金 迪 王冬至 王煥雪 李潤(rùn)枝 陳樹林 陽文龍張愛民 劉冬成,4,* 詹克慧,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州 450002； 2中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 / 植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100101； 3北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京 102206； 4北京科技大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)研究中心, 北京 100024

芒是小麥穗器官的重要組成部分, 由小花外稃的末端延伸形成, 屬于葉的變態(tài), 是植物長(zhǎng)期進(jìn)化與適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。一般有長(zhǎng)芒、無芒、半芒和頂芒之分, 芒在麥穗上的分布情況可以概括為芒長(zhǎng)均勻分布、從頂部到基部逐漸變短的倒塔形分布與中上部最長(zhǎng)而頂部和基部較短的鐘形分布等類型[1]。小麥品種之間芒的差異如芒的有無、形狀、長(zhǎng)短及顏色是非常容易識(shí)別的特性, 可以作為區(qū)分不同小麥品種以及基因定位的重要形態(tài)標(biāo)記[2-5]。

小麥芒的橫切面呈銳角三角形, 3個(gè)角上斜生著許多刺毛, 遠(yuǎn)軸端兩側(cè)表皮中部具有帶狀分布的氣孔, 氣孔帶下方是綠色組織, 富含葉綠體與線粒體,葉綠體沿壁排列, 而近軸端沒有氣孔和綠色組織[6]。從芒中分離出來的葉綠體能進(jìn)行光合作用, 尤其是在小麥籽粒灌漿后期, 旗葉開始衰老光合能力下降時(shí), 芒仍保持較高的光合速率, 其光合產(chǎn)物成為小麥籽粒同化物來源的重要補(bǔ)充[7]。芒的光合作用產(chǎn)物就近向籽粒運(yùn)輸,14C同位素標(biāo)記證實(shí)芒的同化產(chǎn)物99%運(yùn)入著生該芒的小穗[8], 包括芒在內(nèi)的小麥穗部光合對(duì)籽粒干重的貢獻(xiàn)依據(jù)環(huán)境條件不同約為10%～44%[9-12]。在干旱少水條件下, 葉片與芒的蒸騰作用均會(huì)減弱, 葉片光合速率亦相應(yīng)降低, 而芒光合速率能保持相對(duì)穩(wěn)定。因此, 在干旱條件下, 有芒小麥可比無芒小麥增產(chǎn)15%～30%[13]。此外, 芒刺及芒的機(jī)械特性, 使得芒在減少收獲前種子損失[12]、促進(jìn)小麥的傳播與進(jìn)化方面起著重要作用[14]。

影響芒長(zhǎng)度的基因較多, 目前在1B、2A、2D、3B、4A、5A、6B、7D等染色體上均發(fā)現(xiàn)與芒長(zhǎng)相關(guān)的位點(diǎn)[4,15-17], 其中B1、B2、B3、A和Hd5個(gè)基因在芒的發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用,Hd是產(chǎn)生鉤芒的基因,A基因促進(jìn)芒的伸長(zhǎng), 而B1、B2和B3抑制芒的伸長(zhǎng), 且B1的抑制作用最強(qiáng),B2次之,B3的抑制作用最弱[6,15,18]。Hd的芒縮短成鉤狀, 基部特征性彎曲, 通常自身彎曲成閉合螺旋, 有時(shí)會(huì)出現(xiàn)芒基部膨大成膜狀[15,18]；B1會(huì)造成穗基部和中部極短的芒或無芒, 頂端約1/4處芒長(zhǎng)增加, 最長(zhǎng)可達(dá)到1 cm,這些芒一般基部不彎曲故呈豎直狀[15,18]；B2基因型會(huì)造成整個(gè)穗部的短芒, 通常麥穗各部位的芒長(zhǎng)基本沒有差異, 偶爾出現(xiàn)穗中部芒較長(zhǎng)的現(xiàn)象, 但芒長(zhǎng)度大多在6 mm以下, 偶有彎曲[15,18]。芒長(zhǎng)控制基因均遵循孟德爾遺傳定律, 其不同等位基因的不同組合產(chǎn)生了芒的不同類型[15], 如攜有純合 3個(gè)隱性等位基因hd、b1和b2的小麥表現(xiàn)為長(zhǎng)芒, 而基因型為HdB2(如中國(guó)春)、B1 B2(如 Federation)則表現(xiàn)為完全無芒[15]。

