王 利， 胡瑞瑞， 郝海軍

（1. 鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 鄭州 450064； 2. 上海市中藥研究所， 上海 201401）

馬錢子堿是馬前科植物馬錢 Strychnos nux-vomica L. 種子的主要活性成分之一， 具有抗炎、 鎮(zhèn)痛、 免疫抑制、 抗腫瘤等藥理作用[1-3］， 尤其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及鎮(zhèn)痛方面受到廣泛關(guān)注[4］， 但該成分水溶性很差， 難以經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入體循環(huán)， 導(dǎo)致口服生物利用度很低[5］， 臨床應(yīng)用受到一定限制。 有學(xué)者將馬錢子堿制成包合物[6-7］， 可大大提高該成分水溶性， 有助于促進(jìn)其順利吸收進(jìn)入體循環(huán)， 提高生物利用度， 但中藥活性成分制備成包合物后血藥濃度波動(dòng)較大[7-8］， 而且馬錢子堿本身具有一定毒性[9］， 因此以其包合物口服給藥時(shí)存在較大的安全隱患。

滲透泵緩控釋制劑體外以恒速緩慢釋放藥物，而且體內(nèi)釋藥過程不受胃腸道內(nèi)容物、 生理因素等影響。 微孔滲透泵控釋片是滲透泵緩控釋制劑中的一種[10］， 在包衣處方中加入一定量致孔劑， 當(dāng)微孔滲透泵片進(jìn)入胃腸道水環(huán)境后， 包衣膜致孔劑遇水溶解留下釋藥孔道， 同時(shí)片芯開始水化， 促滲聚合物發(fā)生膨脹， 從而產(chǎn)生了滲透壓梯度， 在滲透壓的作用下， 藥物混懸液經(jīng)釋藥孔道緩慢釋放（圖1）， 該劑型無需打孔， 制備工藝得以簡化。 另外，難溶性藥物制備成微孔滲透泵控釋片時(shí)需通過增溶技術(shù)提高難溶性藥物的溶解度， 提高控釋膜內(nèi)外滲透壓， 從而使藥物順利緩慢釋放。 本實(shí)驗(yàn)首先制備了馬錢子堿包合物， 再將其進(jìn)一步與微孔滲透泵技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用， 制備微孔滲透泵控釋片， 以期為相關(guān)制劑革新提供參考。

圖1 微孔滲透泵片釋藥機(jī)理Fig.1 Release mechanism of microporous osmotic pump controlled-release tablets

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國） 有限公司］； V5 型實(shí)驗(yàn)室粉體混勻機(jī)（廣州康諾醫(yī)藥機(jī)械有限公司）； TDP 型單沖壓片機(jī)（上海第一制藥機(jī)械廠）； WKY-200 型小型包衣設(shè)備（沈陽明若軒制藥設(shè)備有限公司）； ZRS-8 型智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)無線電廠）； BP 210D 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； DZF 型真空干燥箱（北京中科儀器有限公司）； HWS-12 型智能水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料 馬錢子堿（批號062-15， 日本和光純藥工業(yè)株式會社）； 馬錢子堿對照品（中國食品藥品檢定研究院， 批號110706-201505）； 羥丙基-β-環(huán)糊精（批號20170515， 西安德立生物化工有限公司）； 乳糖（批號20160517， 江蘇道寧藥業(yè)有限公司）； 氯化鈉（批號L20161124， 河北華晨藥業(yè)有限公司）； 醋酸纖維素（結(jié)合酸54.5% ～56.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 硬脂酸鎂（批號20150617005S， 遼寧奧達(dá)制藥有限公司）； 聚乙二醇400 （批號72000050， 巴斯夫中國有限公司）；聚氧乙烯WRS-N-10 （美國Dow 公司）； 鄰苯二甲酸二乙酯（批號20160316， 天津大茂試劑有限公司）。 乙腈、 甲醇為色譜純； 其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢子堿含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-0.05%三乙胺（22 ∶78）； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長260 nm； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取馬錢子堿對照品10 mg， 置于50 mL 量瓶中， 加入約35 mL 甲醇超聲溶解， 靜置至室溫， 甲醇定容至刻度， 得到200 μg／mL貯備液， 再進(jìn)一步稀釋成0.05、 0.5、1.0、 2.5、 5.0、 10 μg／mL， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 得到回歸方程為Y=18.354 8X-1.992 7 （r=1.000 0）， 在0.05～10 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備

