陶 茸，師尚禮，張翠梅，陳建綱，王曉瑛

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

根系不僅是植物吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的重要器官，也是最先感受土壤逆境脅迫的重要部位，其生長發(fā)育是遺傳因子、外部生物和非生物因素共同刺激作用的結(jié)果[1-3]。結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，植物結(jié)構(gòu)的變化必然會影響到生理生態(tài)功能的改變，而根系解剖結(jié)構(gòu)是根系發(fā)育水平的直接體現(xiàn)，與生理功能關(guān)系密切，木質(zhì)化程度、輸導(dǎo)組織、表皮的附屬結(jié)構(gòu)等會影響植物抵抗逆境的能力[1,4-5]。植物的防御準(zhǔn)備過程在啟動了分子信號的同時，也會分泌植物抗毒素—香豆素[6]。陶茸、蔡登高等[7,8]指出香豆素不僅影響苜蓿種子萌發(fā)，還影響其幼苗氮代謝和氨同化的關(guān)鍵酶，導(dǎo)致苜蓿體內(nèi)養(yǎng)分缺失。王婧怡等[9]發(fā)現(xiàn)100 μg·mL-1的香豆素水溶液通過改變蘇丹草(Sorghumsudanense)抗氧化酶系統(tǒng)、影響酶活性、破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等途徑調(diào)節(jié)蘇丹草的生長，姚丹丹[10]則認(rèn)為該濃度下的香豆素水溶液只能在多花黑麥草(Loliummultiflorum)種子發(fā)芽和幼苗生長初期可以很大限度地起到抑制作用，但不足以致死。也有研究表明，40 μg·mL-1的香豆素水溶液能顯著抑制紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、多花黑麥草、紅三葉(Trifoliumpratense)、萵苣(LactucasativaL.)、萹蓄(PolygonumaviculareL)、銅綠微囊藻(Aeruginosa)等植物種子萌發(fā)和幼苗生長[11-14]。咖啡酸在一定濃度下能夠誘導(dǎo)萵苣體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和積累，降低幼苗根尖細(xì)胞活力，進(jìn)而影響萵苣幼苗的生長發(fā)育，對銅綠微囊藻也具有明顯的生長抑制效應(yīng)[15-16]。

苜蓿作為多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，具有一次種植、多年收獲、產(chǎn)草量高、營養(yǎng)豐富和適口性好等特點，有“牧草之王”之稱[7]，田晨霞等[17-19]研究了紫花苜蓿葉片及根系的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)對鹽堿脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫以及氮素水平的適應(yīng)反應(yīng)，從不同程度揭示了土壤環(huán)境對苜蓿葉片和根系的脅迫可能造成葉片、根系形態(tài)建成及內(nèi)部輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性改變，從而影響植物對養(yǎng)分的吸收和利用。也有研究表明，連茬種植的苜蓿種子由于自毒作用不能正常發(fā)育，很難建植成功[20]。香豆素、綠原酸、香豆酸、羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸等酚類物質(zhì)是造成紫花苜蓿自毒作用的主要物質(zhì)[21-26]，在苜蓿植株體內(nèi)隨著生育時期而不斷累積[27-28]，對多數(shù)植物的萌發(fā)和生長產(chǎn)生抑制作用。然而香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態(tài)建成與解剖結(jié)構(gòu)的影響鮮見報道，本研究采用營養(yǎng)液沙培法研究紫花苜蓿主要自毒物質(zhì)香豆素、咖啡酸及兩者混合物對紫花苜蓿生長早期根系形態(tài)建成與解剖結(jié)構(gòu)的影響，揭示紫花苜蓿根系外部形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，以期為深入探討香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿生長和發(fā)育影響的機理提供依據(jù)，為有效緩解和解決苜蓿自毒障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘農(nóng)9號紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Gannong No.9’)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實驗室提供，發(fā)芽率為96.83%。

藥劑:香豆素(Coumarin)、咖啡酸(Caffeic acid)均為分析純品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，混合物由香豆素、咖啡酸按1∶1比例配制，試驗設(shè)計中香豆素、咖啡酸及其兩者混合物分別用字母C，CF和M表示(見表1)。