在禾本科作物中, 已有多個(gè)控制芒性狀的基因被克隆, 如水稻An-1[19]、An-2/LABA1[20-21]、DL[22]、GAD1/RAE2[23-24]和大麥Lks2[25]、Hooded[26]及ROUGH AWN1[27]等。在小麥中,Hd、B1和B2在染色體上的位置已經(jīng)通過中國(guó)春?jiǎn)误w系統(tǒng)、中國(guó)春染色體片段缺失系、全基因組關(guān)聯(lián)分析、QTL等手段進(jìn)行了定位,Hd位于4A染色體短臂[1,15,18],B1位于5A染色體長(zhǎng)臂[3-5,15-18,28],B2位于6B染色體長(zhǎng)臂[15,17-18,29],然而到目前為止, 小麥中尚無有關(guān)控制芒性狀的基因被克隆的報(bào)道。本研究對(duì)小麥短芒材料‘六柱頭’的芒長(zhǎng)發(fā)育及芒長(zhǎng)抑制基因的遺傳進(jìn)行探討, 旨在精細(xì)定位其基因位點(diǎn), 分析其候選基因的序列和表達(dá)譜, 為該基因的克隆及功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及遺傳群體的構(gòu)建

試驗(yàn)材料為‘六柱頭’、‘石矮 1號(hào)’及其配制的遺傳分離群體(簡(jiǎn)稱SL)?！^’是中國(guó)小麥微核心種質(zhì)資源, 生物學(xué)形態(tài)表現(xiàn)： 較高株高, 短芒,整穗各部分芒長(zhǎng)均不超過0.5 cm； ‘石矮 1號(hào)’為河北石家莊農(nóng)林科學(xué)研究院與河北省小麥工程技術(shù)研究中心利用花藥組織培養(yǎng)育種方法創(chuàng)制的小麥矮稈新種質(zhì), 穗部遍布長(zhǎng)芒, 芒長(zhǎng)度超過 5 cm。利用‘六柱頭’和‘石矮1號(hào)’雜交獲得F1, 自交獲得的F2群體(SL-F2)用于基因定位, 部分 F2單株自交得到F2：3家系, 以鑒定 F2單株基因型和進(jìn)行芒的細(xì)胞學(xué)觀察。分別于2016—2017年和2017—2018年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭州科教園區(qū)種植F2群體和F2：3家系。

1.2 芯片分型

利用植物基因組 DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京, DP305)提取 F2單株幼苗葉片DNA, 根據(jù) F2：3家系的芒性狀分離情況對(duì) F2單株進(jìn)行選擇, 分別將短芒純合、短芒雜合與長(zhǎng)芒材料各15株的DNA等量混合, 構(gòu)建顯性混合池、雜合混合池和隱性混合池, 利用Wheat660 SNP芯片進(jìn)行全基因組 SNP分型檢測(cè)(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)。將SNP側(cè)翼序列進(jìn)行BLAST中國(guó)春參考基因組(IWGSC.Ref.V1.0)[30], 參考 SNP標(biāo)記的遺傳圖譜及遺傳位置信息(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所趙光耀研究員提供), 獲得SNP在中國(guó)春參考基因組上的物理位置信息。利用Microsoft Excel進(jìn)行混合池之間差異SNP的篩選與染色體分布統(tǒng)計(jì)。