2.1.3.1 包合物 取包合物10 mg， 加入約50 mL甲醇超聲30 min， 靜置30 min 后甲醇-0.05%三乙胺定容至100 mL， 過0.45 μm 微孔濾膜， 即得（6.18 μg／mL）。

2.1.3.2 微孔滲透泵控釋片 取微孔滲透泵控釋片10 片， 研磨成細(xì)粉， 稱取500 mg， 加入約50 mL甲醇超聲30 min， 靜置30 min 后甲醇-0.05%三乙胺定容至100 mL， 過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 取0.05、 5.0、 10 μg／mL 馬錢子堿對照品溶液， 于1 d 內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次， 測得峰面積RSD 小于0.31%， 表明儀器精密度良好。 以羥丙基-β-環(huán)糊精溶液配制0.1、 5.0、 10 μg／mL 樣品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得平均回收率為98.33% ～99.24%。 精密稱取9 份馬錢子堿含有量已知的樣品粉末， 每份約500 mg， 精密加入0.05、 5.0、 10 μg／mL 馬 錢 子 堿 對 照 品 溶 液1.0 mL， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得平均加樣回收率為99.03%， RSD 為1.61%。 取“2.1.3” 項(xiàng)下供試品溶液， 于0、 1、 2、 3、 4、5 d在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得峰面積RSD 小于1.16%， 表明溶液在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 測得馬錢子堿含有量RSD 小于1.84%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2 包合物制備 取馬錢子堿0.4 g， 加到20 mL無水乙醇中， 溶解后緩慢加到6 mL 羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中 （1.0 g／mL）， 50 ℃下磁力攪拌5 h，0.45 μm 微孔濾膜除去未參加包合的游離藥物，-70 ℃下預(yù)凍2 d 后減壓冷凍干燥， 即得， 封口袋密封保存?zhèn)溆谩?再按照文獻(xiàn)[7］ 方法測定， 測得馬錢子堿原料藥溶解度為0.15 mg／mL， 制備成包合物后達(dá)到1.04 mg／mL， 提高了6.93 倍， 3 批包合物平均包封率為（98.23±0.40）%， 馬錢子堿平均含有量為（61.82±0.33） mg／g。

2.3 微孔滲透泵控釋片制備 取包合物200 mg（馬錢子堿含有量12.36 mg）、 促滲劑（NaCl） 50 mg、 促滲聚合物（聚氧乙烯WRS-N-10） 適量、 乳糖250 mg， 等量遞增法混勻， 以70%乙醇為黏合劑制備微孔滲透泵片片芯軟材， 過20 目篩， 18 目篩整粒， 置于45 ℃烘箱中干燥過夜， 在干燥后的顆粒中加入1%硬脂酸鎂作為潤滑劑， 填充于直徑8 mm 的沖模內(nèi)壓制片芯， 硬度45 ～65 N。 再將處方量醋酸纖維素、 聚乙二醇400、 鄰苯二甲酸二乙酯溶于混合溶劑中（丙酮∶無水乙醇=95 ∶5），混勻后密封保存， 得到包衣液。 最后， 將片芯置于包衣鍋中， 條件為溫度35 ℃， 包衣液體積流量5 mL／min， 垂直傾角30°， 轉(zhuǎn)速30 r／min， 待達(dá)到設(shè)定質(zhì)量后， 將其置于40 ℃烘箱中固化， 即得。

2.4 累積釋放度測定 按照2015 年版《中國藥典》 四部9013 方法， 取適量微孔滲透泵控釋片，以900 mL 超聲后的蒸餾水為釋放介質(zhì)， 轉(zhuǎn)速100 r／min， 溫度 （37±0.5）℃， 于0、 1、 2、 4、6、 8、 10、 12 h 各取樣2 mL， 補(bǔ)加同體積釋放介質(zhì)， 溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾（水膜）， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 計(jì)算累積釋放度， 繪制相應(yīng)曲線。

