王立萍 姚永青 梅芊 李楊 劉英

(河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450008)

慶大霉素為美國Schering公司W(wǎng)einstein等[1]于1963年發(fā)現(xiàn)，1966年其硫酸鹽應(yīng)用于臨床，1965年我國中科院福建微生物研究所分離得到產(chǎn)生菌，1969年經(jīng)研制成功后并投入生產(chǎn)[2]，早期劑型為注射劑。由于硫酸慶大霉素口服基本不吸收，但在腸道中能達高濃度，片劑和顆粒劑開始上市，臨床應(yīng)用于治療細菌性痢疾或其他細菌性腸道感染，亦可用于結(jié)腸手術(shù)前準備。

硫酸慶大霉素片目前僅國內(nèi)生產(chǎn)，包括素片、薄膜衣片及糖衣片。其口服吸收性差，在胃腸道中濃度較穩(wěn)定而持久，主要以原型隨糞便排出。慶大霉素主要由C1、C1a、C2和C2a4個活性成分組成，另外還有次要組分如西索米星、慶大霉素C2b等[3]。各組分的毒性和抗菌能力有一定的差異[4]，各組分相對含量的變化關(guān)系著產(chǎn)品的療效和毒副作用，為保證藥物使用的安全性、有效性，應(yīng)對硫酸慶大霉素組分和有關(guān)物質(zhì)進行控制。硫酸慶大霉素注射液，伴隨著藥典標準的不斷完善與提高，其嚴重不良反應(yīng)明顯降低[5]。

中國藥典2015年版二部收載硫酸慶大霉素片[6]，國外藥典均未收載該劑型。中國藥典2015年版二部收載的硫酸慶大霉素原料和注射液均采用HPLC-ELSD法控制其組分和有關(guān)物質(zhì)[7]，而未對片劑的組分和有關(guān)物質(zhì)進行控制，這就存在使用劣質(zhì)的原料進行片劑生產(chǎn)的風(fēng)險。本文在中國藥典2015年版二部硫酸慶大霉素注射液組分和有關(guān)物質(zhì)測定方法的基礎(chǔ)上，建立了硫酸慶大霉素片的組分和有關(guān)物質(zhì)測定方法，該方法專屬性好，可有效控制硫酸慶大霉素片的組分和有關(guān)物質(zhì)，防止企業(yè)采用劣質(zhì)原料生產(chǎn)片劑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695液相色譜儀，Empower色譜工作站(美國Waters公司)，Alltech 2000ES ELSD檢測器(Alltech公司)。BP-211D分析天平(Mettler公司)。

1.2 試藥

慶大霉素標準品，批號：130326-201015，C114.7%、C1a15.3%、C2a8.5%、C218.5%；小諾霉素標準品，批號：130342-201404，563u/mg(51.8%)；西索米星對照品，批號：130635-201301，56.0%，標準物質(zhì)均來源于中國食品藥品檢定研究院。三氟乙酸為色譜純(J&K 99.9%，L130Q156，北京百靈威科技有限公司)，甲醇為色譜純(德國Merck)，水為Mill-Q去離子水。

1.3 樣品

156批樣品來源于2017年國家評價性抽驗樣品，其中12批素片，27批薄膜衣片，117批糖衣片，規(guī)格均為40mg(4萬單位)。涉及生產(chǎn)企業(yè)11個，分別以數(shù)字1～11表示。

2 方法

2.1 儀器方法

色譜柱為GRACE Apollo C18(250mm×4.6mm,5μm)。流動相為0.2mol/L三氟乙酸溶液:甲醇(96:4)，流速0.6mL/min；柱溫35℃；進樣量25μL(慶大霉素C組分)和50μL(有關(guān)物質(zhì))；ELSD漂移管溫度110℃，載氣流速2.5L/min，增益1。

2.2 測定方法

慶大霉素C組分：精密稱取慶大霉素標準品適量，加水溶解稀釋成約含慶大霉素總C組分0.4、1.0和2.0mg/mL的溶液，作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。精密量取上述3種溶液各25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標準品溶液各組分濃度對數(shù)值與相應(yīng)峰面積對數(shù)值的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.99；另取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當(dāng)于慶大霉素0.1g)；如為糖衣片，取5片，全部研細，加水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素1.0mg/mL的溶液，同法測定，用慶大霉素各組分的線性回歸方程分別計算供試品中對應(yīng)組分的量(Ctcx)，并按下面公式計算出各組分的含量(%, u/u)：

Cx=(Ctcx×V×理論效價×平均片重)/(W×標示量)×100%(薄膜衣片與素片)；Cx(%)=(Ctcx×V×理論效價)/(標示量×5)×100%(糖衣片)。

式中Cx為慶大霉素各組分的含量(%, u/u)；Ctcx為由回歸方程計算出的各組分的含量(mg/mL)；V為供試品、溶液的體積(mL)；W為供試品稱重(g)；標示量以u計。