1.3 標(biāo)記開發(fā)與遺傳圖譜構(gòu)建

采用CTAB法提取SL-F2群體葉片DNA[31], 利用 SSRLocator軟件[32]及內(nèi)置的 Primer 3程序進(jìn)行SSR搜索與引物設(shè)計(jì), 參考 Li等[33]采用 CAPS/dCAPS Designer基于Wheat660K SNP芯片開發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行修改完成CAPS和dCPAS標(biāo)記的開發(fā), 所用標(biāo)記的信息如表 1所示, 所有引物均由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系總體積為20μL, 包括50 ng模板DNA, 0.2 μmol L-1引物和 1×TaqMasterMix (江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司,CW0682L, 包含 0.2 mmol L-1dNTPs、0.15 mmol L-1MgCl2和1 UTaqDNA聚合酶)。PCR擴(kuò)增采用94℃預(yù)變性5 min, 然后按照94℃變性30 s, 55℃退火30 s(對(duì)于個(gè)別引物需根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)退火溫度), 72℃延伸30 s (對(duì)于EST標(biāo)記, 延伸時(shí)間延長(zhǎng)至2 min)的條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸10 min。SSR標(biāo)記在 PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行電泳, CAPS標(biāo)記、dCAPS標(biāo)記及EST標(biāo)記在PCR擴(kuò)增后采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后電泳檢測(cè)。限制性內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司, 購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司)的酶切反應(yīng)按照相應(yīng)說明書進(jìn)行。對(duì)于 SSR標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和dCAPS標(biāo)記的酶切產(chǎn)物, 用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離, 而 CAPS標(biāo)記與EST標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

對(duì)SL-F2群體的標(biāo)記基因型和表型用JoinMap v4.0 (Kyazma B.V.)軟件[34]完成遺傳圖譜的構(gòu)建, 采用極大似然算法進(jìn)行重組率計(jì)算, 使用Kosambi作圖函數(shù)進(jìn)行重組率和遺傳距離(cM)的轉(zhuǎn)換, 用Mapchart v2.3軟件[35]繪制遺傳圖譜。

1.4 石蠟切片

將10個(gè)短芒和5個(gè)長(zhǎng)芒SL-F2：3株系分別種植于中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所植物溫室(IGDB, CAS), 分別取芒長(zhǎng)性狀沒有分離的顯性純合和隱性純合單株進(jìn)行芒發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察。對(duì)護(hù)穎分化期的幼穗(長(zhǎng)度約0.5～1.0 cm)用FAA固定液(冰醋酸5 mL, 37%甲醛溶液5 mL, 無水乙醇50 mL,補(bǔ)充雙蒸水定容至100 mL)室溫固定24 h, 50%乙醇洗滌3次后進(jìn)行梯度乙醇(70%、80%、90%、95%和100%)脫水和二甲苯(25%、50%、75%和100%)脫色,65℃浸蠟后使用石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡, RM2235)將芒中段縱向切成4 μm厚的薄片, 番紅-固綠溶液(1.0%番紅, 0.5%固綠)染色后封片, NIKON CI-S生物顯微鏡觀察和拍照。

1.5 基因微共線性分析和候選基因分析

以中國(guó)春B2區(qū)間基因的CDS序列(IWGSC Ref-Seq v1.0 annotation), TBLASTX比對(duì)中國(guó)春參考基因組CDS數(shù)據(jù)庫(kù)(IWGSC RefSeq v1.0 annotation)和矮抗58參考基因組的CDS數(shù)據(jù)庫(kù)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所趙光耀研究員提供), 按照一致性＞80%、覆蓋度＞80%、比對(duì)E值＜1E-10、序列長(zhǎng)度＞200 bp進(jìn)行初篩, 綜合比對(duì)得分、E值、Gaps和Mismatch選取比對(duì)最好的序列作為同源基因, 使用Mapchart v2.3軟件[35]繪制圖譜, 用InKscape軟件進(jìn)行調(diào)整。

以中國(guó)春IWGSC.Ref.V1.0包含2000 bp啟動(dòng)子區(qū)域和 500 bp 3′-UTR區(qū)域在內(nèi)的基因序列BLASTN比對(duì)矮抗 58基因組序列(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所趙光耀研究員提供), 獲得矮抗58中的同源基因序列, 用 SeqMan軟件進(jìn)行候選基因中國(guó)春和矮抗58基因組序列及中國(guó)春CDS序列的比對(duì)。