1.2 試驗方法

試驗在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室進(jìn)行，采用營養(yǎng)液沙培法，選用經(jīng)高溫滅菌(121℃，6 h)的等量細(xì)沙，將其裝入營養(yǎng)缽(下口內(nèi)徑12 cm，上口內(nèi)徑18 cm，高度為15 cm)中，擺放在水培盒(長×寬×高為45 cm×18 cm×10 cm)中，置于光照培養(yǎng)室(每天光照14 h，光通量密度400 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度分別為(25±1)℃和(20±1)℃，相對濕度60%左右)[29]。將供試種子經(jīng)75%酒精消毒后選30粒均勻播種在營養(yǎng)缽中，出苗后間苗，每缽保留生長一致的幼苗20株，每3 d澆灌Hoagland營養(yǎng)液300 mL，確保幼苗正常生長，于幼苗4葉期(播種10 d后)每處理施加以Hoagland營養(yǎng)液為母液的外源香豆素、咖啡酸及混合酚酸處理液600 mL進(jìn)行處理，處理液濃度梯度依據(jù)前人研究結(jié)果[6-11]，結(jié)合預(yù)試驗設(shè)定為0.5，5，50，500 mg·L-1(詳見表1)，以施加600 mL不添加外源香豆素和咖啡酸的Hoagland營養(yǎng)液處理為對照(CK)，每處理重復(fù)3次。為確?；ㄅ杼幚硪簼舛缺３植蛔?，每隔1 d給培養(yǎng)盒新添加處理液至600 mL，每7 d用蒸餾水淋洗1次培養(yǎng)盒，并施加新配置營養(yǎng)液。連續(xù)處理28 d時，選擇3個長勢基本一致的植株根進(jìn)行取材，取根莖下1～2 cm處根段，立即放入FAA固定液(70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福爾馬林5 mL)中，固定24 h以上[18]，分別測定根粗、皮層厚度、中柱直徑、導(dǎo)管數(shù)量及面積等解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)。

表1 香豆素和咖啡酸處理配比Table 1 The treatments of coumarin and caffeic acid

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1根系形態(tài)指標(biāo) 用蒸餾水洗凈各處理根系，置于盛有去離子水的無色透明水槽中，用鑷子調(diào)整根位置避免交叉重疊，使用臺式掃描儀(EPSON Experssion)進(jìn)行掃描，再用根系分析系統(tǒng)(Win Rhizo Pro 2004a)分析掃描的圖片，獲得根系總長度、根表面積、總根體積和根平均直徑等形態(tài)指標(biāo)相關(guān)數(shù)據(jù)，每處理重復(fù)3次。

1.3.2根系解剖結(jié)構(gòu) 利用石蠟切片技術(shù)觀察苜蓿幼苗根系解剖結(jié)構(gòu)，參考李正理[30]、李和平[31]的方法對所取材料進(jìn)行固定、脫水、透明、滲蠟、包埋、切片、脫蠟與復(fù)水、染色和封片。使用生物光學(xué)顯微鏡(Zeiss Axioskop40 Germany)觀察石蠟切片中根系解剖結(jié)構(gòu)，并用Axio-Vision軟件測量與計算維管束、導(dǎo)管面積、表皮厚度、皮層厚度等，每個處理選取3個樣本，每個樣本隨機取10個視野求平均值，并記錄導(dǎo)管數(shù)量[18]。

1.3.3自毒效應(yīng)敏感指數(shù)(The allelopathic response index，RI)，采用Williamson[32]公式

RI=(T-C)/T(T≥C)或RI=(T-C)/C(T

其中C為對照值，T為處理值，當(dāng)RI>0時，為促進(jìn)作用；當(dāng)RI<0時，為抑制作用，RI絕對值的大小表示自毒作用強度。

自毒綜合效應(yīng)((The synthetical autotoxicity effects，SE)：表示自毒作用的綜合效應(yīng)，SE是供體對同一受體多個測試項目的自毒效應(yīng)敏感指數(shù)RI的算術(shù)平均值[33-34]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010應(yīng)用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并制作圖表；采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncan法進(jìn)行顯著性比較；采用Photoshop CS 8軟件進(jìn)行圖片合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源香豆素和咖啡酸對苜蓿幼苗根系形態(tài)建成的影響

