劉振東, 高 鐵, 徐玲麗, 楊 勇, 王慶民*, 陳泓序*

(1. CE & Biopharma, Sciex, 北京 100015; 2. 齊魯制藥有限公司藥物研究院, 山東 濟(jì)南 250100)

十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管電泳法(sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis, CE-SDS)作為當(dāng)前單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)純度檢測(cè)的主要方法,已經(jīng)收錄到《中國(guó)藥典》2015版中,并在單抗藥物的質(zhì)量研究及放行檢測(cè)中用于純度分析。藥典中要求對(duì)單抗藥物的還原(reduced, r)和非還原(non-reduced, nr)樣品進(jìn)行分別檢測(cè),匯報(bào)兩種純度結(jié)果[1]。還原和非還原單抗純度分析的差別在于樣品前處理[2,3]。兩種分析方法中樣品均需要與十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)絡(luò)合,但還原單抗純度分析時(shí)需要使用巰基乙醇等還原劑將單抗結(jié)構(gòu)中的二硫鍵斷裂,形成輕鏈和重鏈。而非還原單抗純度分析則需要保持二硫鍵穩(wěn)定不斷裂,故需加入巰基封閉劑對(duì)裸露的巰基進(jìn)行封閉[4],防止游離巰基介導(dǎo)的鏈間二硫鍵斷裂而產(chǎn)生碎片。

目前大部分生物藥生產(chǎn)企業(yè)均采用CE-SDS純度分析試劑盒(Sciex公司)中的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行前處理[5],即還原和非還原單抗分析均采用0.1 mol/L Tris-HCl+1%SDS (pH 9.0)溶液作為樣品緩沖液對(duì)免疫球蛋白G(IgG)進(jìn)行還原和非還原處理以及與SDS的絡(luò)合[6]。而對(duì)于非還原單抗純度分析,使用現(xiàn)有的樣品緩沖液(pH 9.0)時(shí),單抗樣品在處理過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生抗體鏈間二硫鍵斷裂而產(chǎn)生非預(yù)期的降解片段,如輕鏈(light chain, LC)、重鏈(heavy chain, HC)、重輕鏈(heavy chain-light chain, HL)、重重鏈(heavy chain-heavy chain, HH)、重重輕鏈(heavy chain-heavy chain-light chain, HHL)[7]。影響非還原單抗藥物純度分析的準(zhǔn)確性,使純度測(cè)定結(jié)果偏低。

為了保證非還原單克隆抗體CE-SDS純度分析的客觀和準(zhǔn)確性,我們對(duì)非還原單抗CE-SDS純度分析的樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn):這些非預(yù)期的降解主要來(lái)源于巰基封閉劑的效果不佳,使單抗分子鏈間發(fā)生了二硫鍵斷裂而產(chǎn)生了額外的降解片段。通過(guò)對(duì)碘乙酰胺(iodoacetamide, IAM)和N-乙基馬來(lái)酰亞胺(N-ethylmaleimide, NEM)兩種常用巰基封閉劑作用機(jī)理的研究,我們發(fā)現(xiàn)上述兩種巰基封閉劑均產(chǎn)生如下效果:樣品緩沖液的pH會(huì)影響封閉反應(yīng),進(jìn)而影響抗體的降解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及樣品

毛細(xì)管電泳儀(PA800 Plus生物制藥分析系統(tǒng),Sciex公司);電熱恒溫水槽(DK-8,上海森信實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司);分析天平(AL104, Mettler Toledo公司);離心機(jī)(Biofuge, Thermo公司)。