使 用 Wheat Expression Browser (http：//www.wheat-expression.com/)網(wǎng)站進(jìn)行B2區(qū)間候選基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)調(diào)取, 使用的數(shù)據(jù)集為“Developmental time-course of Chinese Spring”和 “Developmental time-course of Azhurnaya”, 使用TBtools軟件進(jìn)行熱圖的繪制[36], 用InKscape軟件進(jìn)行美化調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘六柱頭’的短芒主要由細(xì)胞的變短所致

為了解析SL-F2群體芒性狀差異形成的發(fā)育生物學(xué)機(jī)制, 對(duì) SL-F2：3株系顯性純合和隱性純合幼穗的芒切片進(jìn)行了顯微鏡觀察。在長(zhǎng)芒材料(圖 1-A)和短芒材料(圖 1-B)的芒中均有維管束的存在, 短芒材料芒刺較為稀少, 但芒的解剖結(jié)構(gòu)并沒有大的差別。由圖 1可知, 長(zhǎng)芒材料的細(xì)胞長(zhǎng)度明顯大于短芒材料,細(xì)胞長(zhǎng)度分別為21.49 μm和8.30 μm, 說明SL-F2群體‘六柱頭’的短芒性狀主要由細(xì)胞的變短所致。

圖1 長(zhǎng)芒材料(A)和短芒材料(B)芒的石蠟切片F(xiàn)ig. 1 Longitudinal section of middle region in long awn (A)and short awn (B)

2.2 SL-F2群體的短芒性狀是由顯性單基因控制

短芒親本‘六柱頭’與長(zhǎng)芒親本‘石矮1號(hào)’雜交, 雜種F1代全部表現(xiàn)為短芒, F2代(SL-F2)出現(xiàn)芒長(zhǎng)的分離(圖 2-A), 但只有長(zhǎng)芒、短芒 2種類型而沒有中間型, 長(zhǎng)芒植株穗中部芒長(zhǎng)均超過5 cm, 短芒植株穗中部芒長(zhǎng)均小于0.5 cm。F2群體共統(tǒng)計(jì)1413株, 其中長(zhǎng)芒350株, 短芒1063株(表2)。χ2檢驗(yàn)表明, 短芒和長(zhǎng)芒單株的數(shù)量符合3∶1的分離比例(P= 0.84)(表2)。說明, 在SL-F2群體中短芒對(duì)長(zhǎng)芒為完全顯性,‘六柱頭’中的短芒性狀受顯性單基因遺傳控制。

2.3 芒長(zhǎng)抑制基因B2控制SL-F2群體的芒長(zhǎng)性狀

圖2 SL-F2群體的構(gòu)建及Wheat660K芯片分型結(jié)果分析Fig. 2 Population construction and analysis of Wheat660K SNP chip

表2 SL-F2群體的遺傳分析及卡方檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Chi-square test and genetic analysis of SL-F2 population

根據(jù)短芒純合、短芒雜合與長(zhǎng)芒材料構(gòu)建的顯性混合池、雜合混合池和隱性混合池, 利用Wheat660K芯片進(jìn)行全基因組SNP分型, 共得到3個(gè)混合池間差異 SNP標(biāo)記 145,915個(gè), 其中顯性池及隱性池為純合基因型且雜合池為雜合基因型的SNP標(biāo)記有17,835個(gè)。在這17,835個(gè)差異標(biāo)記中,59.11% (10,543個(gè))位于6B染色體, 10.34% (1845個(gè))尚未定位, 定位到其他染色體上的均不超過5% (圖2-B), 由此推斷控制SL-F2群體芒長(zhǎng)性狀的基因很可能位于6B染色體。對(duì)6B染色體的SNP標(biāo)記以10 Mb為滑窗統(tǒng)計(jì)平均每Mb中含有的差異SNP標(biāo)記數(shù)量,發(fā)現(xiàn)在430～530 Mb差異SNP最多, 尤其以480 Mb附近及525 Mb附近最為集中(圖2-C)。

