楊澤慧，陸 芝，李麗紅，江仲鵬，馮錦秀，馮麗貞

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州350002)

麗赤殼屬(Calonectriaspp.)真菌可侵染近100科寄主植物，造成多種病害[1].其中，C.reteaudii是澳大利亞、南美洲以及東南亞等地區(qū)桉樹(shù)焦枯病(Cylindrocladium)最重要的致病菌，主要危害巨桉、圓角桉、白桉、赤桉等眾多桉樹(shù)品種，病樹(shù)葉片焦枯脫落、嫩枝梢枯腐爛，甚至樹(shù)冠禿頂和整株死亡，桉樹(shù)人工林生產(chǎn)量明顯下降[2].據(jù)估計(jì)，福建省每年因該病害造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)0.518億元，嚴(yán)重制約著桉樹(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].我國(guó)桉樹(shù)焦枯病的病原菌至少有7種，其中C.pseudoreteaudii是福建省最早發(fā)現(xiàn)、分布最廣且致病力最強(qiáng)的病原菌株[4].對(duì)該菌致病調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究，可為設(shè)計(jì)藥劑提供靶位點(diǎn)，為制定持久有效的防治策略奠定基礎(chǔ).

MAPK是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它與MAPK KK(MAPK kinase kinase)、MAPKK(MAPK kinase)等組成的MAPK級(jí)聯(lián)途徑是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在真核生物的各項(xiàng)生命活動(dòng)中具有重要調(diào)控作用[5-7].研究[8]表明，植物病原真菌中至少存在3條典型的MAPK級(jí)聯(lián)途徑.酵母Fus3/Kss1類(lèi)同源基因在植物病原真菌中主要調(diào)控交配、附著胞或其他侵染結(jié)構(gòu)的形成、菌絲侵入生長(zhǎng)和毒力；Slt2-MAPK級(jí)聯(lián)通路主要參與植物病原真菌的細(xì)胞壁完整性；Hog1-MAPK主要應(yīng)答植物病原真菌細(xì)胞的滲透壓脅迫，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膨壓維持細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定[9-11].3條通路間既相互獨(dú)立又互相協(xié)作，使病原真菌積極響應(yīng)環(huán)境變化和寄主的防衛(wèi)反應(yīng).

植物在受到病菌侵染時(shí)會(huì)爆發(fā)活性氧，產(chǎn)生不利于病原菌的生存環(huán)境，以抵御病菌的侵入[12]；也會(huì)產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白(幾丁質(zhì)酶和1，3-葡聚糖酶)，瓦解病菌的細(xì)胞壁[13].運(yùn)用殺真菌劑(腐霉利、異菌脲、咯菌腈)防治病原菌時(shí)可能會(huì)激活Hog1-MAPK通路，導(dǎo)致病原菌不受控制地積累甘油等成分，最終病菌過(guò)度吸水腫脹而破裂，因此，病原菌的抗逆性在其侵染過(guò)程中十分重要[14].而孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管是病原菌侵入植物的關(guān)鍵步驟.

鑒于此，本研究運(yùn)用qPCR技術(shù)分析桉樹(shù)焦枯病菌C.pseudoreteaudii(YA51)與酵母Fus3/Kss1、Slt2、Hog1和Ime2類(lèi)基因同源的4個(gè)MAPK基因CpKss1、CpSlts、CpHog1和CpIme2在鹽脅迫、氧脅迫、細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫、桉樹(shù)組織誘導(dǎo)以及不同發(fā)育時(shí)期5個(gè)條件下的表達(dá)情況，預(yù)測(cè)其功能.為該病菌的致病機(jī)制、抗逆性機(jī)制研究，以及尋求控制該病害的有效途徑奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

桉樹(shù)焦枯病菌C.pseudoreteaudiiYA51、桉樹(shù)抗焦枯病品系尾細(xì)桉M1(Eucalyptus urophylla×E.tereticornis)葉片由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所提供.YA51基因組已上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology information，NCBI， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，編號(hào)為 MOCD01000000.瓊脂糖(BIOWEST)、PCR 引物(華大基因提供)、β-巰基乙醇、Tris-Hcl、EDTA、NaCl、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純、Taq PCR Master Mix(2×)(Promega)、0.5×TBE緩沖液、多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)、FastQuant cDNA第1條鏈合成試劑盒(FastQuant RT Kit)均采購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司.

