李俊 楊玉琴 王英瑛 周誼 陳秀秀

(臺州市食品藥品檢驗研究院，臺州 318000)

諾氟沙星(norfloracin)又名氟哌酸，為第三代喹諾酮類抗菌藥，最早分別是1983年在意大利上市[1]和1984年在日本上市。諾氟沙星口服后部分吸收，血藥濃度低，但尿、腸道濃度高，對革蘭陰性菌和陽性菌引起無并發(fā)癥的泌尿道感染療效較好，臨床上適用于敏感菌所致的泌尿道、腸道、耳喉鼻科、婦科、外科和皮膚感染性疾病[2]。國內(nèi)諾氟沙星單方制劑一共有802個批準(zhǔn)文號，其中諾氟沙星膠囊有697個的批準(zhǔn)文號(規(guī)格均為0.1g)，諾氟沙星片有52個批準(zhǔn)文號。執(zhí)行的法定標(biāo)準(zhǔn)為中國藥典2015年版二部[3]，國外英國藥典(BP)、美國藥典(USP)、日本橙皮書(JP)均沒有收載諾氟沙星膠囊，收載有諾氟沙星片。諾氟沙星膠囊被列入2017年浙江省藥品質(zhì)量風(fēng)險考核計劃，共抽取樣品57批次，抽樣地點覆蓋浙江省11個地市，而且分布均勻性較好；涉及生產(chǎn)企業(yè)20個和批準(zhǔn)文號20個；抽自經(jīng)營單位有45批，使用單位11批次，生產(chǎn)單位1批次。

對于諾氟沙星有關(guān)物質(zhì)的控制，目前國外藥典中JP16版[4]采用薄層色譜法，而EP9.3版[5]、BP2015版[6]和USP41版[7]方法均采用HPLC梯度洗脫法，雖然中國藥典方法采用的也是HPLC梯度洗脫法，但從色譜條件、梯度程序、控制的雜質(zhì)指標(biāo)及限度等多方面均有很大的差異，而且國內(nèi)也沒有文獻對現(xiàn)行有關(guān)物質(zhì)方法進行研究的報道，因此有必要對國內(nèi)外諾氟沙星的有關(guān)物質(zhì)方法進行比較研究。關(guān)于溶出度方法，國外藥典沒有收載諾氟沙星膠囊，國內(nèi)外藥典方法的諾氟沙星片的溶出度方法比較接近，而國內(nèi)現(xiàn)行2015年版中國藥典諾氟沙星膠囊的溶出度方法與諾氟沙星片一致，但近幾年來國內(nèi)藥品質(zhì)量公告及文獻[8]顯示采用現(xiàn)行的溶出度方法諾氟沙星膠囊溶出度不合格的情況比較多，因此溶出度的研究也很有必要。

為了考察藥品的質(zhì)量狀況以及有效性、安全性和質(zhì)量可控性，本文根據(jù)現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)的檢驗結(jié)果結(jié)合探索性研究，對市場上的諾氟沙星膠囊產(chǎn)品質(zhì)量進行了分析和研究，并提出了相應(yīng)的改進建議。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀；島津UV-2550紫外可見分光光度計，Agilent 708-DS溶出度儀(配備850-DS自動取樣器)，瑞士萬通KF870水分滴定儀

來自國內(nèi)20個生產(chǎn)廠家的57批諾氟沙星膠囊均為2017年浙江省藥品質(zhì)量風(fēng)險考核抽驗樣品，規(guī)格均為0.1g；諾氟沙星原研片，日本杏林制藥株式會社，規(guī)格100mg，批號：S001；諾氟沙星對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130450-201206)、諾氟沙星雜質(zhì)A(中國食品藥品檢定研究院，批號：130610-201502，99.7%)、雜質(zhì)定位用諾氟沙星對照品(含雜質(zhì)K) (EP標(biāo)準(zhǔn)品，批號：1.0)，諾氟沙星系統(tǒng)適用性對照品(EP標(biāo)準(zhǔn)品，批號： 2.0)；氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸為分析純，甲醇為色譜純。