芒長(zhǎng)抑制基因B2定位于6B染色體長(zhǎng)臂[15,17-18,29],與Wheat660K芯片SNP分型的富集結(jié)果一致, 因此推測(cè)SL-F2群體中控制芒長(zhǎng)性狀的基因可能就是B2基因。為了驗(yàn)證這一推測(cè), 選取96個(gè)無芒單株和96個(gè)有芒單株組成 SL-F2亞群體, 用前人報(bào)道[18]的B2連鎖標(biāo)記Xgwm88、WABM232658、WABM214868進(jìn)行基因型掃描, 將表型與基因型進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建,結(jié)果表明SL-F2群體芒性控制基因被定位在Xgwm88與WABM232658之間, 標(biāo)記順序與前人報(bào)道的一致[18]。此外, SL-F2全群體的遺傳圖譜構(gòu)建也得到了相同的結(jié)果(圖3-A)。因此, SL-F2群體中的芒性控制基因應(yīng)該是前人報(bào)道的B2基因。

2.4 芒長(zhǎng)抑制基因B2定位在4.84 Mb的物理區(qū)間內(nèi)

通過引物序列比對(duì),Xgwm88和WABM232658分別被定位到中國(guó)春參考基因組 IWGSC.Ref.V1.0染色體6B的430.08 Mb和482.79 Mb附近。為了確認(rèn)初步定位結(jié)果并精細(xì)定位B2基因, 在中國(guó)春參考基因組 6B 染色體 450～451 Mb、465～466 Mb、500～505 Mb及530～531 Mb區(qū)間內(nèi)用SSRLocator軟件及內(nèi)置的Primer 3程序進(jìn)行SSR搜索與引物設(shè)計(jì), 將親本間及混池間存在差異的 SSR標(biāo)記SSR43、SSR74、SSR116和SSR122加密到遺傳圖譜中, 將B2定位在SSR122與WABM232658之間的0.79 cM的遺傳區(qū)間(圖 3-A)。

根據(jù)顯性池、雜合池和隱性池的Wheat660K全基因組 SNP分型結(jié)果, 借助前人根據(jù) Wheat660K SNP芯片開發(fā)的CAPS/dCAPS標(biāo)記[33], 將3個(gè)CAPS標(biāo)記CAPS12、CAPS14、CAPS19和3個(gè)dCAPS標(biāo)記dCAPS4、dCAPS18、dCAPS19加密到遺傳圖譜。此外, 還通過對(duì)親本‘六柱頭’、‘石矮 1號(hào)’克隆基因并測(cè)序, 開發(fā)了3個(gè)EST標(biāo)記EST-499300LC、EST-263300和EST-265400。最終, 這些CAPS標(biāo)記、dCAPS標(biāo)記和EST標(biāo)記被加密到B2區(qū)段的遺傳圖譜中, 標(biāo)記dCAPS19、dCAPS4、EST-499300LC、CAPS12及CAPS14與B2共分離,B2與標(biāo)記dCAPS18和dCAPS39之間各存在2個(gè)重組事件(圖3-C), 重組單株的表型通過F2：3的芒性狀分離情況得到了確認(rèn)。最終,B2被定位于dCAPS18和dCAPS39之間0.29 cM的遺傳區(qū)間(圖3-A), 對(duì)應(yīng)于IWGSC.Ref.V1.0參考基因組6B染色體4.84 Mb的物理距離(圖3-B, C)。

圖3 B2基因的精細(xì)定位Fig. 3 Fine mapping of awn inhibiting gene B2

2.5 B2區(qū)間分析與候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)中國(guó)春參考基因組注釋, 在B2區(qū)間內(nèi)共有61個(gè)基因(圖5), 其中包括30個(gè)高可信度基因和31個(gè)低可信度基因。這些基因主要為酶類(如 E3泛素蛋白質(zhì)連接酶、類受體激酶)、轉(zhuǎn)錄因子(如堿性螺旋-環(huán)-螺旋 bHLH轉(zhuǎn)錄因子、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子)、調(diào)節(jié)蛋白(如 pH響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞壁松弛蛋白及含鈣依賴脂質(zhì)結(jié)合蛋白)及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白等。