1.2 方法

將焦枯病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基上，然后放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d.將培養(yǎng)后的平板刮掉菌絲，24 h后用無(wú)菌水清洗PDA平板并制成孢子懸浮液(106個(gè)·mL-1)或從菌落邊緣打取6 mm菌碟.

1.2.1 NaCl脅迫處理 將15 mL孢子懸浮液接種于分別含有0、0.1、0.2、0.3、0.4 mol·L-1NaCl的酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中培養(yǎng)12 h.用4層紗布濾下菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.2 干擾細(xì)胞壁完整性處理 分別將2個(gè)菌碟接種于含0、100、150、200 μg·mL-1熒光增白劑(Calcofluor White，CFW)的100 mL羧甲基纖維素鈉(CMC)培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中培養(yǎng)24 h.用4層紗布濾下菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.3 氧脅迫處理 分別將2個(gè)菌碟接種于含有0、4、6、8 mmol·L-1H2O2的150 mL CMC培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中培養(yǎng)24 h.用4層紗布濾下菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.4 桉樹(shù)組織誘導(dǎo)處理 取2 g桉樹(shù)葉片加入2 mL無(wú)菌水研磨成漿，離心后取上清液，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清液，置于100 mL PDA培養(yǎng)基，搖勻；待凝固后鋪上玻璃紙，在平板中加入100 μL上述孢子懸浮液(106個(gè)·mL-1)，并用涂布器均勻涂布.以馬鈴薯葡萄糖液體(potato dextrose broth，PDB)培養(yǎng)基接入焦枯病菌靜置培養(yǎng)作為對(duì)照組.分別在12和24 h后，用錫箔紙將菌絲及玻璃紙一同包裹后液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存，備用.

1.2.5 不同發(fā)育時(shí)期樣品收集 離心收集孢子用錫箔紙包裹后液氮速凍；將15 mL孢子懸浮液接種于150 mL YPD培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器(28℃，150 r·min-1)中，待芽管的長(zhǎng)度為孢子長(zhǎng)度的1/2時(shí)收集萌發(fā)菌絲，待培養(yǎng)12和24 h時(shí)收集成熟菌絲，用錫箔紙包裹后液氮速凍，-80℃保存.

1.2.6 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取不同脅迫條件下的桉樹(shù)焦枯病菌.采用超微量分光光度儀檢測(cè)總RNA濃度及D260nm/D280nm，凝膠電泳檢測(cè)總RNA帶型.

以mRNA為模板，根據(jù)FastQuant cDNA第1條鏈合成試劑盒(TIANGEN)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR.第1輪反應(yīng)體系：5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA 3 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足到 10 μL，加樣后于 42 ℃孵育3 min，再冰浴.接著向 PCR 管中加入事先配置好的 Mix：10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQRT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O，補(bǔ)足到10 μL.反應(yīng)程序：42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，置于-20 ℃冰箱中保存.

1.2.7 熒光定量PCR 以cDNA為模板，根據(jù)TransStart Tip Green RT-qPCR SuperMix(TRANSGEN)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量 PCR.反應(yīng)體系：2×Talent qPCR PreMix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.6 μL，Reverse Primer 0.6μL，cDNA 0.3 μL，50×ROX×Reference Dye 0.4 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足20 μL.反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95℃ 5 s，60 ℃ 15 s，30 個(gè)循環(huán).

采用Beacon Designer7軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成(表1).陳慧潔等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在桉樹(shù)焦枯病菌C.pseudoreteaudiiYA51中相同的內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性存在差異.因此本研究對(duì)不同條件下的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選，最終分別以β-tubulin(氧脅迫)、α-tubulin-2(桉樹(shù)組織誘導(dǎo))、Ubiquitin(細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫及鹽脅迫)、β-actin(不同發(fā)育時(shí)期)為內(nèi)參基因，計(jì)算表達(dá)量(Q)：

每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).采用SPSS Statistics 19對(duì)各基因在相同指標(biāo)、不同水平下的差異性進(jìn)行單因素方差分析(P＜0.05).

