侯智紅 吳 艷 程 群 董利東 蘆思佳 南海洋 甘卓然 劉寶輝

廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東廣州 510006

大豆(Glycine maxL. Merrill)起源于中國(guó), 是世界上重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一, 也是人類(lèi)植物油和植物性蛋白的主要來(lái)源。隨著生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改善, 人們對(duì)優(yōu)質(zhì)大豆油的需求日益增長(zhǎng), 培育高品質(zhì)大豆成為大豆育種的重要目標(biāo)之一。大豆油約占我國(guó)植物食用油消費(fèi)的 40%, 大豆脂肪酸的組分及其配比決定大豆油脂的品質(zhì)[1], 其主要由棕櫚酸(16：0)、硬脂酸(18：0)、油酸(18：1Δ9)、亞油酸(18：2Δ9,12)和亞麻酸(18：3Δ9,12,15) 5 種脂肪酸組成, 分別約占大豆脂肪酸總量的 10%、4%、18%、55%和13%[2-3]。其中, 硬脂酸、棕櫚酸為飽和脂肪酸； 油酸、亞油酸、亞麻酸為不飽和脂肪酸[4]。飽和脂肪酸不容易被人體消化吸收, 易引起肥胖癥及腦血管疾病[5]。亞油酸、亞麻酸是多不飽和脂肪酸, 穩(wěn)定性差, 在高溫加工時(shí)易氧化, 使?fàn)I養(yǎng)價(jià)值降低,影響油的品質(zhì), 在工業(yè)上的加氫反應(yīng)也易產(chǎn)生對(duì)人體有害的反式脂肪酸[6]。而油酸作為一種單不飽和脂肪酸, 性質(zhì)穩(wěn)定, 抗氧化作用強(qiáng), 在人體的脂類(lèi)代謝中能降低有害膽固醇, 保持有益膽固醇, 從而減緩動(dòng)脈粥樣硬化, 有效預(yù)防心血管疾病發(fā)生的幾率[7-8]。因此, 提高油酸的相對(duì)含量, 增加油酸/亞油酸的比值, 已成為大豆品質(zhì)改良育種的重要目標(biāo)之一。

所有生物的脂肪酸合成途徑基本類(lèi)似, 但是,動(dòng)物和酵母的脂肪酸合成主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行, 而植物脂肪酸合成主要發(fā)生在質(zhì)體中和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[9]。在脂肪酸合成途徑中, Δ12-脂肪酸脫飽和酶(deltatwelve fatty acid desaturase 2 enzyme, FAD2)是催化油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵酶[10]。目前, 擬南芥[11]、棉花[12]、向日葵[13]、大豆[14]等植物中的FAD2基因已經(jīng)被克隆。大豆中存在 2個(gè)FAD2基因, 分別為FAD2-1和FAD2-2, 是2個(gè)非等位基因。其中,FAD2-1基因在種子中特異性表達(dá), 是決定種子油酸含量的主要基因[15]?；诜€(wěn)定性及磷酸化作用不同,FAD2-1基因又分為FAD2-1A和FAD2-1B兩種[14]。抑制或過(guò)表達(dá)FAD2-1A和FAD2-1B基因, 可以顯著提高或降低油酸/亞油酸比例[16-18]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn),酵母細(xì)胞中不含有亞油酸, 而通過(guò)在酵母細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GmFAD2-1B基因后, 亞油酸的含量顯著提高,說(shuō)明GmFAD2-1B基因是亞油酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因。Pham 等[17-18]分別獲得FAD2-1A突變體與FAD2-1B突變體, 以及FAD2-1A/FAD2-1B雙突變體材料, 并發(fā)現(xiàn)無(wú)論是單突變還是雙突變體中, 大豆的油酸含量均顯著提高。Wang等[19]利用RNAi技術(shù),獲得干涉FAD2基因轉(zhuǎn)基因植株, 并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆油酸含量高達(dá)71.5%～81.9%。Zhang等[20]和Yang等[21]分別通過(guò)RNAi技術(shù), 獲得油酸含量為51.71%和 27.38%～80.42%的干涉FAD2-1B基因轉(zhuǎn)基因大豆。Haun等[22]利用人工核酶技術(shù)定點(diǎn)突變大豆FAD2-1A和FAD2-1B基因, 獲得油酸含量高達(dá)80%的轉(zhuǎn)基因大豆。因此,FAD2-1A與FAD2-1B在決定大豆種子油酸含量中起著重要作用, 是調(diào)控油酸含量的2個(gè)主要基因[15]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年開(kāi)發(fā)的一種準(zhǔn)確、便捷、高效率的生物基因組編輯方法。通過(guò)向?qū)NA的介導(dǎo)和Cas9蛋白的切割來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的定點(diǎn)編輯[23]。目前, CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用在擬南芥[24]、玉米[25]、小麥[26]、水稻[27-28]、大豆[29]等植物中。Jacobs等[29]第一次利用 CRISPR/Cas9技術(shù)在大豆中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)突變。Cai等[30]利用CRISPR/Cas9技術(shù)原理選取3個(gè)不同靶位點(diǎn), 首次應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系, 成功創(chuàng)制出穩(wěn)定遺傳的大豆突變體材料。該技術(shù)應(yīng)用在大豆基因功能研究中起到重要作用, 然而, 應(yīng)用在大豆育種上的報(bào)道較少。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù), 定點(diǎn)編輯了控制油酸含量的關(guān)鍵基因FAD2-1A(Glyma10g42470), 并獲得純合FAD2-1A突變體, 對(duì)大豆分子育種和提高大豆品質(zhì)具有重要意義, 為進(jìn)一步提高大豆品質(zhì)奠定了重要的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大豆材料、CRISPR/Cas9及gRNA載體

