圖見圖1。

圖 1 加標(biāo)綠茶中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的提取離子流色譜圖(0.1 mg/kg)Fig. 1 Extracted ion current (EIC) chromatograms of the 10 pyrethroid pesticides spiked in green tea (0.1 mg/kg) 1. flucythrinate; 2. fenpropathrin; 3. cyfluthrin; 4. cyhalothrin; 5. deltamethrin; 6. fenvalerate; 7. tau-fluvalinate; 8. bioresmethrin; 9. permethrin; 10. bifenthrin. Bule peak: quantitative ion; red peak: qualitative ion.

2.2 提取方式的選擇

目前針對(duì)茶葉中農(nóng)藥殘留提取的傳統(tǒng)方法主要有振蕩、超聲及勻漿等,與這些方法相比,ASE具有有機(jī)溶劑用量少、操作簡單、耗時(shí)短、效率高等特點(diǎn)。因未尋得含有全部10種農(nóng)藥的陽性樣品,所以選取了一個(gè)含有聯(lián)苯菊酯的紅茶樣品及一個(gè)含有溴氰菊酯的綠茶樣品,比較了4種提取方式的檢測(cè)結(jié)果。振蕩提取條件[20]:稱取1 g已粉碎茶樣,加入5.0 mL乙腈后旋渦振蕩混合2 min,靜置10 min后再旋渦振蕩混合2 min,離心3 min(5 000 r/min),將殘?jiān)貜?fù)提取一次。超聲提取條件[21]:稱取5 g已粉碎茶樣,加入20 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1, v/v)溶液,旋渦1 min,超聲20 min后離心10 min(5 000 r/min),將殘?jiān)貜?fù)提取兩次。勻漿提取條件[22]:稱取2 g已粉碎茶樣,加入2 g氯化鈉和10 mL乙腈溶液,在高速組織搗碎機(jī)上以15 000 r/min均質(zhì)提取1 min后離心5 min(4 000 r/min),將殘?jiān)貜?fù)提取2次(ASE提取條件見1.2.1節(jié))。4種提取結(jié)果見圖2, 4種提取方法中勻漿及ASE的提取效率較高,而ASE相比較勻漿操作更簡便、耗時(shí)更短且可以多通道多樣品同時(shí)處理,更符合實(shí)際檢測(cè)需要,因此本試驗(yàn)選用ASE提取。

圖 2 不同提取方式下陽性樣品中聯(lián)苯菊酯、溴氰菊酯的含量Fig. 2 Measured bifenthrin and deltamethrin contents in positive samples using different extraction methods

2.3 ASE萃取條件的優(yōu)化

2.3.1萃取溶劑的優(yōu)化

研究了不同體積比(4∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, v/v)的正己烷-丙酮作萃取溶劑時(shí)10種農(nóng)藥的回收率,發(fā)現(xiàn)萃取溶劑中丙酮含量增加時(shí),回收率也相應(yīng)有所增高,但當(dāng)丙酮含量高于50%之后,萃取液中雜質(zhì)含量較高,在濃縮后會(huì)有較多黏稠雜質(zhì)堵塞SPE柱,導(dǎo)致洗脫溶劑難以通過小柱。而從表2中也可以看出,當(dāng)體積比為2∶1時(shí),回收率在81.7%～93.6%之間,與1∶1、1∶2時(shí)相差不大,同時(shí)萃取液中雜質(zhì)含量較少,因此選擇正己烷-丙酮(2∶1, v/v)為萃取溶劑。

表 2 采用不同體積比正己烷-丙酮混合溶劑萃取時(shí)農(nóng)藥的回收率(n=3)

2.3.2萃取時(shí)間及萃取溫度的優(yōu)化

以正己烷-丙酮(2∶1, v/v)為萃取溶劑,比較了不同萃取時(shí)間(5、10、15 min)和萃取溫度(60、80、100、120 ℃)下農(nóng)藥的回收率。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),萃取時(shí)間對(duì)回收率無明顯影響,為保證檢測(cè)效率,選擇萃取時(shí)間為5 min;而萃取溫度大于80 ℃時(shí),回收率再無明顯變化,因此在能滿足萃取效果的前提下,設(shè)定ASE萃取溫度為80 ℃。