理論效價：C1739.6u/mg、C1a1287.0u/mg、C2a1079.5u/mg和C21095.7u/mg。

有關(guān)物質(zhì)：精密稱取西索米星對照品和小諾米星標準品各適量，加水溶解并定量稀釋制成約含西索米星和小諾米星各10、20和40μg/mL的溶液，作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。按照慶大霉素C組分項下的色譜條件試驗，精密量取標準品溶液(1)、(2)、(3)各50μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標準品溶液濃度對數(shù)值與相應(yīng)峰面積對數(shù)值的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.99；另取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當(dāng)于慶大霉素0.1g)；如為糖衣片，取5片，全部研細，加水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素1.0mg/mL的溶液，同法測定，記錄色譜圖至慶大霉素C1峰保留時間的“1.2”倍，供試品溶液色譜圖中如有西索米星峰、小諾米星峰，用相應(yīng)的線性回歸方程計算西索米星、小諾米星的含量。除硫酸峰和輔料峰外，其他雜質(zhì)峰按西索米星線性回歸方程計算，供試品溶液色譜圖中小于0.1%的雜質(zhì)峰忽略不計。

3 結(jié)果

3.1 專屬性

精密量取空白溶液(水)50mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶液對慶大霉素各C組分峰及有關(guān)物質(zhì)峰均無干擾。

按處方比例分別稱取硫酸慶大霉素素片、薄膜衣片、糖衣片輔料適量，按有關(guān)物質(zhì)供試品溶液制備方法配制，得相當(dāng)于慶大霉素濃度為1.0mg/mL的輔料溶液，量取50μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至慶大霉素C1峰保留時間的1.2倍，結(jié)果各輔料均在5.0min之前響應(yīng)，只有糊精在約5.7和6.7min有響應(yīng)，但與組分和有關(guān)物質(zhì)能有效分離?？鄢o料峰計算，不干擾組分和有關(guān)物質(zhì)測定，見圖1。

圖1 硫酸慶大霉素片空白輔料色譜圖Fig.1 Blank chromatogram of gentamicin sulfate tablets

考察專屬性所用輔料：玉米淀粉、明膠、硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅、糊精、糖粉(蔗糖)、蟲白蠟、檸檬黃、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羥丙甲纖維素、聚丙烯酸樹脂Ⅳ、聚乙二醇6000、川蠟、硫酸鈣、聚山梨酯80、十二烷基硫酸鈉、薄膜衣包衣輔料(混合)。

3.2 系統(tǒng)適用性

取慶大霉素標準品適量，精密稱定，加水溶解稀釋成約含慶大霉素1.0mg/mL的溶液，量取50μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至慶大霉素C1峰保留時間的1.2倍。結(jié)果系統(tǒng)適用性溶液色譜圖與中國藥典2015年版中慶大霉素標準圖譜一致，西索米星、慶大霉素C1a、慶大霉素C2、小諾米星、慶大霉素C2a各峰之間分離度均不小于1.5(圖2)。

3.3 線性與范圍

圖2 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig.2 Chromatograms in system suitability test

精密稱取慶大霉素標準品43.98mg，置于10mL容量瓶中，用水溶解后稀釋至刻度，精密量取適量，配制成濃度分別為0.352、0.880、1.759、2.639、3.518和4.398mg/mL的溶液，作為慶大霉素C組分的線性溶液。精密量取上述溶液各25mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)慶大霉素標準品各C組分的絕對含量及上述線性溶液中慶大霉素的濃度，分別計算慶大霉素各C組分的絕對濃度C(mg/mL)，計算各C組分的絕對濃度對數(shù)值與相應(yīng)峰面積對數(shù)值的線性回歸方程，結(jié)果慶大霉素4個C組分均線性關(guān)系良好(表1)。

表1 慶大霉素各C組分線性結(jié)果Tab.1 Linear results of the C components of gentamicin

3.4 檢測限與定量限

精密稱取西索米星對照品9.08mg、小諾米星標準品10.22mg，加水溶解并稀釋至100mL，得溶液50μg/mL的溶液；精密量取該溶液2.5mL(50μg/mL)，加水稀釋至10mL，得溶液12.5μg/mL，作為檢測限溶液。西索米星檢出限以S/N=3計為88.98ng，定量限以S/N=10計為127.12ng。小諾米星檢出限以S/N=3計為132.35ng，定量限以S/N=10計為264.70ng。

3.5 準確度

根據(jù)企業(yè)1提供的處方和輔料，按照處方比例和硫酸慶大霉素片量的80%、100%和120%精密稱取慶大霉素標準品適量，配制準確性試驗供試品溶液。各濃度平行配制3份。精密量取25μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

精密稱取慶大霉素標準品適量，加水溶解稀釋成約含慶大霉素總C組分0.4、1.0和2.0mg/mL的溶液，作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。精密量取上述3種溶液各25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算標準品溶液濃度各C組分濃度對數(shù)值與相應(yīng)峰面積對數(shù)值的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不小于0.99。用慶大霉素各C組分的線性回歸方程分別計算供試品中對應(yīng)組分的量，計算出各C組分的回收率(%)。各C組分的平均回收率均良好(表2)。