2.1.1對苜蓿幼苗根長的影響 由圖1可以看出，與對照相比，紫花苜?？偢L在高于5 mg·L-1的C處理和高于50 mg·L-1的CF及M處理下顯著降低(P<0.05)。紫花苜蓿根長隨著C處理濃度的升高而降低，50 mg·L-1和500 mg·L-1處理與對照相比分別降低18.78%和82.35%，差異顯著(P<0.05)。CF處理濃度在0～50 mg·L-1范圍內(nèi)，紫花苜?？偢L隨著處理濃度的升高而增長，但與對照相比差異不顯著(P>0.05)，當(dāng)其處理濃度增至500 mg·L-1時，苜蓿幼苗根系嚴(yán)重發(fā)黑、干枯、腐爛。當(dāng)M處理濃度為0.5 mg·L-1時，苜蓿根系總長與對照相比提高11.09%，但差異不顯著(P>0.05)，總根長隨著處理濃度的升高而降低，當(dāng)處理濃度增至500 mg·L-1，總根長顯著降低(P<0.05)，比對照降低61.63%。

2.1.2對苜蓿幼苗根表面積的影響 C，CF及M處理對紫花苜蓿根表面積的抑制作用在高濃度下更明顯(圖2)。當(dāng)處理濃度低于50 mg·L-1時，3種外源添加物對苜蓿幼苗根表面積的抑制作用不明顯，與對照相比差異均不顯著(P>0.05)，當(dāng)添加物濃度增至500 mg·L-1，C，CF及M處理下苜蓿幼苗根表面積與對照相比分別降低45.77%，22.47%和42.34%，均差異顯著(P<0.05)。綜上，500 mg·L-1及以上濃度的香豆素、咖啡酸及其混合物處理顯著抑制紫花苜蓿根表面積的增加。

圖1 香豆素和咖啡酸對紫花苜?？偢L的影響Fig.1 Effects of coumarin and caffeic acid on the total root length of alfalfa注：不同小寫字母注釋添加物與對照間差異顯著(P<0.05)。下同Note:Different small letters indicate significant difference between additions and controls at the 0.05 level. The same as below

圖2 香豆素和咖啡酸對紫花苜?？偢砻娣e的影響Fig.2 Effects of coumarin and caffeic acid on the total root surface area of alfalfa

2.1.3對苜蓿幼苗根體積的影響 如圖3所示，紫花苜蓿根體積在高濃度C，CF處理下與對照相比顯著降低(P<0.05)，低濃度處理下與對照相比差異不顯著(P>0.05)，M處理紫花苜蓿根體積生長的趨勢呈現(xiàn)出明顯的低促高抑，C處理的濃度為50 mg·L-1時，紫花苜蓿根尖發(fā)黑、根變形嚴(yán)重、增粗、體積最大，但與對照相比差異不顯著(P>0.05)，當(dāng)其處理濃度增至500 mg·L-1時，其根嚴(yán)重受損，體積顯著低于對照71.15%(P<0.05)。CF處理濃度為50 mg·L-1及以上時，紫花苜蓿的根體積比對照降低了34.23%，差異顯著(P<0.05)。M處理下，0.5 mg·L-1的濃度處理使紫花苜蓿根體積比對照增加了45.79%，差異顯著(P<0.05)，但其根體積隨著處理濃度的升高而減小，當(dāng)其處理濃度增至50 mg·L-1時，根體積比對照降低了26.17%，差異顯著(P<0.05)。綜上，CF和M處理抑制苜蓿根體積增大的臨界濃度是50 mg·L-1，C處理是500 mg·L-1，但C處理的苜蓿根在50 mg·L-1濃度下，嚴(yán)重畸形、增粗、表皮粗糙甚至破裂，不利于苜蓿根系正常生長。0.5 mg·L-1的M處理顯著促進(jìn)了苜蓿根體積增加。

圖3 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根體積的影響Fig.3 Effects of coumarin and caffeic acid on the root volume of alfalfa