大豆材料華夏3號(hào)(簡(jiǎn)稱(chēng)H3)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)和廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院合作選育, 以桂早 1號(hào)為母本, 巴西13號(hào)為父本經(jīng)有性雜交和系譜選育而成。該品種田間抗病性較強(qiáng), 抗倒性強(qiáng), 耐旱性好,對(duì)酸性低磷土壤有很好的耐性且高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗大豆病毒病, 適宜在廣東、廣西、海南、福建中南部、江西和湖南南部地區(qū)夏播種植。

pYLgRNA載體是由pUC18載體為骨架改造而成, 大小約3 kb (圖1-A)。pYLCRISPR/Cas9-DB載體大小約15.5 kb, 含有一個(gè)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Bar基因、35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cas9基因、終止子、ccdB大腸桿菌致死基因(圖1-B)。Cas9載體pYLCRISPR/Cas9-DB及gRNA載體pYLgRNA-AtU3d/AtU3b/AtU6-1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光研究院饋贈(zèng)[31]。

1.2 gRNA靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)大豆基因組中GmFAD2-1A基因的外顯子序列, 利用 CRISPRdirect網(wǎng)站(http：//crispr.dbcls.jp/)設(shè)計(jì)3個(gè)長(zhǎng)度為20 bp的靶位點(diǎn)序列(圖2), 分別為FAD-AtU3d-T1-F1/FAD-AtU3d-T1-R1、FAD-AtU3b-T2-F2/FAD-AtU3b-T2-R2、FAD-AtU6-1-T3-F3/FADAtU6-1-T3-R3 (表 1)。同時(shí)設(shè)計(jì) CRISPR鑒定引物FAD2-1A-CasF-Test/FAD2-1A-CasR-Test (表 1), 所有寡核苷酸鏈引物均由睿博測(cè)序公司合成。

圖1 pYLgRNA及pYLCRISPR/Cas9-DB質(zhì)粒圖Fig. 1 Maps of pYLgRNA and pYLCRISPR/Cas9-DB vectors

圖2 3個(gè)靶點(diǎn)分別在GmFAD2-1A基因內(nèi)的位置Fig. 2 Positions of three targets in the GmFAD2-1A gene locus

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 三靶點(diǎn) pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA載體的構(gòu)建

