唐吉旺, 袁列江, 肖 泳, 王 秀, 王淑霞

(1. 湖南省產商品質量監(jiān)督檢驗研究院, 湖南 長沙 410007; 2. 中南大學化學化工學院, 湖南 長沙 410083)

甜味劑是賦予食品甜味的功能性食品添加劑。甜味劑可分為天然和合成兩大類。由于合成甜味劑不能在人體內代謝,也不能提供或只能提供很少的卡路里,它們也被稱為非營養(yǎng)性甜味劑。其甜度是蔗糖的幾十倍甚至上萬倍。近年來,非營養(yǎng)性合成甜味劑的消費增加已成為全球趨勢[1]。安賽蜜(acesulfame-K, ACS-K)、糖精鈉(saccharin sodium, SAC)、甜蜜素(cyclamate, CYC)、三氯蔗糖(sucralose, SCL)、阿斯巴甜(aspartame, ASP)、阿力甜(alitame, ALI)、紐甜(neotame, NEO)、甘素(kulcin, DUL)及新橙皮甙二氫查爾酮(neohesperidin dihydrochalcone, NHDC)等人工合成甜味劑在食品工業(yè)中倍受歡迎,主要用于生產無糖低熱食品,甚至在藥品和衛(wèi)生產品中也有使用人造甜味劑的報道[2]。據報道,攝入高劑量的合成甜味劑可能對健康有害,導致一系列不良反應,如皮膚病變、頭痛、呼吸困難等[3]。然而,食品生產過程中還普遍存在甜味劑濫用、違禁使用的現象,食品中多種甜味劑復配使用的情況比較普遍。因此,建立一種具有高通量、高準確度、高靈敏度的甜味劑檢測方法,加強高強度甜味劑的監(jiān)管就顯得尤為重要。

目前,甜味劑的分析方法主要有液相色譜法[4-6]、薄層色譜法[7]、離子色譜法[8]、毛細管電泳法[9]、電化學方法[10]及光譜分析方法[11]等,主要以液相色譜法為主。由于不同甜味劑的物理化學性質、電化學性質和光譜性質存在顯著差異,以上方法在測定多種甜味劑混合物時均存在一定的缺陷,一般只能分析一種甜味劑或簡單的幾種甜味劑混合物。近年來,液相色譜-串聯質譜技術由于具有檢測通量大、準確、靈敏的特點,被廣泛用于食品領域的檢測,運用該技術同時分析多種甜味劑已經成為一種趨勢[12-20]。然而,已報道的質譜檢測方法大多數針對簡單的食品樣品基質,如白酒、葡萄酒等,或存在缺乏樣品凈化步驟、凈化方式較為粗劣等問題。在分析基質復雜的樣品時,樣品本身所帶來的基質效應(ME)給質譜分析帶來很大的挑戰(zhàn)。為了降低基質效應的影響,文獻[21,22]報道比較多的方法是采用基質匹配標準曲線法。然而,該法存在較大的缺陷。一是很難找到對應的空白基質樣品,二是實驗操作也比較麻煩。因此,很有必要采用有效的凈化方式對復雜基質樣品提取溶液進行凈化處理,此外還可以采取內標法,進一步降低或消除樣品基質效應,以確保分析結果的可靠性及準確性。

本文研究建立了固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯質譜法,結合內標法定量,同時測定含乳飲料、糕點及調味品等復雜食品基質中9種高強度甜味劑。復雜基質樣品經固相萃取凈化處理后,基本上排除了基質效應的影響,提升了高效液相色譜-串聯質譜法檢測結果的穩(wěn)健性及可靠性。該方法簡單、快捷、準確可靠,在確保檢測結果質量的同時,也在很大程度上提高了檢測效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Altus A-30h超高效液相色譜儀(珀金埃爾默公司); QTRAP 5500質譜儀,配電噴霧離子(ESI)源(美國SCIEX公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); PEP固相萃取柱(規(guī)格為200 mg、6 mL)(天津博納艾杰爾科技有限公司);超聲儀(上海易凈超聲波儀器有限公司);試管振蕩器(美國Tbboy); Allegra 64R離心機(美國貝克曼公司)。