3.6 精密度

儀器精密度：將有關(guān)物質(zhì)測定項下小諾米星標準品溶液(約40μg/mL)，連續(xù)進樣5次，小諾米星峰面積的RSD為0.5%。表明該方法精密度良好。

表2 回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

中間精密度：取同一批號(批號為150901)供試品，分別由兩名分析人員于3d按擬定的慶大霉素C組分和有關(guān)物質(zhì)測定的方法測定，結(jié)果供試品溶液中慶大霉素C1a、慶大霉素C2、慶大霉素C2a、慶大霉素C1含量的RSD分別為1.7%、1.2%、1.9%和1.7%；西索米星、小諾米星、其他最大單個雜質(zhì)、其他雜質(zhì)總量的RSD分別為3.0%、1.7%、3.3%和3.2%，表明該方法中間精密度良好。

3.7 重復(fù)性

慶大霉素C組分：取同一批號(批號：2161020)供試品，按擬定的慶大霉素C組分測定的方法測定，結(jié)果供試品溶液中慶大霉素C1a、慶大霉素C2、慶大霉素C2a、慶大霉素C1含量的RSD分別為0.8%、1.2%、0.9%和0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

有關(guān)物質(zhì)：取同一批號(批號：2161020)供試品，照擬定的有關(guān)物質(zhì)測定方法測定，結(jié)果供試品溶液中西索米星、小諾米星、其他最大單個雜質(zhì)、其他雜質(zhì)總量的RSD分別為2.4%、2.5%、3.8%和5.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

4 樣品測定結(jié)果

采用擬定的方法測定156批次硫酸慶大霉素片的組分，148批次樣品的測定結(jié)果為：C1a為26.2%～37.5%，C2+C2a為41.2%～50.9%，C1為17.1%～23.4%，4個組分總含量為93%～105%，結(jié)果良好。企業(yè)3和企業(yè)4的8批次樣品，總組分含量均偏低。采用中國藥典2015年版二部硫酸慶大霉素片含量測定方法-微生物檢定法測定該兩企業(yè)的8批次樣品的效價含量，結(jié)果均高于HPLC-ELSD法測定的總組分含量(表3)。圖3為供試品溶液慶大霉素C組分的典型色譜圖。

148批次樣品的有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果：小諾米星為1.3%～2.6%，西索米星為0%～1.6%，最大單雜為0.3%～1.1%，總雜為1.2%～4.3%。另外企業(yè)3和企業(yè)4的8批次樣品的西索米星、最大單雜、總雜均偏高(表4)。圖4為供試品溶液有關(guān)物質(zhì)的典型色譜圖。

5 討論

慶大霉素C組分測定方法的進樣體積定為25μL，是因為進樣體積50μL時，組分測定項下慶大霉素標準品溶液(約0.4mg/mL)色譜圖中慶大霉素組分C1a峰將平頂，無法積分，故降低進樣量。

本文建立的HPLC-ELSD法測定硫酸慶大霉素片的組分和有關(guān)物質(zhì)，采用高比例水相，低pH值的流動相，其pH值約為0.9，需采用耐酸且適合高比例水相的色譜柱。

表3 企業(yè)3和企業(yè)4的樣品測定結(jié)果Tab.3 Results of sample determination for enterprises 3 and 4

圖3 供試品溶液C組分典型色譜圖Fig.3 Chromatograms of C components for test solution

表4 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果Tab.4 Results of related substances

圖4 供試品溶液有關(guān)物質(zhì)典型色譜圖Fig.4 Chromatography of related substances for test solution

中國藥典2015年版二部采用抗生素微生物檢定法測定硫酸慶大霉素片的含量，未對其慶大霉素C組分和有關(guān)物質(zhì)進行控制?？股匚⑸餀z定法影響因素較多，由于其原理是量-反應(yīng)平行線原理[8]，要求標準品與供試品有同質(zhì)性，即對多組分抗生素，標準品和供試品中各組分的相對比例要一致，而實際中標準品與各企業(yè)的樣品的組分相對比例均不一致，測得的結(jié)果會存在誤差。另外微生物檢定法測得結(jié)果是主成分和有關(guān)物質(zhì)的綜合含量，不能真實反映主成分的含量。本文采用微生物檢定法測定兩企業(yè)的8批次樣品的效價含量，結(jié)果均高于本文擬定方法測定的總組分含量，是由于擬定方法測定的是硫酸慶大霉素片4個C組分的總標示含量，而微生物檢定法測定的是4個C組分及所有有關(guān)物質(zhì)的綜合活性。

如果參考中國藥典2015年版二部硫酸慶大霉素注射液組分和有關(guān)物質(zhì)的標準規(guī)定，該8批次樣品的組分和有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果是不符合標準規(guī)定的。因此如果不對片劑的組分和有關(guān)物質(zhì)進行控制，則存在采用劣質(zhì)原料生產(chǎn)出符合藥典標準規(guī)定的片劑風(fēng)險。