程素盼， 張敏敏， 梁 琰， 張貴民， 蘇瑞強， 耿巖玲， 王 曉?， 趙恒強?

[1. 山東中醫(yī)藥大學藥學院， 山東 濟南250355； 2. 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）， 山東省分析測試中心， 山東省中藥質(zhì)量控制技術重點實驗室， 山東 濟南250014； 3. 山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安271018； 4. 魯南制藥集團股份有限公司， 中藥制藥共性技術國家重點實驗室， 山東省中藥制藥新技術重點實驗室， 山東 臨沂276006］

安神補腦液由淫羊藿、 制何首烏、 鹿茸、 干姜、 甘草、 大棗、 維生素B1 通過現(xiàn)代工藝精制而成， 具有安神健腦、 生精補髓、 益氣養(yǎng)血的功效，臨床上常用于治療腎精不足、 氣血兩虧所致頭暈、乏力、 健忘、 失眠、 神經(jīng)衰弱等癥狀[1-3］， 2015 版《中國藥典》 一部采用HPLC 法測定淫羊藿中淫羊藿苷、 西藥維生素B1 的含有量來對其進行質(zhì)量控制[3］， 也有一些報道采用相同方法測定其中1、 2種成分的含有量[4-9］。 但安神補腦液為中藥復方制劑， 是通過多味中藥中活性成分的協(xié)同作用來發(fā)揮藥效， 上述方法并不能全面反映其整體質(zhì)量。

近年來， 色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術發(fā)展迅速， 因其分離度好、 靈敏度高、 分析周期短等優(yōu)點被廣泛應用于中藥復方制劑的檢測分析， 特別是高分辨飛行時間（TOF／MS） 質(zhì)譜技術能給出化合物的精確分子量信息， 從而進一步推斷出分子式， 可在沒有對照品的情況下結合參考文獻和數(shù)據(jù)庫等進行初步鑒別[10］。 因此， 本實驗建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧飛行時間質(zhì)譜（HPLC-DAD-ESITOF／MS） 法[11-14］分析安神補腦液中化學成分。

1 材料

1.1 儀器 華譜S6000 高效液相色譜儀， 配置自動進樣器、 四元泵、 柱溫箱、 二極管陣列檢測器；Agilent 6520 Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Agilent Technologies 公司）； 電子分析天平（十萬分之一，德國Sartourius 公司）； SB-5200D 高功率數(shù)控超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 維生素B1 （批號SLBG9 093 V）、 甘草苷（批號P25J7F18328）、 2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（批號P25D5S1）、 淫羊藿苷（ 批 號 T09N6B5664 ）、 大 黃 素 （ 批 號P19A7F13264） 對照品（含有量大于98%， 上海源葉生物科技有限公司）； 次黃嘌呤 （批號F20100102） 對照品（含有量大于98%， 國藥集團化學試劑有限公司）； 甘草酸、 6-姜辣素（自制，含有量大于98%）。 安神補腦液（魯南厚普有限公司生產(chǎn)） 于2016 年購自濟南市各大藥店， 批號07115003、 00816047、 00815055、 00816028、07115006、 07115019、 00816002、 00816123、00816103、 00816058， 編號S1 ～S10。 乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）； 甲醇為色譜純（山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）； 甲酸為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）； 無水乙醇為分析純（天津市廣成化學試劑有限公司）； 水為密理博超純水（18 MΩ）。

2 方法與結果

2.1 成分分析

2.1.1 供試品溶液制備 取適量安神補腦液（編號S1） 搖勻， 過0.22 μm 微孔濾膜， 即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素對照品各1.0 mg， 置于1 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 配成1 mg／mL 貯備液，各精密吸取適量于2 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度，制成含500 μg／mL 維生素B1、 100 μg／mL次黃嘌呤、 200 μg／mL 甘草苷、 200 μg／mL 二苯乙烯苷、300 μg／mL 淫 羊 藿 苷、 100 μg／mL 甘 草 酸、100 μg／mL 6-姜辣素、 100 μg／mL 大黃素的溶液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例及2015 版《中國藥典》 一部規(guī)定的工藝， 分別制備缺維生素B1、 淫羊藿、 制何首烏、 鹿茸、 甘草、 干姜的陰性樣品， 按“2.1.1” 項下方法制備， 即得。