參照劉耀光研究員提供的實(shí)驗(yàn)指南, 方法如下：(1)靶點(diǎn)接頭制備。將接頭正反向引物用 TE buffer稀釋到1 μmol L-1, 90℃ 30 s后移至室溫冷卻完成退火。(2) gRNA載體酶切與連接反應(yīng)。配制10 μL反應(yīng)體系, 包括1 μL接頭、10 ng gRNA質(zhì)粒、5 UBsaI、35 U T4 DNA ligase、1 μL 10×buffer for T4 DNA ligase, PCR反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 5 min, 20 ℃ 5 min, 5個(gè)循環(huán)。(3)擴(kuò)增 gDNA表達(dá)盒。第一輪擴(kuò)增取 1 μL連接產(chǎn)物為模板, 適量高保真 PCR酶, 通用引物U-F/gRNA-R (表 1)各 0.2 μmol L-1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 1 5 s, 55 ℃ 1 5 s, 68 ℃ 1 0 s, 10個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 5 s, 68℃ 1 0 s, 17～20個(gè)循環(huán)。各取4 μL電泳檢查。第二輪擴(kuò)增取第一輪PCR產(chǎn)物1 μL稀釋20倍, 取 1 μL 為模板, 各表達(dá)盒 20～50 μL PCR, 分別利用引物 B1’/B2、B2’/B3、B3’/BL (表 1)對(duì) gDNA進(jìn)行擴(kuò)增。95 ℃ 1 0 s, 60 ℃ 1 5 s, 68 ℃ 3 0 s, 18～25個(gè)循環(huán)。各取2 μL電泳檢查產(chǎn)物長(zhǎng)度是否符合。(4)產(chǎn)物純化、酶切和連接。將所有靶點(diǎn)gDNA PCR產(chǎn)物參照全式金公司膠回收試劑盒混合后回收, 取約20～70 ng膠回收產(chǎn)物, 加入約 40～60 ng未切割的pYLCRISPR/Cas9 質(zhì)粒, 在 15 μL 反應(yīng)用 5～10 UBsaI 37℃酶切 10 min, 然后加 1.5 μL 10×buffer for T4 DNA ligase和35 U T4 DNA ligase, 用變溫循環(huán) 酶切連接, 37 ℃ 5 min, 10 ℃ 5 min, 20 ℃ 5 min, 10～15個(gè)循環(huán)。(5)轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒測(cè)序。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞后, 挑取單克隆接種培養(yǎng), 抽提質(zhì)粒后利用AscI酶切鑒定, 并挑取酶切驗(yàn)證正確的克隆送睿博公司測(cè)序。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA101以備大豆遺傳轉(zhuǎn)化。pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA載體構(gòu)建如圖3所示。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法構(gòu)建大豆轉(zhuǎn)基因材料[32], 選用大豆品種 H3為受體材料,實(shí)驗(yàn)中用到的培養(yǎng)基見(jiàn)表2。利用氯氣對(duì)大豆表面滅菌, 在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中, 將大豆種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上, 16 h/8 h (光/暗), 溫度為25℃, 濕度為60%的培養(yǎng)室培養(yǎng)1～3 d后, 在子葉節(jié)處用手術(shù)刀片創(chuàng)造傷口, 用農(nóng)桿菌侵染液(OD650nm≈ 0.6), 在28℃的搖床中, 侵染30 min。隨后, 將子葉放于表面附有滅菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中, 25 ℃ , 16 h/8 h 光暗條件下共培養(yǎng)4 d, 轉(zhuǎn)移B5芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽。4周后, 不定芽經(jīng)芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為25℃ , 16 h/8 h光暗周期。待其伸長(zhǎng)大約達(dá)到5～7 cm時(shí), 再將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根, 根系健壯后移到土里, 獲得轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA載體構(gòu)建示意圖Fig. 3 Schematic diagram of the pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA vector construction

表2 大豆遺傳轉(zhuǎn)化中使用的培養(yǎng)基及成分Table 2 Mediums and compositions in soybean transformation

(續(xù)表 2)

1.5 轉(zhuǎn)基因大豆 T1代植株抗草銨膦篩選、PCR鑒定及測(cè)序

將獲得的轉(zhuǎn)基因植株T0代種子以及對(duì)照H3種子, 種植于16 h/8 h (光照/黑暗)、濕度為60%的溫室中, 當(dāng) T1代植株長(zhǎng)出第 1片三出復(fù)葉時(shí), 選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的嫩葉, 用毛筆蘸取濃度為150 mg L-1的草銨膦溶液, 對(duì)其中1/3葉片進(jìn)行均勻的涂抹, 初步篩選抗草銨膦的植株。參照康為世紀(jì)公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒(NuClean Plant Genomic DNA Kit)說(shuō)明書(shū), 提取轉(zhuǎn)基因大豆和對(duì)照 H3的基因組DNA, 并以DNA為模板, 用Bar-F/R引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 檢測(cè)出陽(yáng)性植株。以篩選出的陽(yáng)性植株DNA為模板, 用 FAD2-1A-CasF-Test/FAD2-1ACasR-Test靶點(diǎn)鑒定引物(表 1)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 并將PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.6 品質(zhì)分析及農(nóng)藝性狀調(diào)查