2.1.4對苜蓿幼苗根尖數(shù)的影響 與對照相比，高濃度的C和CF處理顯著降低了苜蓿的根尖數(shù)，M處理對苜蓿根尖數(shù)表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)，高濃度抑制趨勢(圖4)。C處理下，50，500 mg·L-1的濃度處理使苜蓿根尖數(shù)比對照分別降低了40.47%和90.15%，差異均顯著(P<0.05)。CF處理下，500 mg·L-1的濃度處理使苜蓿根尖數(shù)比對照降低了56.5%，差異顯著(P<0.05)，其余處理與對照差異均不顯著。M處理下，0.5 mg·L-1的濃度處理使苜蓿根尖數(shù)比對照增長了42.67%，隨著處理濃度的增加，根尖數(shù)逐漸減少，當(dāng)處理濃度增至500 mg·L-1時，根尖數(shù)比對照減少了67.03%，差異顯著(P<0.05)。綜上所述，高于50 mg·L-1的C處理和高于500 mg·L-1的CF，M處理均顯著抑制苜蓿根尖數(shù)的增長，而0.5 mg·L-1的M處理顯著增加了苜蓿根尖數(shù)，促進(jìn)苜蓿根尖生長。

圖4 香豆素、咖啡酸對紫花苜蓿根尖數(shù)的影響Fig.4 Effects of coumarin and caffeic acid on the number of alfalfa root tip

2.2 外源香豆素、咖啡酸對苜蓿幼苗根系解剖結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1對根粗的影響 由圖5可知，C，CF和M處理在低濃度時，對苜蓿根直徑的增加有一定的促進(jìn)作用，高濃度處理時均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。C處理下，隨著處理濃度的逐漸增大，苜蓿根直徑逐漸增大，50 mg·L-1的濃度處理時，苜蓿根直徑比其對照增長了14.56%，差異顯著(P<0.05)，但根畸形增粗，表皮粗糙甚至破裂。當(dāng)其濃度增至500 mg·L-1時，根嚴(yán)重受損，干枯，腐爛嚴(yán)重，根直徑減小，顯著低于對照處理(P<0.05)。CF處理下，50 mg·L-1及高于該濃度作用時，苜蓿的根直徑明顯減小，比對照降低12.03%，且差異顯著(P<0.05)。M處理下，0.5 mg·L-1的濃度處理明顯促進(jìn)苜蓿根直徑增長，使其根直徑比對照增加9.89%，隨著處理濃度的增加，苜蓿根直徑逐漸降低，當(dāng)其濃度增至50 mg·L-1時，苜蓿根直徑直線下降，比對照顯著降低20.52%(P<0.05)。綜上，CF和M處理抑制苜蓿根粗增大的臨界濃度是50 mg·L-1，C處理是500 mg·L-1，但C處理的苜蓿根在50 mg·L-1濃度作用下，嚴(yán)重畸形、增粗、表皮破裂嚴(yán)重。500 mg·L-1濃度處理下，C，CF和M處理的苜蓿根直徑均顯著降低。

圖5 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根粗的影響Fig.5 Effects of coumarin and caffeic acid on the root diameter of alfalfa

2.2.2對根皮層發(fā)育的影響 C，CF和M處理作用于苜蓿根系，根皮層厚度呈現(xiàn)低濃度降低高濃度增加的趨勢，與皮層厚度與根半徑之比的變化趨勢基本一致，但不同處理間存在差異性(圖6)。C處理下，50 mg·L-1濃度時，皮層厚度顯著增大，皮層細(xì)胞排列緊密，比對照增加2.94%，且差異顯著(P<0.05)，500 mg·L-1濃度處理的皮層厚度與根半徑之比最大，比對照高14.75%，且差異顯著(P<0.05)。CF處理下，50 mg·L-1濃度時，皮層厚度與根半徑之比顯著高于對照，當(dāng)處理濃度增至500 mg·L-1時，苜蓿皮層厚度、皮層厚度與根半徑之比均最大，分別比對照提高31.81%和61%，且差異顯著(P<0.05)。M處理下，500 mg·L-1濃度時，苜蓿皮層厚度、皮層厚度與根半徑之比分別比對照提高25.88%和37.11%，差異顯著(P<0.05)，0.5 mg·L-1濃度時，皮層厚度與根半徑之比顯著低于對照(P<0.05)。可見，紫花苜蓿在較高濃度的自毒物質(zhì)香豆素、咖啡酸和混合物作用下，增加根部皮層厚度抵制外源添加物的抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身生長和發(fā)育。C處理使根皮層厚度明顯增加的臨界值為50 mg·L-1，CF和M的臨界值為500 mg·L-1，表明在較高濃度處理時，C處理對苜蓿根皮層的抑制作用高于CF和M處理近10倍。