甲醇(HPLC級,德國默克公司);三乙胺(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);甲酸(色譜純,上海安譜科學儀器有限公司);甲酸銨(色譜純,國藥集團化學試劑有限公司);安賽蜜(99.0%, CAS號:33665-90-6)、糖精鈉(99.9%, CAS號:128-44-9)、甜蜜素(98.9%, CAS號:139-05-9)、三氯蔗糖(99.0%, CAS號:56038-13-2)、阿斯巴甜(97.2%, CAS號:22839-47-0)、阿力甜(98.0%, CAS號:80863-62-3)、紐甜(99.4%, CAS號:165450-17-9)、甘素(98.0%, CAS號:150-69-6)、新橙皮甙二氫查爾酮(98.2%, CAS號:20702-77-6)及內標華法林鈉(warfarin sodium) (98.0%, CAS: 129-06-6)等均購于上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 緩沖提取溶液的配制

將0.8 mL甲酸加入1 L水中,然后在攪拌的狀態(tài)下用約為2.5 mL三乙胺調pH值至4.5,配制成三乙胺緩沖溶液。

1.3 標準溶液的配制

分別稱取10.0 mg安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、甘素及新橙皮甙二氫查爾酮標準品,用水溶解并定容至10.0 mL,配制成質量濃度均為1.0 g/L的單標儲備液,于4 ℃冰箱中保存。

稱取華法林鈉10.0 mg于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成1.0 g/L內標儲備液;用移液器分別準確移取100 μL單標儲備液于10 mL容量瓶中,用甲醇-水(4∶6, v/v)稀釋并定容至刻度,配制成質量濃度為10.0 mg/L的混合標準中間液;用同樣的方法配制質量濃度為10.0 mg/L的內標中間溶液,然后繼續(xù)用甲醇-水(4∶6, v/v)稀釋成質量濃度為1.0 mg/L的內標使用液;最后,移取不同體積的混合標準中間液,用甲醇-水(4∶6, v/v)配制成一系列不同質量濃度的混合標準工作液,內標的質量濃度均為10 μg/L,現用現配。

1.4 樣品處理

1.4.1樣品提取

稱取2 g(精確至0.001 g)經粉碎均勻的固體樣品(糕點、蜜餞、果凍等)或混勻的液體樣品(含乳飲料、液體調味品等)于50 mL具蓋塑料離心管中,加入30 mL三乙胺緩沖溶液,渦旋振蕩5 min;如果是固體樣品還需超聲提取10 min,以便充分提取目標物。然后用三乙胺緩沖溶液定容至50 mL,混合均勻,備用。如果樣品中甜味劑含量過高,可進一步稀釋,使樣品溶液中甜味劑濃度在標準曲線范圍內。

1.4.2樣品凈化

首先固相萃取柱分別用6 mL甲醇和6 mL水活化,然后準確移取以上提取溶液2.0 mL于固相萃取柱上。待樣品溶液滴完后,加入3 mL三乙胺緩沖溶液淋洗柱子,將柱子抽干,最后用4 mL甲醇洗脫,洗脫液用10 mL刻度試管接收起來,準確加入100 μL內標使用液,用水定容至10 mL刻度,混勻,經0.22 μm濾膜過濾后供高效液相色譜-串聯質譜檢測。

1.5 儀器條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:Phenomenex Knietex?F5(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);流動相A為:5 mmol/L甲酸銨溶液,含0.1%(v/v)甲酸;流動相B為甲醇;梯度洗脫程序見表1;流速為0.4 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

表 1 流動相梯度洗脫程序

Mobile phase A: 5 mmol/L ammonium formate containing 0.1% (v/v) formic acid; mobile phase B: methanol.

1.5.2質譜條件

離子源:ESI;根據被測化合物在正、負離子掃描模式下響應靈敏度的大小,選擇正離子掃描方式或負離子掃描方式;采用MRM模式。質譜采用正、負離子掃描時,噴霧電壓分別為5.5 kV和4.5 kV;離子源溫度為500 ℃;氣簾氣壓力:0.24 MPa;噴霧氣(Gas 1)和輔助加熱氣(Gas 2)流速均為55 μL/min。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