2 實驗方法

2.1 法定檢驗方法

57批樣品按照法定標(biāo)準(zhǔn)中國藥典2015年版二部進行檢驗。

2.2 探索性研究

2.2.1 溶出度

對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的溶出度測定方法的影響因素進行考察，具體考察溶出介質(zhì)的不同pH值、不同離子強度及配制方法對溶出度結(jié)果的影響，不同pH計，不同溶出度儀等因素對溶出度測定結(jié)果的影響。

溶出曲線的考察采用日本杏林制藥株式會社的諾氟沙星片為參比制劑，參考JP的溶出度條件，分別在pH1.2、4.0、6.8和水4種溶出介質(zhì)條件下對9個生產(chǎn)廠家的10批樣品及原研片進行溶出曲線的測定，考察諾氟沙星膠囊樣品和原研片的溶出狀況，并通過計算f2相似因子法評價溶出曲線的相似性。

2.2.2 水分

采用水分滴定法和烘干法測定樣品的水分含量，并對水分對溶出度的影響進行考察和研究。

2.2.3 有關(guān)物質(zhì)

參照EP 9.3版建立的有關(guān)物質(zhì)測定方法，采用Supelcosil LC-ABZ色譜柱(4.6mm×250mm, 5μm)，以磷酸溶液[取水用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(2.0±0.1)]為流動相A，乙腈為流動相B；線性梯度洗脫(0～5min，B為5%；5～7min，B為5%→7%；7～10min，B為7%→13%；10～15min，B為13%→53%；15～20min，B為53%→90%)，以265nm為檢測波長，流速1.4mL/min，柱溫60℃。

2.2.4 膠囊殼中鉻的含量

采用原子吸收分光光度法對57批諾氟沙星膠囊抽樣樣品的膠囊殼中的鉻含量進行了測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗結(jié)果

按照中國藥典2015年版二部進行全檢，結(jié)果57批樣品合格率為91.2%。

不合格項目為溶出度，57批樣品中有5批溶出度不合格，分別為5個不同的生產(chǎn)廠家，多批樣品存在不同程度的個體差異較大的現(xiàn)象；裝量差異結(jié)果顯示，各生產(chǎn)企業(yè)之間、企業(yè)內(nèi)部批次之間差異較大；有關(guān)物質(zhì)結(jié)果顯示：57批樣品雜質(zhì)A的含量均在0.1%以下，均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.2%的要求，反映出雜質(zhì)A的控制水平較好；對于其他單個最大雜質(zhì)，除1批樣品為0.49%，接近限度邊緣，該企業(yè)應(yīng)關(guān)注這個雜質(zhì)，其余58批均在0～0.25%范圍內(nèi)，處于安全可控的范圍內(nèi)；有4批次樣品的雜質(zhì)總量相對較高，其余批次的雜質(zhì)總量均在0.5%以下；含量測定結(jié)果均在90.0%～110.0%的范圍內(nèi)，其中1個廠家的3批樣品含量在105%～108%之間，同時結(jié)合溶出度結(jié)果也相對偏高，提示該廠家應(yīng)重視生產(chǎn)投料的準(zhǔn)確性。