IgG純度分析試劑盒(A10663, Sciex公司):包含SDS凝膠緩沖液、樣品緩沖液(pH 9.0)、熔融石英毛細(xì)管、0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH; IAM (A14715, Alta Aesar公司); NEM (N808609-5g, Macklin公司);磷酸氫二鈉(Na2HPO4, 20040618,國(guó)藥化學(xué)試劑公司);檸檬酸(102120170303,湖南爾康公司);十二烷基硫酸鈉(0227-100G, Amresco公司);二次去離子水(Millipore公司)。

mAb A(IgG1)、mAb B(IgG2)、mAb C(IgG1)、mAb 1(IgG1)、mAb 2(IgG1片斷)、mAb 3(IgG1)、mAb 4(IgG2)、mAb 5(IgG4)、mAb 6(IgG2)、mAb 7(IgG1)樣品及其不同批次樣品均由齊魯制藥有限公司藥物研究院生物技術(shù)研究所制備。

1.2 溶液配制

1.2.1樣品緩沖液

pH 9.0樣品緩沖液:0.1 mol/L Tris-HCl+1%SDS(取自Sciex IgG純度分析試劑盒)。pH 6.0、7.0、8.0樣品緩沖液:20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸+1%SDS(不同pH由1 mol/L NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié))。

1.2.2巰基封閉劑

用二次去離子水分別配制1 mol/L IAM和0.1 mol/L NEM,需在實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3非還原CE-SDS樣品前處理

取不同pH的樣品緩沖液,加入2 μL 1 mol/L的IAM或5 μL 0.1 mol/L的NEM,再加入100 μg的樣品,使其終體積為100 μL,其中IAM的終濃度為0.02 mol/L, NEM的終濃度為0.005 mol/L。70 ℃溫浴10 min,冷卻,10 000 r/min離心5 min。需在毛細(xì)管電泳進(jìn)樣前現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4毛細(xì)管電泳條件

毛細(xì)管:20/30 cm(有效/總長(zhǎng)度),內(nèi)徑50 μm;毛細(xì)管溫度:25 ℃;樣品儲(chǔ)存溫度:25 ℃;進(jìn)樣:-10 kV, 20 s;分離電壓:-15 kV,分離時(shí)間:35 min;檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器,220 nm。

1.5毛細(xì)管電泳沖洗條件

新更換毛細(xì)管使用0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、二次去離子水、SDS凝膠緩沖液分別在0.5 MPa條件下沖洗10 min,再進(jìn)行-15 kV電壓平衡10 min;針間沖洗為0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、二次去離子水分別在0.5 MPa下沖洗3 min, SDS凝膠緩沖液0.5 MPa沖洗10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品緩沖液pH對(duì)非還原單抗純度分析的影響

非還原單抗前處理時(shí)使用巰基封閉劑來(lái)封閉游離的巰基,防止游離巰基介導(dǎo)的鏈間二硫鍵斷裂而產(chǎn)生碎片[8,9]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,兩種常用的巰基封閉劑IAM和NEM的最佳封閉條件均在pH 6.0～7.0[10,11],而現(xiàn)有商品化試劑盒中的樣品緩沖液pH為9.0。因此我們考察了不同pH (pH 6.0、7.0、8.0、9.0)的樣品緩沖液的封閉效果,對(duì)4種樣品緩沖條件下的分析結(jié)果進(jìn)行了比較。

3種單抗樣品(mAb A、mAb B、mAb C)采用兩種烷基化試劑(IAM、NEM)和4種不同pH(6.0、7.0、8.0、9.0)的樣品緩沖液進(jìn)行前處理,電泳分析后進(jìn)行主峰純度的對(duì)比,主峰純度在不同pH條件下的趨勢(shì)如圖1。結(jié)果表明,采用IAM或NEM作為巰基封閉試劑,隨著樣品緩沖液pH的逐漸升高,非還原單抗的CE-SDS主峰含量逐漸下降,pH 6.0與pH 9.0時(shí)的主峰含量差值可達(dá)6.5%之多,且在使用IAM和NEM兩種封閉試劑的條件下具有相同的趨勢(shì)。用pH 6.0樣品緩沖液進(jìn)行前處理時(shí)的抗體純度明顯高于用pH 9.0的樣品緩沖液,此結(jié)論與之前Zhang等[12]的報(bào)道一致。

