李湘君 邊 芳 吳愛萍 瞿平元

白癜風(fēng)是皮膚科常見的一種難治性獲得性色素脫失性皮膚病。表皮黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞處理氧化應(yīng)激的能力減弱，機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，這可能是導(dǎo)致黑素細(xì)胞功能障礙，引起白癜風(fēng)發(fā)生的重要病因之一[1]。本研究采用過氧化氫誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞體外凋亡模型檢測(cè)蛇床子素對(duì)黑素細(xì)胞活性及樹突的影響，并通過檢測(cè)SOD和MDA的水平，初步探討蛇床子素治療白癜風(fēng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料M254培養(yǎng)基、人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑HMGS均購自美國Cascade公司；中性蛋白酶dispase購自廣州威佳科技有限公司；胎牛血清FBS購自美國Gibco公司；二甲基亞砜DMSO、左旋多巴L-DOPA購自美國Sigma公司；MTS購自美國Promega公司；30%過氧化氫為國產(chǎn)分析純。SOD及MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。中藥單體蛇床子素購于中國藥品生物制品檢定所。蛇床子素用DMSO助溶，-20℃冰箱避光保存，2周內(nèi)使用，臨用時(shí)用新鮮的培養(yǎng)基調(diào)至終濃度。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定取6～20歲健康男性包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，除去皮下組織后剪成寬約3 mm的細(xì)條，0.25%的Dispase酶4℃下消化18 h，分離表真皮，棄真皮，0.25%胰酶消化表皮5 min，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過濾，離心后以5×106個(gè)/ml密度接種培養(yǎng)。24 h后首次換液，培養(yǎng)至細(xì)胞80%～90%融合后傳代。取第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。L-DOPA染色鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為黑素細(xì)胞[2,3]。

1.2.2 不同濃度H2O2對(duì)人表皮黑素細(xì)胞的影響(MTS法)0.25%胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為2.5×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μl。24 h后吸去培養(yǎng)液，用含濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L H2O2的新鮮培養(yǎng)液于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，分別加入MTS顯色液20 μl，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。應(yīng)用酶標(biāo)儀，在測(cè)量波長(zhǎng)490 nm、參考波長(zhǎng)630 nm下測(cè)定各孔光吸收值(A)，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。黑素細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3 蛇床子素對(duì)H2O2誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞活性的影響根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，濃度為20、40、80 μg/ml的蛇床子素具有較好的促黑素細(xì)胞生長(zhǎng)作用，且呈濃度依賴性，故本實(shí)驗(yàn)選取上述濃度的蛇床子素作為實(shí)驗(yàn)濃度。當(dāng)過氧化氫濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L時(shí)，對(duì)人表皮黑素細(xì)胞活性抑制作用不明顯，但當(dāng)其濃度增加至0.4 mmol/L時(shí)，可顯著抑制黑素細(xì)胞活性(P<0.05)。故選擇具有明顯抑制細(xì)胞活性作用的最低過氧化氫濃度0.4 mmol/L，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(僅添加完全培養(yǎng)基)、過氧化氫組(0.4 mmol/L)、蛇床子素高濃度組(80 μg/ml)、中濃度組(40 μg/ml)、低濃度組(20 μg/ml)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞方法同上，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后倒去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入新鮮配制的高、中、低濃度蛇床子素完全培養(yǎng)基100 μl進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)照組、過氧化氫組僅添加完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒去培養(yǎng)基，蛇床子素組及過氧化氫組分別加入新鮮配制的0.4 mmol/L過氧化氫培養(yǎng)基100 μl，對(duì)照組僅添加完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h。之后每孔分別加入20 μl MTS顯色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A值，方法同上。