首先采用針泵流動注射連續(xù)進樣的方式進行質譜全掃描檢測,得出被測化合物一級質譜圖,找出每個化合物對應的母離子。然后進行二級質譜掃描,得到相應的子離子。每個化合物找出兩對特征離子,分別進行碰撞能量及去簇電壓優(yōu)化,最后得到了安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、甘素及新橙皮甙二氫查爾酮9種甜味劑及內標華法林鈉的最優(yōu)質譜參數,如表2所示。安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、新橙皮甙二氫查爾酮及內標華法林鈉在負離子模式下有很好的響應,故采用負離子[M-H]-作為這些化合物的母離子;甘素在正離子模式下有較強的[M+H]+離子峰,但沒有[M-H]-離子峰,故采用正離子模式掃描。質譜具有正負離子切換監(jiān)測功能,可在同一針樣品運行中同時進行正負離子掃描。

表 2 9種人工合成甜味劑及內標(IS)的多反應監(jiān)測參數

* Quantification ion.

圖 1 MRM模式下9種人工合成甜味劑及內標的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the nine artificial sweeteners and the internal standard under MRM mode Artificial sweeteners: 100 μg/L; IS: 10 μg/L. Peak identifications: 1. acesulfme-K; 2. cyclamate; 3. saccharin sodium; 4. suralose; 5. aspartame; 6. dulcin; 7. alitame; 8. neohesperidin dihydrochalcone; 9. neotame; 10. IS.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇:選用規(guī)格相同的Venusi?AS-T C18、Hypersil GOLD及Phenomenex Knietex?F5等幾款色譜柱進行測試。結果表明,9種甜味劑及內標在Phenomenex Knietex?F5柱上具有較好的峰形、響應及分離度。

流動相的優(yōu)化:對比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水、甲醇-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)、乙腈-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)、甲醇-5 mmol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)乙酸)及乙腈-5 mmol/L乙酸銨(含0.1%(v/v)乙酸)等不同流動相體系下的色譜圖強度、峰形及分離效果。結果表明,在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水流動相體系中,極性較強的安賽蜜、糖精鈉及甜蜜素峰形較寬、分離度較差;在相同的梯度洗脫條件下,加入銨鹽緩沖溶液后,安賽蜜、糖精鈉及甜蜜素的峰形明顯改善,同時所有甜味劑的分離度得到提高;在甲醇-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸為)流動相的梯度洗脫程序下,所得到的色譜圖峰形最好、響應強度較高,同時分離效果最好;在乙酸銨體系中,各種甜味劑的響應強度沒有在甲酸銨體系中的高,這可能由于乙酸根離子強度過高使背景噪聲過高,降低了信噪比。本研究為了避免較高濃度的緩沖鹽體系對質譜的影響,在滿足要求的情況下選用5 mmol/L甲酸銨緩沖鹽體系。因此,最終確定甲醇-5 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)為流動相。在優(yōu)化的色譜和質譜條件下,9種人工合成甜味劑及內標的總離子流色譜圖見圖1(9種甜味劑的質量濃度均為100 μg/L,內標的質量濃度為10 μg/L)。

2.3 基質效應的評估

許多食品基質比較復雜,含有各種有機物(脂類、碳水化合物、蛋白質、維生素、染料、防腐劑等)和無機成分(礦物質)。所有這些物質都能干擾目標物的檢測,引起信號抑制或增強,嚴重影響高效液相色譜-串聯質譜分析結果的準確性和精密度。為了考察本方法在去除基質效應方面的效果,按照Matuszewski等[23]報道的方法對其進行基質效應評估。首先選擇不同基質且不含甜味劑的空白樣品,按照1.3節(jié)樣品處理步驟進行處理,然后在經固相萃取柱凈化的樣品溶液中加入9種甜味劑混合標準溶液,配制成混合樣品基質標準溶液。此外,用甲醇-水(4∶6, v/v)配制同樣質量濃度的混合標準溶液。最后用高效液相色譜-串聯質譜分析以上兩種標準溶液,并按照式(1)計算ME:

ME=B/A×100%

(1)

表 4 9種甜味劑的回歸方程、線性范圍、相關系數(r2)、檢出限及定量限

y: the ratio of peak areas of the analyte to the internal standard;x: the ratio of mass concentrations of the analyte to the internal standard.