表1 熒光定量PCR引物Table1 Primers for RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 高滲透壓脅迫下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)情況

利用qPCR檢測(cè)了桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因在不同水平的高滲透壓處理下的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示.從圖1可知：4個(gè)MAPK基因受鹽脅迫的表達(dá)量整體呈現(xiàn)出一個(gè)線性增長(zhǎng)的表達(dá)模式；隨著脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)，表達(dá)量增加.其中CpHog1和CpKss1，在NaCl處理濃度為0.1 mol·L-1時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)；當(dāng)NaCl處理濃度為0.4 mol·L-1時(shí)，上調(diào)表達(dá)量最大，分別為8.36和6.28倍，且不同水平處理之間均呈顯著性差異.CpSlt2在NaCl處理濃度為0.3 mol·L-1時(shí)，才表現(xiàn)出與對(duì)照的顯著性差異，呈現(xiàn)出表達(dá)量增長(zhǎng)的趨勢(shì)，此時(shí)的相對(duì)表達(dá)量為2.77，在此之后相對(duì)表達(dá)量變化趨于平緩，穩(wěn)定在對(duì)照的2.7倍左右.對(duì)于CpIme2，當(dāng)處理濃度為0、0.1、0.2 mol·L-1時(shí)，相對(duì)表達(dá)量變化不大；當(dāng)NaCl處理濃度為0.3 mol·L-1時(shí)，CpIme2的表達(dá)量最大，比對(duì)照上調(diào)了6.97倍；隨著處理濃度的增大，表達(dá)量表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，但較對(duì)照顯著增大.綜上所述，不同濃度NaCl處理均有利于MAPK基因的上調(diào)表達(dá)，CpHog1和CpKss1相對(duì)表達(dá)量整體高于CpSlt2和CpIme2，其中CpHog1相對(duì)表達(dá)量上調(diào)最大.

2.2 氧脅迫下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)情況

通過(guò)qPCR檢測(cè)不同水平H2O2處理的桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖2所示.從圖2可知：從整體上看4個(gè)MAPK基因受不同濃度氧脅迫下的表達(dá)量，呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)；CpKss1在不同水平H2O2處理下的表達(dá)量變化無(wú)顯著差異，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的1.39～1.61倍；CpSlt2的表達(dá)量表現(xiàn)出一個(gè)線性增長(zhǎng)的表達(dá)模式，隨著脅迫強(qiáng)度的增大，表達(dá)量增加.當(dāng)H2O2處理濃度為6 mmol·L-1時(shí)，CpSlt2開(kāi)始發(fā)生顯著性上調(diào)表達(dá)，此時(shí)表達(dá)量比對(duì)照上調(diào)了2.76倍.當(dāng)H2O2處理濃度為8 mmol·L-1時(shí)，CpSlt2上調(diào)表達(dá)量最大，相對(duì)表達(dá)量為4.29.CpHog1在H2O2處理濃度為4 mmol·L-1時(shí)發(fā)生顯著下調(diào)，此時(shí)的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的0.63倍.在H2O2處理濃度為6和8 mmol·L-1時(shí)，CpHog1相對(duì)表達(dá)量變化趨于平緩，穩(wěn)定在對(duì)照的1.3倍左右，但與對(duì)照無(wú)顯著差異.CpIme2受氧脅迫的表達(dá)量呈現(xiàn)出一個(gè)拋物線的增長(zhǎng)表達(dá)模式，隨著脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)，在某一濃度達(dá)到高誘導(dǎo)表達(dá)，隨后表達(dá)量減少.當(dāng)H2O2處理濃度為6 mmol·L-1時(shí)，CpIme2表現(xiàn)出顯著上調(diào)，比對(duì)照上調(diào)了2.09倍，隨后表達(dá)量降低為對(duì)照的1.69倍.

圖1 不同濃度NaCl脅迫下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量(P＜0.05)Fig.1 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii under different concentrations of NaCl

圖2 不同濃度H2O2脅迫下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量(P＜0.05)Fig.2 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii under different concentrations of H2O2