圖4 B2區(qū)段的基因微共線性分析Fig. 4 Micro-collinearity analysis of B2 region

為了評(píng)估B2區(qū)間的序列保守程度, 對(duì)中國(guó)春B2區(qū)間基因A、B、D亞基因組同源基因及矮抗58基因組6B染色體的微共線性進(jìn)行分析(圖4)。中國(guó)春B2區(qū)段4.84 Mb (471.28～476.12 Mb)的物理區(qū)間對(duì)應(yīng)于矮抗58中6B染色體長(zhǎng)臂上5.99 Mb (472.90～478.89 Mb)的物理距離, 除位于邊界的基因evm.model.contig105.687外, 矮抗 58基因組B2區(qū)間的大小為4.81 Mb, 與中國(guó)春B2區(qū)間基本一致。中國(guó)春所有高可信度基因以及 4個(gè)低可信度基因在矮抗 58中存在同源基因, 其他 27個(gè)低可信度基因在矮抗 58不存在基因注釋, 而矮抗 58在B2區(qū)段共注釋出 35個(gè)基因, 除 3個(gè)基因(evm.model.contig105.755、evm.model.contig105.766和evm.model.contig105.784)外均在中國(guó)春中找到同源基因, 這些基因排列順序均一致, 表明2個(gè)基因組在B2區(qū)段的共線性關(guān)系很好(圖4)。此外,B2區(qū)段在中國(guó)春A、B、D亞基因組的共線性表現(xiàn)為6B區(qū)段473.07～476.12 Mb在3個(gè)亞基因組間基因順序一致,6B區(qū)段471.28～472.71 Mb與6A染色體基因順序一致,而與6D染色體區(qū)段之間存在倒位, 在6A染色體上兩個(gè)區(qū)段間存在這一個(gè)約40 Mb的大片段插入(圖4)。

中國(guó)春含有芒長(zhǎng)抑制基因B2[15,17-18], 而矮抗58是長(zhǎng)芒品種, 比較這 2個(gè)品種定位區(qū)段內(nèi)基因序列的差別有助于確定候選基因。序列比對(duì)結(jié)果表明, 在這61個(gè)基因中, 有13個(gè)基因在中國(guó)春和矮抗58基因組間不存在序列差異, 12個(gè)基因僅僅在啟動(dòng)子區(qū)或3′-UTR區(qū)存在序列變異, 6個(gè)基因在內(nèi)含子區(qū)存在序列變異而外顯子序列無差異, 30個(gè)基因的外顯子存在序列差異導(dǎo)致編碼氨基酸的改變, 其中 4個(gè)基因出現(xiàn)移碼突變(TraesCS6B01G503600LC、TraesCS6B01G503700LC、TraesCS6B01G263100和TraesCS6B01G505300LC)。

同時(shí), 對(duì)中國(guó)春(含有芒長(zhǎng)抑制基因B2B2)和長(zhǎng)芒材料 Azhurnaya (基因型b2b2)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)(http：//www.wheat-expression.com/)進(jìn)行分析。通過計(jì)算穗部表達(dá)量相對(duì)于各時(shí)期根、莖、葉和籽粒表達(dá)量平均值的 Fold-Change, 按照 Fold-Change(TPMSpike/TPMMean(Leaf,Root,Grain)) ≥ 2 (即穗部表達(dá)量是各時(shí)期根、莖、葉和籽粒表達(dá)量平均值的 4倍或4倍以上)為條件進(jìn)行篩選, 共得到 5個(gè)基因(TraesCS6B02G262200,TraesCS6B02G505000LC、TraesCS6B02G505100LC、TraesCS6B02G264400和TraesCS6B02G264600)(圖 5), 其中, 中國(guó)春和Azhurnaya之間僅有TraesCS6B02G264400在幼穗中的表達(dá)量差異達(dá)到Fold-Change ≥ 2的閾值(5.32-fold)。

圖5 中國(guó)春B2區(qū)間基因注釋與表達(dá)譜分析Fig. 5 Annotation and expression profiling of genes in B2 region