1.2.4 蛇床子素對(duì)H2O2誘導(dǎo)下人表皮黑素細(xì)胞樹突的影響實(shí)驗(yàn)分組同上，調(diào)整黑素細(xì)胞濃度為2.5×105/ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 ml，培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后，經(jīng)高、中、低濃度蛇床子素預(yù)處理后加入0.4 mmol/L過氧化氫培養(yǎng)基方法同上，培養(yǎng)24 h后，在倒置相差顯微鏡下分別觀察處理前后各組黑素細(xì)胞樹突形態(tài)變化，并使用目鏡標(biāo)尺隨機(jī)選取處理前后20個(gè)黑素細(xì)胞，記錄各組細(xì)胞樹突長(zhǎng)度。根據(jù)公式：樹突變化率=[(處理前黑素細(xì)胞樹突長(zhǎng)度-處理后黑素細(xì)胞樹突長(zhǎng)度)/處理前黑素細(xì)胞樹突長(zhǎng)度]×100%，記錄各組樹突變化率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[4]。

1.2.5 蛇床子素對(duì)H2O2誘導(dǎo)下人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)SOD及MDA的影響使用5個(gè)25 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同上，具體處理同上。培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集上述對(duì)照組、過氧化氫組、蛇床子素高、中、低濃度組細(xì)胞，用PBS洗2遍，重懸于0.1%的PBS中，制成細(xì)胞數(shù)為2×106/ml的細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞完全破碎后，以4000 r/min離心15 min，勻漿上清液做SOD及MDA測(cè)定。按照試劑盒所述方法，采用WST-1法，酶標(biāo)儀于550 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算細(xì)胞內(nèi)SOD活性。采用試劑盒介紹的TBA法，酶標(biāo)儀于532 nm處測(cè)定OD值，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量[5]。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)H2O2誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞活性的影響經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析檢驗(yàn)及多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK檢驗(yàn)，結(jié)果顯示過氧化氫組黑素細(xì)胞活力(50.83±2.58)%顯著下降 (P<0.05)，蛇床子素高濃度組黑素細(xì)胞活力(71.40±2.46)%雖較對(duì)照組降低(P<0.05)，但顯著高于過氧化氫組及蛇床子素中、低濃度組(P<0.05)。詳見圖1。

注：圖1各組依次為對(duì)照組、過氧化氫組、蛇床子素高、中、低濃度組；與對(duì)照組比較，*P<0.05與過氧化氫組比較#P<0.05圖1 蛇床子素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞活力的影響

2.2 蛇床子素對(duì)H2O2誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞樹突的影響使用倒置相差顯微鏡觀察處理前后黑素細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。處理前黑素細(xì)胞大多呈長(zhǎng)梭形，有1～2支樹突，樹突細(xì)長(zhǎng)，胞體較小，胞體周圍可見明顯光暈。隨機(jī)選取處理前后20個(gè)黑素細(xì)胞并記錄樹突長(zhǎng)度，根據(jù)公式計(jì)算樹突變化率。結(jié)果顯示過氧化氫組黑素細(xì)胞樹突變化率(61.28±3.85)%較對(duì)照組(8.85±1.90)%顯著升高(P<0.05)，顯微鏡下也觀察到過氧化氫組細(xì)胞樹突明顯變短，甚至消失，且胞體呈現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，提示過氧化氫可明顯縮短人表皮黑素細(xì)胞樹突。蛇床子素高濃度組樹突變化率(31.50±1.13)%及中濃度組(44.25±1.70)%顯著低于過氧化氫組(P<0.05)。詳見圖2。

注：圖2各組依次為對(duì)照組、過氧化氫組、蛇床子素高、中、低濃度組；與對(duì)照組比較，*P<0.05，與過氧化氫組比較，#P<0.05圖2 蛇床子素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞樹突變化率影響