2.3 細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)情況

桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因在不同水平CFW處理下的表達(dá)量變化如圖3所示.從圖3可知：從整體上看4個(gè)MAPK基因受不同濃度CFW脅迫下的表達(dá)量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)；CpKss1的表達(dá)量隨CFW脅迫強(qiáng)度的增大呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì).當(dāng)CFW處理濃度為100 μg·mL-1時(shí)，CpKss1的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)，此時(shí)的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的1.18倍；當(dāng)CFW處理濃度為150和 200 μg·mL-1時(shí)，CpKss1 相對(duì)表達(dá)量變化趨于平緩，穩(wěn)定在對(duì)照的0.8倍左右.CpSlt2表達(dá)量表現(xiàn)出一個(gè)線性增長(zhǎng)的表達(dá)模式，隨著脅迫強(qiáng)度的增大，表達(dá)量增加；當(dāng)CFW處理濃度為150 μg·mL-1時(shí)，CpSlt2開(kāi)始發(fā)生顯著上調(diào)表達(dá)，此時(shí)比對(duì)照上調(diào)了2.10倍.當(dāng)CFW處理濃度為200 μg·mL-1時(shí)，CpSlt2上調(diào)表達(dá)量最大，相對(duì)表達(dá)量為4.53.CpHog2在不同水平CFW處理下的表達(dá)量呈輕微下調(diào)，但表達(dá)量變化無(wú)顯著差異，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的0.78～0.86倍.CpIme2的表達(dá)量呈現(xiàn)出線性下降的表達(dá)模式，隨著脅迫強(qiáng)度的增大，表達(dá)量降低；在CFW處理濃度為100 μg·mL-1時(shí)出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，此時(shí)的表達(dá)量是對(duì)照的0.65倍.當(dāng)CFW處理濃度為200 μg·mL-1時(shí)，下調(diào)表達(dá)量最低，為對(duì)照的0.49倍.

圖3 不同濃度CFW脅迫下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量(P＜0.05)Fig.3 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii under different concentrations of CFW

2.4 桉樹(shù)組織誘導(dǎo)下焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)情況

桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量受桉樹(shù)組織誘導(dǎo)時(shí)間影響的結(jié)果如圖4所示.從圖4可知，從整體上看，不同侵染時(shí)間下4個(gè)MAPK基因在侵染條件下的表達(dá)量變化趨勢(shì)不一，有的呈現(xiàn)出上調(diào)的變化趨勢(shì)，有的呈現(xiàn)出下調(diào)的變化趨勢(shì).其中，CpKss1受誘導(dǎo)的表達(dá)量呈現(xiàn)線性增長(zhǎng)，隨著侵染時(shí)間的推移，表達(dá)量增大.侵染12 h時(shí)，表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到2.45；侵染24 h時(shí)，CpKss1表達(dá)量是對(duì)照的3.20倍.不同侵染時(shí)期，CpSlt2表達(dá)量輕微上調(diào)，但差異不顯著，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的1.20和1.63倍.CpHog1在侵染條件下發(fā)生顯著下調(diào)，侵染12 h的表達(dá)量為對(duì)照的0.54倍；侵染時(shí)間增加到24 h時(shí)，CpHog1的表達(dá)量較12 h時(shí)輕微上調(diào)，但是較對(duì)照依然是顯著下調(diào)，表達(dá)量為0.68.CpIme2的表達(dá)量變化情況與CpHog1相似，侵染12 h后的表達(dá)量為對(duì)照的0.47倍，下調(diào)幅度較CpHog1大；當(dāng)侵染時(shí)間增加到24 h時(shí)，CpIme2的表達(dá)量是對(duì)照的0.51倍.

2.5 不同發(fā)育時(shí)期桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)情況

不同發(fā)育時(shí)期桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量變化如圖5所示.從圖5可知，從整體上看4個(gè)MAPK基因的表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期的變化趨勢(shì)較為一致，在孢子時(shí)期的表達(dá)量較低，在萌發(fā)時(shí)期的表達(dá)量最低，在菌絲1時(shí)期的表達(dá)量較高，在菌絲2時(shí)期的表達(dá)量最高.在萌發(fā)時(shí)期CpKss1的表達(dá)量是孢子時(shí)期的0.29倍，表達(dá)量變化較其他3個(gè)基因大；而CpHog1表達(dá)量為0.48.但所有MAPK基因表達(dá)量與孢子時(shí)期均無(wú)顯著差異.在菌絲1時(shí)期，4個(gè)MAPK基因的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)；除CpHog1的表達(dá)量與孢子時(shí)期無(wú)顯著差異外，其他3個(gè)基因的表達(dá)量均在5.7以上，且與孢子時(shí)期的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著差異.隨著菌絲發(fā)育時(shí)間的推移，在菌絲2時(shí)期4個(gè)MAPK基因的表達(dá)量均大于菌絲1時(shí)期，且與孢子時(shí)期和菌絲1時(shí)期均表現(xiàn)出顯著差異，其中CpIme2表達(dá)量增加到20.40.