3 討論

芒是禾本科作物中典型的形態(tài)特征之一, 也是一種重要的馴化性狀。在自然馴化階段, 芒可以使種子粘在動(dòng)物的皮毛上借助動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)迅速傳播；種子從母體脫離并下落的過程中, 芒能起平衡作用,使其胚一端先著地并埋入土壤, 有利于種子萌發(fā)；芒的吸濕作用可以推動(dòng)種子入土進(jìn)行“自我掩埋”,芒剌還能夠提供根扎入泥土中的反作用力, 有利于幼苗的成活[14,37-39]。然而, 進(jìn)入人工馴化階段, 芒的存在不利于人們的收獲、儲(chǔ)存等農(nóng)業(yè)活動(dòng), 作為一個(gè)馴化靶點(diǎn)承受了較大的選擇壓[37-38]。大麥和小麥的芒具有相似的解剖結(jié)構(gòu), 如三角形的橫截面, 包含兩個(gè)綠色細(xì)胞的區(qū)域和三個(gè)維管束, 芒表面具有氣孔, 可以進(jìn)行光合作用和蒸騰作用, 大麥和小麥的長(zhǎng)芒是它們對(duì)干旱環(huán)境條件的適應(yīng), 有芒品種具有一定的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)。麥芒對(duì)產(chǎn)量的作用主要體現(xiàn)在：(1)芒可進(jìn)行光合作用, 尤其是在植株發(fā)育的后期,葉片光合速率迅速下降時(shí)芒的光合速率仍能保持相對(duì)穩(wěn)定, 可作為葉片光合作用的重要補(bǔ)充； (2)芒著生在植株的冠層頂部, 通風(fēng)透光條件良好, 且同化產(chǎn)物就近向籽粒運(yùn)輸； (3)芒可以進(jìn)行蒸騰作用, 且在干旱條件下, 芒的光合速率能保持相對(duì)穩(wěn)定；(4)芒具有一定的機(jī)械強(qiáng)度, 可以減少因碰撞引起的落粒； (5)芒的存在可以減少鳥類啄食和一些病蟲的滋生。

在水稻和大麥中, 已有多個(gè)控制芒發(fā)育的基因被克隆, 小麥中功能基因的定位與克隆工作受限于參考基因組而進(jìn)展緩慢。隨著小麥參考基因組數(shù)據(jù)的完善、TILLING突變體庫(kù)的釋放和RNA-seq等高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 小麥重要功能基因的定位和功能研究即將迎來一個(gè)黃金期。自集群分離分析方法(Bulked Segregant Analysis, BSA)被提出進(jìn)行遺傳學(xué)研究來[40], 該策略被廣泛用于篩選與目標(biāo)性狀或基因連鎖的分子標(biāo)記, 進(jìn)行基因或QTL的快速定位,并已開發(fā)出BSA-seq、BSR-seq、MutMap等基因快速克隆方法[41-44]。本研究探討了一種基于小麥高密度基因芯片的極端集群分析法(BSA+CHIP)對(duì)芒長(zhǎng)抑制基因B2進(jìn)行快速定位。首先, 選擇極端個(gè)體構(gòu)建混池進(jìn)行芯片分型, 分析差異SNP標(biāo)記將基因定位到目標(biāo)染色體較小的染色體區(qū)段； 再根據(jù)SNP分型結(jié)果, 針對(duì)性地篩選差異SNP, 借助CAPS/dCAPS Designer工具[33]開發(fā)CAPS或dCAPS標(biāo)記對(duì)候選區(qū)段進(jìn)行驗(yàn)證和精細(xì)定位。理論上, 遺傳定位群體只要有足夠的重組事件, 采用這種方式便可以在短期內(nèi)將基因定位到Mb水平。混池所用的群體類型、混池個(gè)體數(shù)目、目的基因染色體區(qū)域的重組頻率均對(duì)芯片分型的初步定位精度有著較大影響。為提高芯片分型定位效率, 可優(yōu)先選用多代自交衍生F2群體或近等基因系, 使用2個(gè)或2個(gè)以上群體進(jìn)行芯片分型以互相參考降低噪音干擾。在定位過程中, 可結(jié)合使用SSR標(biāo)記驗(yàn)證區(qū)間和初步定位以降低成本, 在重組單株較少的精細(xì)定位階段, 選擇差異SNP有針對(duì)性地開發(fā)標(biāo)記以進(jìn)行快速定位。