其中,ME表示基質效應的大小,大于100%時為基質增強效應,小于100%時為基質抑制效應;A、B分別為待測標物在樣品溶液和純溶劑中的峰面積。9種人工合成甜味劑在糕點、甜面醬及含乳飲料3種樣品基質中的基質效應測定結果見表3。結果表明,甜面醬的基質效應(ME值在90.1%～106.3%之間)比糕點及含乳飲料的基質效應(ME值在92.6%～103.1%之間)更強;其中安賽蜜、甜蜜素、阿力甜及紐甜在3種基質中表現出基質增強效應,糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、新橙皮甙二氫查爾酮及甘素在3種基質中均表現出基質抑制效應。但是所有的基質效應都比較弱(ME值在90%～110%之間),說明PEP固相萃取柱凈化效果良好,有效地去除了樣品基質效應的干擾。PEP固相萃取柱(填料和使用效果相當于Oasis HLB固相萃取柱)內裝有親水親脂平衡填料,含有特定比例的親水基和疏水基,對不同極性的酸性、中性和堿性化合物均有良好的回收率,特別適合復雜樣品基質的處理。本方法還采用華法林鈉作為內標,進一步降低了樣品基質效應的影響,提高了方法的準確度和精密度。

表 3 9種人工合成甜味劑在不同基質中的基質效應

2.4 方法學驗證

2.4.1方法的線性范圍、檢出限及定量限

采用內標法進行定量,以甜味劑系列標準溶液的峰面積與內標華法林鈉的峰面積比值y為縱坐標,其質量濃度的比值x為橫坐標,繪制內標法標準曲線,并進行線性擬合,計算線性回歸方程。如表4所示,9種甜味劑在各自的線性范圍內線性關系良好,線性相關系數均大于0.999。在空白基質中分別添加甜味劑目標組分,以MRM定量離子的3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限、S/N=10確定定量限。如表4所示,9種甜味劑的檢出限和定量限分別在2～30 μg/L和6～100 μg/L之間。

2.4.2方法的準確度和精密度

為了考察方法在復雜基質樣品中的適用性,選擇糕點、甜面醬及含乳飲料等基質較為復雜的空白樣品(固體、半固體或液體),進行3個水平的添加回收試驗,每個水平重復測定6次,以評價該方法的準確度和精密度。所得到的平均回收率及相對標準偏差(RSD)如表5所示。在糕點、甜面醬及含乳飲料3種不同基質中,9種人工合成甜味劑的平均回收率在86.3%～106.3%之間,RSD在1.2%～5.9%之間,均符合食品理化標準《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》(GB/T 27404-2008)要求。

表 5 食品中9種人工合成甜味劑的添加回收率及相對標準偏差(n=6)

2.5 實際樣品的測定

運用本文建立的方法對不同類型的市售食品(糕點、含乳飲料、調味品等)中的人工合成甜味劑進行測定。為了與國家標準進行方法比對,其中的三氯蔗糖和甜蜜素還另外分別按照食品安全國家標準《食品中三氯蔗糖的測定》(GB/T 22255-2008)和《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》(GB 5009.97-2016)進行測定。糕點中主要有安賽蜜檢出,含量一般在0.3 g/kg以內,其他甜味劑很少檢出。在含乳飲料中,三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、安賽蜜及甜蜜素檢出率比較高,大多數含乳飲料中含有其中的兩種或三種甜味劑,含量一般在0.004～0.1 g/kg之間。其中一個含乳飲料按照三氯蔗糖的國家標準方法和本方法檢測,結果分別為0.063 g/kg和0.067 g/kg;按照甜蜜素的國家標準方法和本方法的檢測,結果分別為0.12 g/kg和0.13 g/kg;相比之下,測定結果的絕對差值均未超過算術平均值的10%。在調味品(如醬油)中,主要有三氯蔗糖、甜蜜素及糖精鈉檢出,但檢出率不是很高,一般低于5%,含量一般低于0.02 g/kg。

3 結論

本文以三乙胺緩沖溶液為提取溶劑對食品中9種人工合成高強度甜味劑進行提取,采用親水親脂平衡填料的固相萃取柱對樣品提取溶液進行凈化,結合高效液相色譜-串聯質譜技術及內標法進行測定,實現了準確、高效及高通量檢測復雜食品基質中多種人工合成甜味劑的目的。運用于實際樣品的檢測,取得了令人滿意的效果,為食品中甜味劑的篩查和檢測提供了良好的技術方法。