圖4 不同侵染條件下桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量(P＜0.05)Fig.4 Expression levels of MAPK genes in the infected C.pseudoreteaudii

圖5 不同發(fā)育時(shí)期桉樹(shù)焦枯病菌MAPK基因的表達(dá)量(P＜0.05)Fig.5 Expression levels of MAPK genes in C.pseudoreteaudii at different developmental stages

3 小結(jié)與討論

MAPK級(jí)聯(lián)途徑在細(xì)胞過(guò)程中廣泛發(fā)揮作用，常參與病菌的致病過(guò)程.CpKss1是酵母Fus3/Kss1類(lèi)同源基因，在鹽脅迫下受誘導(dǎo)的表達(dá)量隨脅迫強(qiáng)度的增大持續(xù)上調(diào)表達(dá)，由此可見(jiàn)CpKss1在桉樹(shù)焦枯病菌抵御高滲環(huán)境中起重要作用；在氧脅迫下表達(dá)量無(wú)顯著性變化，表明CpKss1對(duì)氧脅迫不敏感；在細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫下表現(xiàn)出表達(dá)量下調(diào)的趨勢(shì)，表明CpKss1的表達(dá)受到CFW的抑制；在桉樹(shù)組織液誘導(dǎo)下隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，CpKss1的表達(dá)量持續(xù)增加，表明其可能在桉樹(shù)焦枯病菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用；CpKss1在菌絲發(fā)育階段表達(dá)量最高，且隨菌絲生長(zhǎng)時(shí)間的推移表達(dá)量增加，推測(cè)該基因可能參與調(diào)控菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育.因此，CpKss1在桉樹(shù)焦枯病菌中可能參與調(diào)控致病性、菌絲生長(zhǎng)、高滲脅迫反應(yīng)等.研究[17]表明，在玉米黑粉病菌(Ustilago maydis)中有2個(gè)酵母Fus3/Kss1類(lèi)同源基因Kpp2和Kpp6，其雙敲除突變體不能交配且不致病.在黃瓜炭疽病菌[18]和玉米黑粉病菌[17]中，F(xiàn)us3/Kss1-MAPK均被證實(shí)與附著胞形成有關(guān).這與本文研究結(jié)果一致.但有研究表明Fus3/Kss1對(duì)附著胞的形成無(wú)影響.不形成附著胞的病菌敲除Fus3/Kss1同源基因后，禾生球腔菌不能穿透氣孔[19]，小麥葉斑病菌不能產(chǎn)生侵染結(jié)構(gòu)[20]，間接調(diào)控病菌的致病性.

CpSlt2是酵母Slt2類(lèi)同源基因，在鹽脅迫下表達(dá)量輕微上調(diào)，但無(wú)明顯規(guī)律.在氧脅迫下隨H2O2濃度的增大，CpSlt2表達(dá)量呈直線上升，表明其可能在桉樹(shù)焦枯病菌抵御氧脅迫環(huán)境中起重要作用.在細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpSlt2受誘導(dǎo)的表達(dá)量呈現(xiàn)出持續(xù)增長(zhǎng)的表達(dá)模式，說(shuō)明該基因可能參與調(diào)控細(xì)胞壁的完整性.在桉樹(shù)組織誘導(dǎo)下CpSlt2的表達(dá)量無(wú)明顯變化，表明其可能與致病性無(wú)關(guān)；在病菌的不同發(fā)育階段，CpSlt2在菌絲發(fā)育階段表達(dá)量最高，該基因可能與菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān).總而言之，CpSlt2在桉樹(shù)焦枯病菌中可能參與調(diào)控氧脅迫反應(yīng)、細(xì)胞壁完整性和菌絲生長(zhǎng)發(fā)育等.研究[21]表明，酵母Slt2類(lèi)同源基因在禾谷鐮刀菌、稻瘟病菌和禾生球腔菌中，都與病菌的細(xì)胞壁強(qiáng)度有關(guān).白菜黑斑病菌的酵母Slt2類(lèi)同源基因被破壞后，菌絲生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明該基因?qū)z生長(zhǎng)有一定影響[22].上述研究與本研究結(jié)果具有一致性.在黃瓜炭疽病菌中Slt2類(lèi)同源基因MAF1調(diào)節(jié)早期侵入步驟，缺失MAF1突變體的芽管無(wú)法產(chǎn)生附著胞[23]，這與本文研究結(jié)論存在偏差，可能是由于Slt2類(lèi)同源基因作用在不同病菌中存在差異[24].