2.2.3對根系中柱發(fā)育的影響 3種外源添加物濃度低于5 mg·L-1的處理對苜蓿根中柱直徑的影響均不明顯，但導(dǎo)管數(shù)量及面積因外源添加物的種類不同呈現(xiàn)出不同的規(guī)律，隨著添加物濃度的增加，苜蓿根中柱直徑、中柱直徑與根直徑之比均呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(圖7)。C處理下，添加物濃度為50 mg·L-1時，導(dǎo)管數(shù)量增加25.89%，中柱直徑與根直徑之比降低，均與對照差異顯著(P<0.05)。CF處理下，添加物濃度為5 mg·L-1時，導(dǎo)管數(shù)量和導(dǎo)管面積比其對照分別提高了36.84%和33.4%，且差異顯著(P<0.05)，當(dāng)濃度增至50 mg·L-1時，其根中柱直徑，中柱直徑與根直徑之比較對照分別顯著降低33.81%和24.65%(P<0.05)，但導(dǎo)管數(shù)量和導(dǎo)管面積與對照差異不顯著(P>0.05)。M處理下，添加物濃度為0.5 mg·L-1時，苜蓿根中柱直徑、導(dǎo)管數(shù)量和導(dǎo)管面積均最大，較其對照分別增加26.4%，35.2%和37.49%，顯著高于對照。當(dāng)其處理濃度增至50 mg·L-1及以上時，苜蓿的根中柱直徑、中柱直徑與根直徑之比及導(dǎo)管數(shù)量均顯著低于對照處理(P<0.05)，可見，低濃度(0.5 mg·L-1)的M處理明顯促進(jìn)了根中柱內(nèi)導(dǎo)管的發(fā)育，使根變粗、根系發(fā)達(dá)。綜上所述，當(dāng)3種外源添加物濃度為50 mg·L-1時，苜蓿根中柱直徑與根直徑之比均顯著降低，C處理的導(dǎo)管數(shù)量顯著增加，CF處理導(dǎo)管面積顯著增加，M處理的導(dǎo)管數(shù)量和面積均顯著降低。

圖7 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根中柱的影響Fig.7 Effects of coumarin and caffeic acid on the root stele of alfalfa

2.3 外源香豆素、咖啡酸對苜蓿幼苗根系形態(tài)建成和解剖結(jié)構(gòu)的自毒及綜合效應(yīng)

如表2所示，香豆素、咖啡酸及其混合物對苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的自毒效應(yīng)不同，同種外源添加物對苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的自毒作用強度與濃度密切相關(guān)。C處理下，0.5 mg·L-1濃度時，苜蓿根外部形態(tài)(總根長除外)、內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)(導(dǎo)管數(shù)除外)的RI>0，表明0.5 mg·L-1的C處理對苜?？偢砻娣e、根體積、根尖數(shù)、根粗、中柱直徑/根直徑及導(dǎo)管面積的發(fā)育均有促進(jìn)作用。添加物濃度在5～50 mg·L-1時對苜蓿根粗和導(dǎo)管數(shù)量與對照相比有顯著促進(jìn)作用，但對總根長和根尖數(shù)有顯著抑制作用(P<0.05)。CF處理下，5 mg·L-1及低于該濃度時，苜蓿根外部形態(tài)(根尖數(shù)除外)的RI>0，5 mg·L-1濃度處理時苜蓿內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的RI>0，表明較低濃度的CF作用下，除根尖數(shù)外，苜蓿根外部形態(tài)，各項指標(biāo)均得到促進(jìn)，5 mg·L-1時苜蓿內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的各項指標(biāo)均得到促進(jìn)；50 mg·L-1濃度時，對苜蓿根體積、根粗及中柱直徑/根直徑與對照相比有顯著抑制作用，對導(dǎo)管數(shù)和導(dǎo)管面積有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。M處理下，5 mg·L-1及低于該濃度時，對苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其中對苜蓿根體積、根尖數(shù)、根粗和導(dǎo)管數(shù)的促進(jìn)作用與對照相比差異顯著，50 mg·L-1及高于該濃度時，對苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為抑制作用，其中對苜蓿根體積、根粗、中柱直徑/根直徑及導(dǎo)管數(shù)與對照相比呈現(xiàn)出顯著抑制作用(P<0.05)。當(dāng)外源添加物的濃度增加至500 mg·L-1時，C，CF和M處理苜蓿幼根均發(fā)黑，出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷和腐爛，顯著抑制苜蓿根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)。綜上所述，M處理對苜蓿幼根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用，C和CF處理整體呈現(xiàn)高濃度(500 mg·L-1)抑制的效應(yīng)。