2.5 單因素試驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 微孔滲透泵控釋片主要受聚氧乙烯WRS-N-10 用量、 包衣增重、 聚乙二醇400 用量、 鄰苯二甲酸二乙酯用量的影響。本實(shí)驗(yàn)以12 h 內(nèi)累積釋放度及是否恒速釋放為評價(jià)指標(biāo)， 通過單因素試驗(yàn)進(jìn)行考察， 為進(jìn)一步正交試驗(yàn)優(yōu)化提供參考。

2.5.1 聚氧乙烯WRS-N-10 用量 取包合物200 mg、 NaCl 50 mg、 乳糖250 mg 制備片芯， 固定包衣增重5%， PEG 400 用量30%， 鄰苯二甲酸二乙酯用量20%， 考察聚氧乙烯WRS-N-10 用量10、 5、 0 mg 對體外釋藥行為的影響， 結(jié)果見圖2。由圖可知， 片芯中加入適量聚氧乙烯WRS-N-10 是有必要的。

圖2 聚氧乙烯WRS-N-10 用量對體外釋藥行為的影響Fig.2 Effect of polyoxyethylene WRS-N-10 consumption on in vitro drug release behaviors

2.5.2 包衣增重 固定片芯處方（200 mg 包合物、 50 mg NaCl、 10 mg 聚 氧 乙 烯WRS-N-10、250 mg 乳糖） 及其他條件不變， 考察包衣增重2.5%、 4.5%、 6.5%對體外釋藥行為的影響， 結(jié)果見圖3。 由圖可知， 隨著包衣增重增加， 釋藥速率及12 h 內(nèi)累積釋放度逐漸下降， 雖然在2.5%時(shí)后者最高， 但藥物釋放非恒速， 而在4.5%時(shí)體外釋藥行為較理想。

圖3 包衣增重對體外釋藥行為的影響Fig.3 Effect of coating weight gain on in vitro drug release behaviors

2.5.3 聚乙二醇400 用量 固定片芯處方及其他條件不變， 考察聚乙二醇400 用量20%、 30%、40%對體外釋藥行為的影響， 結(jié)果見圖4。 由圖可知， 隨著聚乙二醇400 用量增加， 釋藥速率及12 h內(nèi)累積釋放度逐漸增大， 其中在40% 時(shí)前期釋藥較快， 但后期趨緩， 故在30%時(shí)相對比較理想。

圖4 聚乙二醇400 用量對體外釋藥行為的影響Fig.4 Effect of polyethylene glycol 400 consumption on in vitro drug release behaviors

2.5.4 鄰苯二甲酸二乙酯用量 固定片芯處方及其他條件不變， 考察鄰苯二甲酸二乙酯用量15%、20%、 25%對體外釋藥行為的影響， 結(jié)果見圖5。由圖可知， 隨著鄰苯二甲酸二乙酯用量增加， 釋藥速率及12 h 內(nèi)累積釋放度逐漸下降。

圖5 鄰苯二甲酸二乙酯用量對體外釋藥行為的影響Fig.5 Effect of diethyl phthalate consumption on in vitro drug release behaviors

2.6 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上， 選擇聚氧乙烯WRS-N-10 用量（A）、 包衣增重（B）、 聚乙二醇400 用量（C）、 鄰苯二甲酸二乙酯用量（D）作為影響因素， 每個(gè)因素3 個(gè)水平， 共9 次試驗(yàn)，考察微孔滲透泵控釋片在2 h 的累積釋放度（L1）以分析有無時(shí)滯或突釋， 以及6 h （L2） 和12 h（L3） 的累積釋放度以分析是否釋放完全（權(quán)重系數(shù)設(shè)置為2）， 加權(quán)法計(jì)算綜合評分（ ｜ L1-0.2 ｜ ×100×1＋｜L2-0.5 ｜×100×1＋｜L3-0.9 ｜ ×100×2）。結(jié)果見表1， 方差分析見表2。