CpHog1是酵母Hog1類(lèi)同源基因，在鹽脅迫下受誘導(dǎo)的表達(dá)量呈現(xiàn)出持續(xù)增長(zhǎng)的表達(dá)模式，隨著脅迫強(qiáng)度的增大，表達(dá)量持續(xù)顯著上調(diào)，推測(cè)CpKss1在桉樹(shù)焦枯病菌抵御高滲環(huán)境中起重要作用.在氧脅迫和細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpHog1的表達(dá)量無(wú)顯著性變化，表明其可能與抵御氧脅迫反應(yīng)和調(diào)控壁細(xì)胞完整性無(wú)關(guān)；在桉樹(shù)組織誘導(dǎo)下，CpHog1表達(dá)量表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，表明CpHog1的表達(dá)受到桉樹(shù)組織的抑制；在桉樹(shù)焦枯病菌的不同發(fā)育時(shí)期，CpHog1在孢子萌發(fā)時(shí)期表達(dá)量最低，在菌絲時(shí)期表達(dá)量較高，但無(wú)明顯規(guī)律.因此，CpHog1在桉樹(shù)焦枯病菌中可能參與病菌抵御高滲環(huán)境反應(yīng).研究[25-26]表明，該基因在板栗疫病菌和稻平臍蠕孢中均與病菌抵御高滲透壓脅迫有關(guān).與此同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)Hog1同源基因在禾生球腔菌中還與致病性有關(guān)[27].上述研究與本研究結(jié)論一致.

CpIme2是酵母Ime2類(lèi)同源基因，在鹽脅迫中表現(xiàn)出拋物線型的表達(dá)模式，在NaCl濃度較低的情況下CpIme2的表達(dá)量持續(xù)上升，但在濃度較大時(shí)的表達(dá)量較之前略微下降，表明CpIme2在一定程度上參與病菌的高滲脅迫反應(yīng).在氧脅迫的條件下，CpIme2的表達(dá)量無(wú)明顯變化，可能其與病菌抵御氧脅迫反應(yīng)無(wú)關(guān).在細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpIme2的表達(dá)量呈現(xiàn)出持續(xù)降低的表達(dá)模式，表明該基因在CFW脅迫下的表達(dá)受到抑制.在桉樹(shù)組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上CpIme2的表達(dá)量受到抑制.在桉樹(shù)焦枯病菌的不同發(fā)育時(shí)期，CpIme2在菌絲時(shí)期的表達(dá)量顯著增加，隨菌絲發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量也顯著增加，推測(cè)該基因在菌絲發(fā)育方面發(fā)揮顯著作用.因此，CpIme2在桉樹(shù)焦枯病菌中可能參與病菌的高滲脅迫反應(yīng)和菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育.酵母Ime2類(lèi)同源基因在玉米黑粉病菌中影響菌絲的形成和交配，并間接與致病性相關(guān)[28]，這與本研究結(jié)論相一致.但研究[28]也發(fā)現(xiàn)，Ime2同源基因在真菌中不僅調(diào)控減數(shù)分裂，也調(diào)控各種生理過(guò)程，包括子囊孢子形成、假菌絲生長(zhǎng)和有性繁殖.

綜上所述，在高滲透壓脅迫下，CpHog1和CpKss1的表達(dá)量先表現(xiàn)出顯著增加，但CpHog1增加的幅度明顯大于CpKss1，CpIme2的表達(dá)量在脅迫濃度較大時(shí)才表現(xiàn)出顯著增加.在細(xì)胞壁干擾物質(zhì)脅迫下，CpKss1、CpHog1和CpIme2的表達(dá)量受到顯著抑制，其中對(duì)CpIme2的抑制程度最大，而對(duì)CpHog1和CpKss1的抑制程度相當(dāng).在侵染條件下，CpHog1和CpIme2的表達(dá)量受到顯著抑制，CpIme2的表達(dá)量受抑制程度更大.在不同發(fā)育時(shí)期條件下，桉樹(shù)焦枯病菌4個(gè)MAPK基因均在孢子萌發(fā)階段表達(dá)量最低，在孢子時(shí)期表達(dá)量較低，在菌絲階段表達(dá)量最高.其中，CpIme2的表達(dá)量變化倍數(shù)最大，CpHog1的表達(dá)量變化倍數(shù)最小.