圖 1 不同pH樣品緩沖液條件下單抗純度的變化趨勢(shì)Fig. 1 Purity trend of mAbs under differentsample buffer pHThe purity trend of mAb A/mAb B/mAb C by non-reduced CE-SDS via different sample buffer pH and different alkylation agents.

pH低于6.0的緩沖溶液會(huì)影響IAM和NEM封閉游離巰基的效果,且考慮到抗體樣品較為穩(wěn)定的處理環(huán)境,以上對(duì)比試驗(yàn)未采用pH低于6.0的樣品緩沖液。

以mAb C為例,經(jīng)不同烷基化試劑(IAM、NEM)和兩個(gè)pH(6.0、9.0)的樣品緩沖液處理后的電泳圖譜如圖2。在pH 6.0、IAM的單抗前處理?xiàng)l件下,抗體片段LC、HH、HHL的含量明顯低于pH 9.0、IAM的前處理?xiàng)l件;在pH 6.0、NEM的單抗前處理?xiàng)l件下,抗體片段LC、HH、HHL的含量明顯低于pH 9.0、NEM的前處理?xiàng)l件。說(shuō)明采用pH 6.0樣品處理液前處理?xiàng)l件更能客觀準(zhǔn)確地檢測(cè)抗體藥物純度;而在相同pH條件下,IAM和NEM兩種封閉試劑在抗體純度檢測(cè)中的結(jié)果相近,NEM處理的樣品純度略高于IAM,因此后續(xù)試驗(yàn)以NEM為例進(jìn)行考察。

圖 2 不同樣品緩沖液進(jìn)行非還原mAb C處理的CE-SDS電泳圖Fig. 2 Electropherogram of non-reduced CE-SDS formAb via different sample preparationSample: mAb C; CE-SDS conditions: capillary, 20/30 cm effective/total length, inner diameter 50 μm; capillary temperature, 25 ℃; sample storage temperature, 25 ℃; injection, -10 kV, 20 s; separation voltage, -15 kV; separation time, 35 min; detector, PDA 220 nm.

為了證實(shí)該pH影響純度的變化趨勢(shì)適用于大部分單抗樣品,我們又使用了16個(gè)批次的7種單抗樣品,考察了在pH 6.0和pH 9.0兩個(gè)樣品緩沖液條件下的純度。結(jié)果與預(yù)期的一致,對(duì)于考察的所有單抗樣品,pH 6.0的樣品緩沖液兼具了屏蔽游離巰基和保護(hù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用,均為最佳樣品緩沖液條件,提供單抗產(chǎn)品最真實(shí)客觀的純度質(zhì)量結(jié)果。例如,對(duì)于兩個(gè)批次的mAb 7樣品,pH 6.0樣品緩沖液條件下主峰校正峰面積百分比的平均值比pH 9.0條件下高了4.45%(見(jiàn)表1);對(duì)于不同的樣品而言,由于游離半胱氨酸殘基的數(shù)量不同,在不同pH條件下的主峰純度差值不同[13]。為了驗(yàn)證采用pH 6.0樣品緩沖液進(jìn)行前處理時(shí)方法的可靠性,以mAb 1和mAb 6為例,進(jìn)行了pH 6.0和pH 9.0樣品緩沖液條件下的精密度測(cè)試,RSD均在1%以下(0.08%～0.24%)。非還原CE-SDS的結(jié)果再次證明，高pH的樣品處理液會(huì)導(dǎo)致抗體產(chǎn)生較多的降解片段，進(jìn)而產(chǎn)生不能反映產(chǎn)品實(shí)際質(zhì)量情況的純度結(jié)果。由于巰基封閉試劑的作用是盡最大可能防止抗體在前處理過(guò)程中產(chǎn)生降解，因此在下面的工作中我們對(duì)不同pH樣品處理液影響巰基封閉試劑封閉游離巰基作用能力的機(jī)理進(jìn)行了探討。