分別選取100粒T3代純合GmFAD2-1A突變體大豆種子和對(duì)照大豆品種華夏 3號(hào), 委托東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 采用氣相色譜法檢測(cè)脂肪酸各組分的含量[33], 福斯谷物分析儀(INFRATEC1241)檢測(cè)總脂肪(%)及總蛋白含量(%), 試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。農(nóng)藝性狀包括株高、主莖節(jié)數(shù)、單枝分枝數(shù)、葉形、花色、種皮色、種臍色和生育期。

2 結(jié)果與分析

2.1 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA載體的構(gòu)建

根據(jù) CRISPR/Cas9技術(shù)的原理, 構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA表達(dá)載體, 將pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,經(jīng)菌落PCR鑒定(圖4-A) 3～7號(hào)為陽(yáng)性單克隆, 挑取3號(hào)單克隆接種培養(yǎng), 抽提質(zhì)粒后利用AscI進(jìn)行酶切鑒定, 如圖 4-B所示, 切出的目的片段大小約為1.5 kb左右, 表明FAD2-1A的3個(gè)靶點(diǎn)gRNA表達(dá)盒順利插入到pYLCRISPR/Cas9載體上。為進(jìn)一步確定靶位點(diǎn)的準(zhǔn)確性, 通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)構(gòu)建載體上的各靶點(diǎn)測(cè)序, 得到完全一致的序列, 表明表達(dá)載體構(gòu)建成功, 可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 重組質(zhì)粒鑒定Fig. 4 Identification of recombinant plasmids

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

用制備好的含有 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1A-gRNA載體的農(nóng)桿菌侵染液侵染大豆的子葉節(jié), 經(jīng)萌發(fā)、暗培養(yǎng)、恢復(fù)、篩選培養(yǎng)、伸長(zhǎng)培養(yǎng)和生根培養(yǎng)后移入無(wú)菌土中保溫保濕培養(yǎng)(圖 5-A)。涂抹草銨膦后, T0代轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)草銨膦產(chǎn)生抗性, 葉片表面無(wú)明顯變化(圖5-B-a), 而未轉(zhuǎn)化成功的大豆, 則葉片表面發(fā)黃, 干枯(圖5-B-b)。選取T0代涂抹草銨膦后無(wú)明顯反應(yīng)的3棵植株, 擴(kuò)繁種子, 共獲得5粒T0代種子。

2.3 GmFAD2-1A大豆突變體的鑒定

圖5 轉(zhuǎn)化過(guò)程及葉片涂抹草銨膦篩選結(jié)果Fig. 5 Conversion process and the results of leaf painting

圖6 GmFAD2-1A突變體鑒定Fig. 6 Identification of GmFAD2-1A mutant

提取 T1代轉(zhuǎn)基因大豆葉片的總 DNA, 以CRISPR/Cas9載體上含有的外源標(biāo)記Bar基因引物對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 檢測(cè)結(jié)果顯示, T1代5株轉(zhuǎn)基因植株均為陽(yáng)性植株(圖6-A)。利用靶點(diǎn)篩選引物 FAD2-1A-CasF-Test/FAD2-1A-CasR-Test (表 1),對(duì)T1代陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 連接T載體后測(cè)序發(fā)現(xiàn), 僅編號(hào)為4的植株發(fā)生編輯(以下稱(chēng)GmFAD2-1Amutant), 該突變體僅在靶點(diǎn)1發(fā)生編輯(圖6-B)：在靶點(diǎn)位置由堿基CATT替換成ACGA, AC替換成CT, 插入 4個(gè)堿基 GAAC； 并且在靶點(diǎn)位置后由堿基GCC替換成TTT, 插入1個(gè)T堿基。該靶點(diǎn)堿基突變導(dǎo)致FAD2-1A的蛋白移碼突變(圖6-C)。

2.4 GmFAD2-1A大豆突變體品質(zhì)分析及農(nóng)藝性狀調(diào)查

GmFAD2-1A突變體大豆株系在株高、主莖節(jié)數(shù)、單枝分枝數(shù)、葉形、花色、種皮色、種臍色、生育期等方面與對(duì)照品種H3沒(méi)有明顯差異(表3和圖 7-A), 表明GmFAD2-1A基因的突變對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的農(nóng)藝性狀表型沒(méi)有影響。GmFAD2-1A突變體的油酸含量為 23%, 極顯著高于對(duì)照品種 H3 (20%),而亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸極顯著降低, 亞麻酸沒(méi)有顯著變化(圖7-B), 表明GmFAD2-1A基因是調(diào)控大豆種子油酸含量的關(guān)鍵基因。轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白和脂肪含量分別為 40.61%和 20.50%, 與對(duì)照品種H3無(wú)顯著差異(表3), 表明利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制油酸含量的GmFAD2-1A基因定點(diǎn)編輯沒(méi)有顯著影響轉(zhuǎn)基因大豆種子中總蛋白和總脂肪的積累。