表2 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)的自毒效應(yīng)Table 2 Autotoxic effects of coumarin and caffeic acid on the root morphology and anatomical structure of alfalfa

注：*表示與對照之間差異顯著，P<0.05

Note:* in the table indicate significant difference at the 0.05 level compared to the control

圖8 ‘甘農(nóng)9號’紫花苜蓿不同外源添加物處理下根解剖結(jié)構(gòu)圖Fig.8 Root anatomical structure photograph of 'Gannong No.9' alfalfa under different exogenous additives

圖9 香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿根系形態(tài)(左)和解剖結(jié)構(gòu)(右)的自毒綜合效應(yīng)Fig.9 Comprehensive autotoxic effects of coumarin and caffeic acid on the root morphology(left) and anatomical structure(right) of alfalfa注：圖中不同小寫字母表示C,CF和M處理間的差異性，P<0.05Note：Different small letters indicate significant difference among C,CF and M treatments at the 0.05 level

3種外源添加物對苜蓿根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)的生長發(fā)育均呈現(xiàn)出比較明顯的高濃度抑制效應(yīng)(圖9)。當(dāng)處理濃度為0.5 mg·L-1時，C和CF處理對苜蓿根外部形態(tài)具有一定的促進(jìn)作用，M處理對苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)具有明顯的促進(jìn)作用，且均與C和CF處理差異顯著(P<0.05)。5 mg·L-1的CF和M處理均促進(jìn)苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的生長和發(fā)育，但兩者之間差異不顯著，該濃度處理下C對苜蓿根外部形態(tài)發(fā)育表現(xiàn)出抑制作用。隨著處理濃度的增加，CF和M對兩類指標(biāo)均表現(xiàn)出抑制作用，但50 mg·L-1的C處理對苜蓿根解剖結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)作用，并與M處理差異顯著，這主要是因為該處理下苜蓿根粗和導(dǎo)管數(shù)量明顯增加所致，然而中柱內(nèi)細(xì)胞排列混亂且存在畸形(圖8)，反而不利于根對水分和養(yǎng)分的吸收，使其根長和根尖數(shù)顯著低于對照(P<0.05)。當(dāng)處理濃度增至500 mg·L-1時，3種添加物對苜蓿幼根各項指標(biāo)的抑制效應(yīng)最強，C，CF和M處理對苜蓿幼根外部形態(tài)的自毒綜合效應(yīng)指數(shù)分別為-0.73，-0.41和-0.58，對苜蓿根內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的自毒綜合效應(yīng)指數(shù)分別為-0.46，-0.26和-0.42，其中C處理對苜蓿根各項指標(biāo)的抑制效應(yīng)顯著強于CF處理，M處理對苜蓿根內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的抑制效應(yīng)顯著強于CF。綜上所述，3種外源添加物對苜蓿的根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的自毒抑制綜合效應(yīng)由強到弱依次為：C處理>M處理>CF處理。

3 討論

本研究結(jié)果表明，較高濃度(50 mg·L-1)外源香豆素、咖啡酸及其混合物處理苜蓿幼苗，其幼根皮層厚度及皮層厚度與根半徑之比均有增加現(xiàn)象，可能是在該濃度處理下紫花苜蓿通過增加根部皮層厚度來抵制外源香豆素和咖啡酸對其抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身生長和發(fā)育。植物木質(zhì)部中的導(dǎo)管，主要起輸導(dǎo)水分和支持作用，趙祥等[35]認(rèn)為，導(dǎo)管大有利于植物體內(nèi)水分運輸從而抵御干旱逆境，50 mg·L-1濃度的CF處理下苜蓿中柱直徑與根直徑之比降低，但導(dǎo)管數(shù)量和面積均顯著增加，可見，苜蓿在較高濃度外源咖啡酸作用下，可以通過增加導(dǎo)管的數(shù)量和面積來運輸和篩選水分、無機鹽，降低較高濃度咖啡酸對苜蓿的抑制作用，為自身正常生長提供保障。該結(jié)果與劉延吉等[36]研究的玉米(ZeamaysL.)可通過根內(nèi)維管柱徑向加粗、增加導(dǎo)管數(shù)量，以提高根的運輸能力，適應(yīng)低鉀脅迫逆境的現(xiàn)象不完全一致，這可能是由于研究對象和外源添加物不一致所致。植物自毒作用的一個重要機制是自毒物質(zhì)通過影響受體植物細(xì)胞有絲分裂來促進(jìn)或抑制其生長發(fā)育[37]，香豆素、咖啡酸及其混合物能夠促進(jìn)或抑制苜蓿幼根的形態(tài)建成和解剖結(jié)構(gòu)，可能也是通過干擾苜蓿根尖細(xì)胞有絲分裂所致，其影響機制還有待進(jìn)一步研究。