表 1 16個(gè)批次的7種單抗樣品的非還原CE-SDS純度分析結(jié)果

2.2 pH影響IAM封閉能力的機(jī)理探討

IAM在堿性條件下會(huì)發(fā)生親核取代反應(yīng)脫碘形成羥基(見(jiàn)圖3),羥基在堿性作用下會(huì)解離一個(gè)質(zhì)子,形成帶一個(gè)電子的負(fù)電荷結(jié)構(gòu)。由此可見(jiàn),堿性樣品緩沖液會(huì)使IAM發(fā)生親核取代反應(yīng)從而影響IAM對(duì)巰基的封閉效果。如果用IAM進(jìn)行巰基封閉,就此反應(yīng)而言,不適合使用堿性樣品緩沖液。

圖 3 IAM在堿性條件下的親核取代反應(yīng)Fig. 3 Nucleophilic substitution reaction of IAMunder alkaline condition

2.3 pH影響NEM封閉能力的機(jī)理探討

NEM封閉巰基的最佳pH是6.0～7.0,在該pH下NEM既能保持巰基的親核活性,又能降低與氨基的副反應(yīng)。當(dāng)pH>7.0時(shí),NEM與氨基的反應(yīng)活性高于巰基,故pH>7.0時(shí)大部分NEM被氨基消耗掉,不能起到預(yù)期封閉巰基的效果,且產(chǎn)生副產(chǎn)物。在pH<6.0時(shí),NEM也可以用于游離巰基的封閉,只是反應(yīng)活性稍低。

由圖2電泳圖可知:用NEM封閉劑處理樣品后的電泳圖在8 min左右有個(gè)特征峰(IAM作為封閉劑時(shí)無(wú)此峰)。且使用pH 9.0的樣品緩沖液時(shí)該特征峰明顯高于使用pH 6.0的樣品緩沖液時(shí)。推測(cè)可能發(fā)生了如圖4所示的水解反應(yīng)。NEM在堿性條件下發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng),最終形成帶上一個(gè)負(fù)電荷的水解產(chǎn)物hNEM,其可隨電動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)入毛細(xì)管中被檢測(cè)到。酸性條件下不會(huì)發(fā)生該反應(yīng)。而NEM本身不帶電荷不會(huì)被檢測(cè)到。因此推斷,NEM發(fā)生的開(kāi)環(huán)反應(yīng),影響其封閉效果,所以應(yīng)用NEM封閉游離巰基時(shí),應(yīng)在pH<7.0的條件下進(jìn)行。

圖 4 NEM的水解反應(yīng)Fig. 4 Hydrolysis of NEM

經(jīng)以上分析,IAM和NEM在pH 9.0的樣品緩沖液條件下均出現(xiàn)明顯的降解,失去封閉游離巰基的作用,進(jìn)而易產(chǎn)生游離巰基介導(dǎo)的鏈間二硫鍵斷裂,導(dǎo)致樣品處理過(guò)程中發(fā)生降解。

3 結(jié)論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析,我們發(fā)現(xiàn)在非還原單抗的CE-SDS純度分析中,樣品緩沖液的pH會(huì)顯著影響純度的分析結(jié)果,隨pH增高純度有降低的趨勢(shì)。pH 9.0時(shí)純度分析結(jié)果低于pH 6.0時(shí),主峰純度相差可達(dá)6.5%之多。通過(guò)封閉試劑的機(jī)理研究得出結(jié)論:在pH較高的樣品緩沖液中,兩種常用的封閉劑IAM和NEM均出現(xiàn)明顯的降解,降低了封閉游離巰基的作用,易產(chǎn)生游離巰基介導(dǎo)的鏈間二硫鍵斷裂,導(dǎo)致樣品處理過(guò)程中發(fā)生非預(yù)期降解而產(chǎn)生額外的碎片。該降解現(xiàn)象在pH 6.0的樣品緩沖液中明顯好轉(zhuǎn)。因此,為客觀、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)單抗產(chǎn)品的質(zhì)量及質(zhì)量變化情況,非還原單抗的CE-SDS純度分析應(yīng)采用pH 6.0的樣品緩沖液。