3.2 探索性研究結(jié)果

3.2.1 溶出度

對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的溶出度方法的影響因素進行研究，結(jié)果顯示：(1)溶出介質(zhì)pH值和電解質(zhì)強度對部分產(chǎn)品溶出度影響顯著，pH值在規(guī)定值4.0附近波動0.1時，部分產(chǎn)品溶出度檢查結(jié)果相差約8%，波動0.2時，溶出度檢查結(jié)果相差約15%；pH計電極使用一段時間后，在正常情況下，舊的電極比新的電極測定值約大0.2。(2)按藥典標(biāo)準(zhǔn)配制溶出介質(zhì)，用老的電極測pH值結(jié)果約為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的4.0，但用相對較新的電極測結(jié)果約為4.2，需加約1.2mL的冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，而標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定配制溶出介質(zhì)時，加冰醋酸為2.86mL，是一個精確的量，本研究認為正常情況下再加這么多的冰醋酸不是“調(diào)節(jié)”，這可能與標(biāo)準(zhǔn)制訂時沒有考慮到pH電極新舊差異有關(guān)。(3)按中國藥典2015年版二部測定部分批號的諾氟沙星膠囊樣品時，不注意溶出介質(zhì)的配制、pH計的性能以及測量的pH值不準(zhǔn)確均會導(dǎo)致溶出度結(jié)果不正確甚至結(jié)論不對；對于按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗溶出度不合格的5批樣品，采用不同溶出度儀、不同的實驗人員進行進一步的分析和考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩批平均溶出度低于50%的樣品，其不同儀器、不同的實驗人員測得結(jié)論均不合格；但另有3批平均溶出度稍高但不合格的樣品，其不同儀器、不同的實驗人員測得結(jié)果有差異，結(jié)論不一致，詳見表1。分析產(chǎn)生的原因除了膠囊樣品個體之間的差異外，不同品牌溶出度儀在儀器各部件上的微小差異(如溶出杯底部的弧度、振動等)的綜合而產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差可能也是導(dǎo)致上述情況的原因之一。由此可見，同一批樣品使用經(jīng)過校驗均合格但品牌不同的溶出度儀結(jié)果差異較大，甚至影響到樣品檢測結(jié)果的判定。因此，本品溶出度結(jié)果在限度上下邊緣時應(yīng)考慮不同溶出度儀的影響。

對溶出曲線的研究結(jié)果顯示，pH1.2的溶出介質(zhì)條件下，各受試樣品與參比制劑的溶出曲線相似，而pH4.0、水、pH6.8的溶出介質(zhì)條件下，多批次樣品的溶出曲線與參比制劑相比差異較大。

3.2.2 水分

57批樣品的水分含量分布不均勻，在2.6%～16.7%的范圍內(nèi)分布。

表1 不同品牌溶出度儀測得的部分樣品的溶出度結(jié)果比較Tab.1 The comparison of results of dissolution measured by different brand dissolution apparatus

對57批樣品的水分含量結(jié)果以及依標(biāo)準(zhǔn)測定的平均溶出度的結(jié)果，進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：(1)隨著樣品中水分的增加，平均溶出度呈現(xiàn)下降的趨勢，而從實際檢驗的結(jié)果看，樣品測得的溶出度較高的樣品其水分含量均相對較低，從統(tǒng)計學(xué)的意義上來說，諾氟沙星膠囊的溶出度與水分在一定程度上存在負相關(guān)；(2)57批樣品中有15批在鋁塑包裝外增加了復(fù)合膜包裝，這15批樣品水分含量相對均較低，而平均溶出度結(jié)果均相對較高，說明樣品的包裝在一定程度上對水分有影響，進而會影響溶出度結(jié)果，文獻[9]也顯示增加背封袋可以減少樣品在儲存過程中溶出度不合格的問題；(3)某一生產(chǎn)廠家的7批次樣品中有6批次采用復(fù)合膜包裝的樣品，其測得的平均溶出度結(jié)果均在90%以上。另有1批次生產(chǎn)日期稍早的樣品沒有加復(fù)合膜包裝，其測得的平均溶出度結(jié)果較低，處于合格邊緣，但其水分含量比其他6批樣品并沒有高出多少，相差不大，推斷原因可能是在沒有改變空心膠囊來源的情況下，不加復(fù)合膜包裝可能對樣品膠囊殼的性能有較大的影響，進而影響到樣品溶出度的結(jié)果。根據(jù)文獻[10]，明膠膠囊在高濕度環(huán)境下會發(fā)生構(gòu)象變化和交聯(lián)，形成一個膨脹、橡膠狀的、水不溶膜，阻滯或限制藥物的釋放。

3.2.3 有關(guān)物質(zhì)

參照EP9.3版[5]、BP2015版[6]和USP41版[7]建立的有關(guān)物質(zhì)測定方法對抽驗的57批樣品進行了有關(guān)物質(zhì)測定，結(jié)果3個生產(chǎn)廠家的5批次樣品中檢出雜質(zhì)E超標(biāo)(限度為0.15%)，1批檢出雜質(zhì)K在0.15%的限度邊緣，結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。