植物形態(tài)結(jié)構(gòu)與所處環(huán)境密切相關(guān)，為了能在不同的生境中生長和發(fā)育，植物往往呈現(xiàn)出不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，這通常被認(rèn)為是植物對特殊生境的演化適應(yīng)。本研究表明在香豆素、咖啡酸及其混合物的種類和濃度綜合作用下，紫花苜蓿生長早期根系內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)與外部形態(tài)的可塑性存在一定相關(guān)性：低濃度(0.5 mg·L-1)混合物處理不僅顯著增大苜蓿根體積和根尖數(shù)量，提高根系向所處環(huán)境攝取自身所需營養(yǎng)物質(zhì)的能力，而且顯著促進(jìn)苜蓿幼根皮層、中柱、導(dǎo)管等解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)育(P<0.05)，增強根系通氣和輸導(dǎo)水分、無機鹽的能力，進(jìn)而形成了高效吸收和運移的良性循環(huán)體系，但香豆素和咖啡酸處理對苜蓿根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的促進(jìn)作用與對照相比差異不顯著(P>0.05)。在低于50 mg·L-1的濃度處理下，紫花苜蓿幼根通過改變根系外部形態(tài)建成及改善其內(nèi)部輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)來適應(yīng)香豆素、咖啡酸及其混合物的刺激作用，確保幼苗正常生長發(fā)育，但高于該濃度處理時，苜蓿根系形態(tài)建成和解剖結(jié)構(gòu)均受到顯著抑制效應(yīng)，且自毒抑制效應(yīng)由強到弱均為：香豆素>混合物>咖啡酸?？梢姡愣顾睾涂Х人岬幕旌衔镌诘蜐舛葧r增強了單體香豆素和咖啡酸對苜蓿幼根外部形態(tài)及內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的促進(jìn)作用，高濃度時降低了單體香豆素對紫花苜蓿幼根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的抑制作用，該現(xiàn)象可能是由于香豆素和咖啡酸之間存在一定協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用可能和外源添加物種類及其組成密切相關(guān)，也可能是混合物刺激苜蓿分泌某種新物質(zhì)所致，該現(xiàn)象產(chǎn)生的可能原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

苜蓿的根系外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)對不同濃度香豆素、咖啡酸及其混合物存在相同或不同的響應(yīng)機制：低濃度(0.5 mg·L-1)的香豆素和咖啡酸混合物處理對苜蓿幼根皮層、中柱、導(dǎo)管等解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)育呈現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，增強單體香豆素和咖啡酸的促進(jìn)作用。低于50 mg·L-1濃度的香豆素、咖啡酸及其混合物誘導(dǎo)紫花苜蓿根系產(chǎn)生不同程度的結(jié)構(gòu)性改變以適應(yīng)生長環(huán)境，但高于該濃度時，其根系受損嚴(yán)重，不能正常生長和發(fā)育。高濃度(500 mg·L-1)香豆素、咖啡酸及其混合物對苜蓿幼根外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的自毒抑制綜合效應(yīng)由強到弱依次為：香豆素>混合物>咖啡酸。本研究從根系形態(tài)建成和解剖結(jié)構(gòu)層面解釋了紫花苜蓿主要自毒物質(zhì)香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿幼苗生長和發(fā)育的自毒作用，為深入探討香豆素和咖啡酸對紫花苜蓿生長和發(fā)育影響機理提供依據(jù)。