2.3 蛇床子素對(duì)H2O2誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響采用WST-1法檢測(cè)各組黑素細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)水平。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，過氧化氫組黑素細(xì)胞SOD活性(57.90±2.46)nmol·mgprot-1顯著下降(P<0.05)。與過氧化氫組相比,蛇床子素高濃度組與中濃度組黑素細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著升高，分別為(89.24±2.81)nmol·mgprot-1和(81.11±2.88)nmol·mgprot-1(P<0.05)。采用TBA法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的丙二醛(MDA)含量。結(jié)果顯示過氧化氫組黑素細(xì)胞內(nèi)MDA含量(3.10±0.19)nmol·mgprot-1較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)，而與過氧化氫組相比，蛇床子素高濃度組的細(xì)胞內(nèi)MDA含量(2.39±0.19)nmol·mgprot-1顯著降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 蛇床子素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與過氧化氫組比較,2)P<0.05

3 討論

白癜風(fēng)是皮膚科常見的一種獲得性色素脫失性皮膚病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界白癜風(fēng)的人群患病率為0.5%～4%，我國的人群患病率為0.1%～2.7%，且有逐年增加的趨勢(shì)[6]。在發(fā)病過程中，黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞處理氧化應(yīng)激的能力減弱與黑素細(xì)胞損傷及黑素合成受到抑制密切相關(guān)。有學(xué)者[7]在檢測(cè)白癜風(fēng)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)和銅藍(lán)蛋白水平明顯降低，而脂質(zhì)過氧化物丙二醛水平顯著(MDA)升高，表明白癜風(fēng)患者對(duì)氧自由基的清除能力下降。過氧化氫是活性氧自由基(ROS)的重要來源，可自由穿過生物膜，并能和金屬離子如Cu+和Fe2+等發(fā)生芬頓反應(yīng)而產(chǎn)生氧化活性更強(qiáng)的羥自由基。所以過氧化氫可能是造成黑素細(xì)胞損傷的重要原因[8，9]。

蛇床子在臨床治療白癜風(fēng)取得較好療效的中藥配方制劑中出現(xiàn)頻率較高。其主要活性成分為蛇床子素,化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明, 蛇床子素具有抗高血壓、抗心律失常、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松癥等功效[10]。祝雙華等[11]研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有抗氧化保護(hù)作用。蛇床子素體外可直接清除氧自由基O2-·、羥自由基·OH，且同等劑量下效果優(yōu)于維生素C[12]。羅增香等[4,13]應(yīng)用蛇床子素作用于體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,并且可促進(jìn)黑素細(xì)胞樹突的生成。

筆者通過試驗(yàn)檢測(cè)蛇床子素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞活性及樹突的影響，結(jié)果顯示：過氧化氫組黑素細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，蛇床子素高濃度組的黑素細(xì)胞活力雖低于對(duì)照組(P<0.05)，但顯著高于過氧化氫組。過氧化氫組黑素細(xì)胞樹突變化率較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，蛇床子素高、中濃度組的黑素細(xì)胞樹突變化率顯著低于過氧化氫組(P<0.05)。提示在過氧化氫誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化損傷模型中，蛇床子素對(duì)黑素細(xì)胞的活性及樹突的影響具有保護(hù)作用。此外，本研究檢測(cè)了黑素細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD的水平，結(jié)果顯示：過氧化氫組與對(duì)照組相比細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)。經(jīng)80 μg/ml及40 μg/ml蛇床子素高、中濃度組的細(xì)胞內(nèi)SOD活性較過氧化氫組顯著升高(P<0.05)，蛇床子素高濃度組的細(xì)胞內(nèi)MDA含量較過氧化氫組顯著降低(P<0.05)。提示過氧化氫可顯著降低黑素細(xì)胞內(nèi)SOD水平及升高M(jìn)DA水平，而蛇床子素可明顯抑制過氧化氫的氧化應(yīng)激作用，升高細(xì)胞內(nèi)SOD水平，并降低MDA水平。通過上述試驗(yàn)，我們推測(cè)中藥單體蛇床子素對(duì)黑素細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定抗氧化保護(hù)作用，為蛇床子素治療白癜風(fēng)提供了一種新的作用機(jī)制，可成為臨床上治療此類疾病的一個(gè)新的作用靶點(diǎn)。