由表可知， 各因素影響程度依次為A＞D＞C＞B， 其中因素A 有顯著性差異（P＜0.05）。 最優(yōu)工藝為A3B1C2D3， 即聚氧乙烯WRS-N-10 用量為10 mg， 包衣增重3.5%， 聚乙二醇400 用量30%，鄰苯二甲酸二乙酯用量25%， 片芯質(zhì)量為510 mg。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)及模型擬合 按“2.6” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備6 批微孔滲透泵控釋片， 結(jié)果見圖6， 可知工藝重復(fù)性良好， 處方合理， 累積釋放度88.44%， 綜合評分16.6。 然后， 分別采用零級、一級、 Higuchi 方程對微孔滲透泵控釋片進(jìn)行模型擬合， 得到方程分別為Mt／M∞=0.075 6t＋0.018 9（r=0.995 6）、 ln （1-Mt／M∞） = -1 749t＋0.170 7（r=0.949 2）、 Mt／M∞=0.271 9t1／2-0.129 6 （r=0.935 4）， 其中Mt為t 時(shí)間累積釋放度， M∞為∞時(shí)間累積釋放度， Mt／M∞為t 時(shí)間累積釋放率， k為常數(shù)， 以相關(guān)系數(shù)（r） 為指標(biāo)進(jìn)行判斷， 發(fā)現(xiàn)零級模型擬合效果最好。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

圖6 微孔滲透泵控釋片體外釋藥曲線Fig.6 In vitro drug release curves for microporous osmotic pump controlled-release tablets

2.8 體外釋藥行為比較 按“2.4” 項(xiàng)下方法測定累積釋放度， 比較馬錢子堿、 包合物、 微孔滲透泵控釋片的體外釋藥行為， 結(jié)果見圖7。 由圖可知， 馬錢子堿釋放速率較低， 而制成包合物后在2 h內(nèi)累積釋放度達(dá)98.34%， 再制成微孔滲透泵控釋片后在12 h 內(nèi)恒速釋藥。

圖7 不同樣品體外釋藥行為比較Fig.7 Comparison of in vitro drug release behaviors of different samples

3 討論

微孔滲透泵控釋片是單層滲透泵控釋片的一種， 主要適用于水溶性藥物[10-12］， 影響體外釋藥行為的主要因素有藥物溶解度、 控釋膜內(nèi)外滲透壓、 包衣膜通透性等。 本實(shí)驗(yàn)將馬錢子堿制成包合物后， 其溶解度得以提高， 同時(shí)在滲透泵片片芯處方中加入一定量滲透活性物質(zhì)NaCl 及助懸劑聚氧乙烯WRS-N-10 時(shí)， 可提高控釋膜內(nèi)外的滲透壓，有助于藥物順利釋放。 另外， 由于片劑在胃腸道滯留的時(shí)間一般為10～12 h， 故將馬錢子堿包合物微孔滲透泵控釋片的考察時(shí)間設(shè)置為12 h。

聚氧乙烯WRS-N-10 作為促滲聚合物， 可增加滲透泵控釋膜內(nèi)外滲透壓， 是片芯處方中不可或缺的重要輔料之一。 本實(shí)驗(yàn)所制備的馬錢子堿包合物微孔滲透泵控釋片12 h 內(nèi)累積釋放度為88.44%，未能完全釋放出去， 這可能是由于一方面聚氧乙烯WRS-N-10 在片芯中不能完全溶解， 故會吸附一定量藥物， 導(dǎo)致其無法完全釋放； 另一方面也與釋藥時(shí)間不夠充分有關(guān)。 圖7 顯示， 馬錢子堿原料藥12 h 內(nèi)累積溶出度僅為46.65%， 這與溶出介質(zhì)未能達(dá)到漏槽條件有關(guān)[13］。

在馬錢子堿包合物微孔滲透泵控釋片制備過程中， 乳糖除了作為稀釋劑、 促滲劑以增加膜內(nèi)外滲透壓等作用外[14-18］， 還可有效防止藥物與NaCl 在壓片過程中形成晶狀結(jié)構(gòu)， 它會導(dǎo)致藥物溶解及溶出困難[19］， 優(yōu)化后其重復(fù)性良好， 體外釋藥行為符合零級模型。 課題組前期通過統(tǒng)計(jì)馬錢子上市品、 醫(yī)院制劑等發(fā)現(xiàn)， 馬錢子總堿（馬錢子堿和士的寧） 每天總用量在2.5 ～14.9 mg 之間[20-21］，而本實(shí)驗(yàn)制備的馬錢子堿包合物微孔滲透泵控釋片中馬錢子堿用量為12.36 mg／片， 盡管體外釋藥行為達(dá)到了設(shè)計(jì)要求， 但后續(xù)還有大量研究要進(jìn)行，如通過體內(nèi)試驗(yàn)來考察其是否安全有效、 劑量是否合適等。