通過SNP芯片分型及精細(xì)定位,B2基因被定位到了6B染色體上0.29 cM的遺傳區(qū)間, 對(duì)應(yīng)著IWGSC.Ref.V1.0參考基因組4.84 Mb的物理距離。在該區(qū)間內(nèi), 共注釋有61個(gè)基因, 其中TraesCS6B02G504500LC編碼一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋類的bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 其擬南芥同源基因AtbHLH137是GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因REPRESSOR OF GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE3(RGA, 赤霉素不敏感阻遏子)的下游靶基因[45], 可能參與GA介導(dǎo)的發(fā)育過程調(diào)控。此外, 水稻An-1也編碼一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 調(diào)控芒的發(fā)育、籽粒大小和穗粒數(shù)[19]。該基因CDS區(qū)在中國(guó)春和矮抗58基因組之間存在一個(gè)SNP, 此SNP也存在于親本‘石矮1號(hào)’與‘六柱頭’之間, 它引起編碼蛋白在bHLH的轉(zhuǎn)角處一個(gè)氨基酸的替換, 可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變；TraesCS6B02G262600編碼TCP類轉(zhuǎn)錄因子, 該類轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有蛋白, 含有保守的TCP結(jié)構(gòu)域。TCP轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程(如分枝、株高、葉型、花型等)和植物逆境脅迫應(yīng)答(如低溫和高鹽)[46-48]。TCP蛋白參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如油菜素內(nèi)酯、茉莉酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素等), 可能是連接生長(zhǎng)發(fā)育和介導(dǎo)脅迫響應(yīng)的一個(gè)交叉點(diǎn)； 基因TraesCS6B01G264600編碼一個(gè)鈣依賴脂質(zhì)結(jié)合蛋白, 可能與鈣離子通道及細(xì)胞周期相關(guān),表達(dá)譜分析表明其在中國(guó)春和Azhurnaya的幼穗中特異表達(dá)(相對(duì)其他組織分別為8.89-Fold和9.27-Fold)； 基因TraesCS6B01G264400是一個(gè)細(xì)胞壁松弛蛋白, 它是一種能使植物細(xì)胞壁松弛的非酶類細(xì)胞壁糖蛋白, 普遍存在于發(fā)育中的植物組織和成熟的果實(shí)之中。該基因在中國(guó)春的幼穗中特異表達(dá)(相對(duì)其他組織4.88-Fold), 相比Azhurnaya的幼穗, 其在中國(guó)春幼穗中的表達(dá)量顯著上調(diào)(5.32-Fold), 和矮抗58相比, 中國(guó)春中該基因在外顯子、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)均存在大量SNP。因此, 在定位的4.84 MbB2物理區(qū)間內(nèi), 含有若干可能的候選基因, 上述基因都有可能參與芒的發(fā)育調(diào)控, 要明確具體哪個(gè)基因?qū)е隆^’短芒的表型, 還需進(jìn)一步的精細(xì)定位與更深入的功能研究。

4 結(jié)論

利用‘六柱頭’與‘石矮1號(hào)’構(gòu)建的F2群體,探討了一種基于高密度 SNP芯片的極端集群分析(BSA+CHIP)進(jìn)行小麥基因快速定位的方法, 并首次將小麥中控制芒長(zhǎng)的基因進(jìn)行了精細(xì)定位。‘六柱頭’的短芒主要是由細(xì)胞長(zhǎng)度變短引起, 由顯性單基因B2控制, 其被定位到6B染色體4.84 Mb的物理區(qū)間內(nèi), 該區(qū)段在中國(guó)春與矮抗58間具有良好的共線性。在B2定位區(qū)間共有61個(gè)基因, 通過表達(dá)譜分析與序列分析, 鑒定了幾個(gè)可能的候選基因。