2.4 固相萃取凈化

茶葉中含有大量的色素、多糖等干擾成分,GCB/NH2柱可有效吸附去除色素、有機(jī)酸及糖分,而Florisil柱可以強(qiáng)吸附含電負(fù)性雜原子的極性干擾物,因此本實(shí)驗(yàn)采用GCB/NH2+Florisil串聯(lián)柱凈化。

GCB/NH2柱和Florisil柱均為正相填料的固相萃取小柱,因此正己烷等非極性溶劑洗脫效果較差,而加入二氯甲烷、丙酮等溶劑會(huì)增強(qiáng)其洗脫效果。取4份空白樣品待凈化樣液,各加入10種擬除蟲菊酯類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)75 ng,以10 mL溶劑分兩次洗脫,考察洗脫液分別為正己烷-二氯甲烷(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)、正己烷-丙酮(8∶2, v/v)時(shí)定容至1 mL的回收率,發(fā)現(xiàn)洗脫液為正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(8∶2, v/v)時(shí)的回收率較好,而正己烷-丙酮(9∶1, v/v)洗脫液中殘留雜質(zhì)量較少,因此選擇正己烷-丙酮(9∶1, v/v)溶液洗脫。

2.5 檢出限、定量限及線性范圍

以初始流動(dòng)相配制了質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50、100、200、400和1 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3節(jié)中的色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行分析,以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X,μg/L)進(jìn)行最小二乘法線性回歸分析,其中氯氟氰菊酯及氯菊酯因有同分異構(gòu)體出現(xiàn)兩個(gè)峰,采用峰面積加和值為Y值,判斷各組分的線性范圍?；貧w方程的方差分析結(jié)果表明,F>F0.05(1, 8),p在2.6×10-16～2.1×10-9之間,即各組分峰面積與質(zhì)量濃度的線性相關(guān)關(guān)系顯著。具體各組分的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)列于表3,相關(guān)系數(shù)均在0.999 5以上。

本方法的檢出限(LOD)、定量限(LOQ)分別根據(jù)3倍、10倍信噪比(S/N)計(jì)算得出,并換算成樣品中的目標(biāo)物含量見表3。10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢出限和定量限分別在0.5～5.0 μg/kg和1.6～16.6 μg/kg之間,遠(yuǎn)低于歐盟、日本及我國規(guī)定的最大殘留限量要求,符合實(shí)際檢測(cè)需要。

表 3 10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.6 方法的回收率和精密度

選取了空白綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶樣品作為基質(zhì),分別在定量限、0.4 mg/kg以及最高殘留限量(maximum residue limit, MRL)[23](無MRL的加入1 mg/kg)共3個(gè)水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn),每種樣品在每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定7次,具體結(jié)果見表4。試驗(yàn)測(cè)得回收率為68.7%～103.8%, RSD為0.8%～13.2%,符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

表 4 10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在4種基質(zhì)中3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)

表 4 (續(xù))

圖 3 空白紅茶樣品和陽性紅茶樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of a blank black tea sample and a positive black tea sample

2.7 實(shí)際樣品測(cè)試

利用本文方法測(cè)定了從市場(chǎng)采集的共27份實(shí)際樣品。圖3為空白樣品和陽性樣品的MRM色譜圖,這一陽性樣品中聯(lián)苯菊酯的含量為2.76 μg/kg。在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),8份綠茶檢出聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯和溴氰菊酯,5份紅茶檢出氯氟氰菊酯和聯(lián)苯菊酯,檢出率高達(dá)48%,說明茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留問題需重視。

3 結(jié)論

本研究建立了ASE-UPLC-MS/MS測(cè)定茶葉中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法。與傳統(tǒng)方法相比,本方法減少了有機(jī)溶劑用量、縮短了檢測(cè)周期、提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性,方法的回收率、精密度滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)需要,檢出限、定量限能滿足歐盟、美國、日本及我國的限量要求。本研究為茶葉中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的進(jìn)出口檢驗(yàn)、國內(nèi)市場(chǎng)監(jiān)管提供了更為環(huán)保、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)手段。