雜質(zhì)E為諾氟沙星結(jié)構(gòu)式中F與Cl發(fā)生競爭置換得到的副產(chǎn)物[11]，而雜質(zhì)K為諾氟沙星結(jié)構(gòu)式中1號位上乙基改為甲基的化合物，這兩個雜質(zhì)均為諾氟沙星原料在合成過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)均較穩(wěn)定，同時經(jīng)過強降解實驗研究也沒有發(fā)現(xiàn)這兩個雜質(zhì)產(chǎn)生，因此諾氟沙星原料中雜質(zhì)控制不嚴(yán)是諾氟沙星膠囊樣品中雜質(zhì)E超標(biāo)和雜質(zhì)K處于限度邊緣的主要原因，同時諾氟沙星原料有關(guān)物質(zhì)方法也沒有對這兩個雜質(zhì)進行控制，無法檢出雜質(zhì)E，也成為雜質(zhì)超限的另一個原因。

表2 部分有關(guān)物質(zhì)超標(biāo)的樣品測定結(jié)果Tab.2 Results of related substances exceeding the standard

對法定標(biāo)準(zhǔn)方法和新建立的方法進行了比較研究，色譜圖詳見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：現(xiàn)行中國藥典2015年版的諾氟沙星及諾氟沙星膠囊的有關(guān)物質(zhì)測定方法已知雜質(zhì)控制指標(biāo)少，僅控制已知雜質(zhì)A，沒有控制雜質(zhì)E、K等雜質(zhì)，色譜條件也不合理，難于檢出已知雜質(zhì)E。分析其產(chǎn)生的原因：(1)色譜條件規(guī)定的初始流動相比例中有機相比例過高，梯度條件不適合，導(dǎo)致諾氟沙星主峰柱效較低，與相鄰的雜質(zhì)E峰難于分開。實驗研究表明，在不改變流動相初始比例及梯度條件的情況下，采用不同品牌的C18色譜柱均無法很好地分離諾氟沙星主峰與雜質(zhì)E，一些品牌色譜柱的色譜圖中雜質(zhì)E與諾氟沙星主峰完全重疊；(2)不同品牌的C18色譜柱對測定結(jié)果影響較大，實驗研究表明，在改變和調(diào)整流動相初始比例及梯度條件的情況下采用3個不同品牌的C18色譜柱進行分離，僅有1個品牌的色譜柱可以使諾氟沙星主峰與雜質(zhì)E得到很好地分離。

因此，諾氟沙星膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)方法不能有效控制藥品的質(zhì)量；諾氟沙星色譜峰與雜質(zhì)E峰重疊出峰，也會導(dǎo)致含量測定方法專屬性差，需改進提高。

3.2.4 膠囊殼中鉻的測定

膠囊殼的鉻含量的探索性研究結(jié)果顯示，57批樣品的膠囊殼的鉻含量質(zhì)量狀況較好，安全風(fēng)險低。

4 小結(jié)

圖2 法定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)方法與改進的方法的色譜圖比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatograms between statutory standards method and improved method of related substance

通過本次質(zhì)量風(fēng)險考核結(jié)果顯示，諾氟沙星膠囊的樣品存在一定質(zhì)量問題，中國藥典2015年版二部諾氟沙星膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要修訂提高。依現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗有2批不合格，3批次因不同溶出度儀檢測結(jié)論不一致，無法判斷；探索性研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“溶出度”方法中溶出介質(zhì)配制的規(guī)定可能忽略了pH值波動、離子強度的顯著性影響；多個廠家的樣品的溶出曲線與原研制劑差異較大；樣品的水分、包裝均會影響溶出度的結(jié)果；5批樣品有關(guān)物質(zhì)檢出雜質(zhì)E超標(biāo)，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的“有關(guān)物質(zhì)”方法中諾氟沙星色譜峰與雜質(zhì)E峰重疊，難于分離，方法難于有效控制藥品質(zhì)量，須改進和提高。