3 討論

隨著人口的增長(zhǎng)和生活水平的提高, 中國(guó)對(duì)大豆產(chǎn)品的品質(zhì)需求不斷增加, 因此改善大豆品質(zhì),提高大豆?fàn)I養(yǎng)成分是大豆育種的主要目標(biāo)之一。油酸含量高的油非常有益于健康, 油酸可以降低人體血液中有害的低密度脂蛋白, 而對(duì)有益的高密度脂蛋白沒(méi)有影響[34-35]。油酸含量高的油中多不飽和脂肪酸含量低, 在加工過(guò)程不需要加氫除去多不飽和脂肪酸, 從而有效避免產(chǎn)生對(duì)人體有害的反式脂肪酸[36]。油酸具有強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性, 適于煎炸烹炒。橄欖油(油酸 73%)因其油酸含量高而被認(rèn)為是一種有益人體健康的食用油。但由于國(guó)內(nèi)不能生產(chǎn)橄欖, 橄欖油全部進(jìn)口于地中海國(guó)家, 價(jià)格昂貴, 普通百姓難以消費(fèi)。因此高油酸大豆油國(guó)產(chǎn)化, 具有價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì), 可替代橄欖油。

圖7 GmFAD2-1A突變體表型及其脂肪酸組分含量Fig. 7 GmFAD2-1A mutants phenotype and the fatty acids content

大量研究表明, 抑制大豆種子中控制油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵酶基因FAD2-1的表達(dá), 可以有效提高大豆種子中的油酸含量[16-22]。但目前卻沒(méi)有可以大量推廣到市場(chǎng)上的高油酸大豆。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)編輯大豆FAD2-1A基因, 獲得了油酸含量達(dá) 23%的純合突變體大豆, 其油酸含量極顯著高于對(duì)照 H3, 該結(jié)果與前人研究基本相同。不同的是, 本研究利用 CRISPR/Cas9技術(shù)獲得穩(wěn)定遺傳, 且無(wú)外源基因骨架的FAD2-1A突變體大豆植株。本實(shí)驗(yàn)選擇的大豆受體品種H3為廣東、廣西、海南、福建中南部等低緯度地區(qū)大面積推廣種植的大豆品種, 前景廣闊。同時(shí)本研究所獲得的大豆突變體材料與受體材料有著相同的分枝性好, 株型健壯, 具有豐產(chǎn)性突出、綜合抗性好的優(yōu)點(diǎn)。

近年來(lái), CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展越來(lái)越完善, 與前兩代基因編輯技術(shù)ZFNs和TALENs相比, 用RNA替代組裝蛋白, 實(shí)現(xiàn)與靶基因的特異性識(shí)別與結(jié)合, 使得該技術(shù)構(gòu)建簡(jiǎn)單靈活[23]。因此,CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興的快速、穩(wěn)定、廉價(jià)的基因編輯技術(shù), 未來(lái)將會(huì)更加廣泛應(yīng)用于育種。

目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系中的外植體有很多, 但子葉節(jié)再生體系應(yīng)用最為廣泛和成熟[37]。自從該系統(tǒng)首次由Cheng等[38]報(bào)道以后的幾十年間,眾多科研工作者對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了改良和優(yōu)化[37,39]。這個(gè)體系具有取材不受時(shí)間限制、周期短、再生植株遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn), 其缺點(diǎn)也很明顯, 如再生苗嵌合體多, 篩選困難, 對(duì)培養(yǎng)條件和操作技術(shù)要求較高。雖然大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率已經(jīng)提高了很多, 但相對(duì)于水稻、玉米等其他作物, 大豆的轉(zhuǎn)化效率仍然較低, 因此建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)仍然是大豆研究者亟需解決的問(wèn)題。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9技術(shù), 獲得適合低緯度種植的高油酸大豆新種質(zhì)GmFAD2-1A突變體。與受體品種華夏3號(hào)(H3)相比,GmFAD2-1A突變體的油酸含量由20%提高到23%, 達(dá)到極顯著水平, 同時(shí),GmFAD2-1A突變體農(nóng)藝性狀與華夏3號(hào)沒(méi)有顯著差異。