2.1.4 色譜條件 Waters XELECTTM HSS T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.4%甲酸 （B）， 梯度洗脫， 程序見表1； 柱溫25 ℃； 檢測波長278 nm； 進樣量10 μL。 色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 質(zhì)譜條件 流動相采用三通分流至0.4 mL／min； 電噴霧正、 負離子模式； 全掃描范圍m／z 100～1 000； 毛細管電壓4.0 kV； 噴霧氣壓310.28 kPa； 干燥氣體積流量10.0 L／min， 溫度325 ℃； 裂解電壓100 V； 錐孔電壓60 V。

2.1.6 ESI-TOF／MS 鑒別 采用ESI-TOF／MS 技術對各成分色譜峰峰進行鑒別， 根據(jù)其精確分子量信息、 DAD 檢測器所得紫外吸收信息、 前期相關文獻、 中國科學院上海有機化學研究所化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫來進行鑒別， 推斷出可能的分子式， 并與相應對照品進行比較以保證準確性。 結果見表2。

2.2 含有量測定

2.2.1 線性關系考察 將“2.1.2” 項下對照品溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度， 在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定。 以成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸， 然后將溶液稀釋至低質(zhì)量濃度， 以3 倍信噪比為檢出限， 10 倍信噪比為定量限， 結果見表3， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗 取供試品溶液（編號S1），在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定6 次， 測得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素保留時間RSD分別為0.32%、 0.14%、 0.29%、 0.31%、 0.20%、0.09%、 0.09%、 0.06%， 峰 面 積 RSD 分 別 為1.05%、 1.90%、 3.50%、 2.31%、 1.29%、 4.71%、1.84%、 3.92%， 表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取樣品（編號S1） 6 份， 按“2.1.1” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定， 測得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、大黃素保留時間RSD 分別為0.33%、 0.24%、 0.45%、0.46%、 0.27%、 0.14%、 0.12%、 0.12%， 峰面積RSD分 別 為 1.89%、 2.56%、 3.38%、 2.87%、 3.90%、4.52%、 2.08%、 2.72%， 表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號S1），在“2.1.4” 項色譜條件下于0、 4、 8、 16、 24 h進樣測定， 測得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素保留時間RSD 分別為0.32%、 0.81%、 0.31%、0.38%、 0.14%、 0.09%、 0.12%， 0.65%， 峰 面積RSD 分別為3.21%、 2.72%、 3.54%、 2.10%、3.76%、 4.52%、 4.06%、 2.72%， 表 明 溶 液 在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 各成分ESI-TOF／MS 鑒別結果Tab.2 Results of ESI-TOF／MS identification of various constituents

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.5 加樣回收率試驗 精密量取含有量已知的樣品（編號S1） 1 mL， 共6 份， 精密加入各對照品適量， 按“2.1.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定， 測得維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、 大黃素平均加樣回收率分別為96.50%、 94.29%、 95.94%、 97.48%、 91.10%、 95.27%、91.47%、 107.50%， RSD 分 別 為 2.78%、 6.36%、6.64%、 2.43%、 3.91%、 5.01%、 4.60%、 4.91%。

2.2.6 樣品含有量測定 按“2.1.1” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定， 計算含有量， 結果見表4。

表4 各成分含有量測定結果（μg／mL）Tab.4 Results of content determination of various constituents （μg／mL）

3 討論

3.1 指標成分選擇 安神補腦液為《金匱要略》收載的養(yǎng)心安神名方甘麥大棗湯的加減方[6］， 方中制何首烏補肝腎， 益精血， 起養(yǎng)心安神之效[15］；鹿茸富含磷脂、 氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)， 在消除疲勞、增強免疫力的同時可改善睡眠質(zhì)量[16］； 淫羊藿具有補腎壯陽、 強筋健骨功效[16］； 干姜溫中散寒，具有養(yǎng)心、 延長睡眠時間的作用[17］； 甘草調(diào)和諸藥。 2015 年版《中國藥典》 中制何首烏、 淫羊藿、干姜、 甘草含有量測定指標分別為二苯乙烯苷和蒽醌（大黃素）、 淫羊藿苷、 6-姜辣素、 甘草苷和甘草酸， 而且維生素B1 具有維持神經(jīng)正常的功能，《中國藥典》 也將其列入[3］， 同時次黃嘌呤也是鹿茸抑制單胺氧化酶的有效成分[18］。 最終， 選擇以上8 種成分作為安神補腦液含有量測定的指標成分。

3.2 色譜柱選擇 本實驗比較了Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、 Waters XELECTTM HSS T3 （3.0 mm×150 mm， 3.5 μm） 色譜柱， 發(fā)現(xiàn)后者對安神補腦液中各成分的分離效果較好。

3.3 流動相選擇 本實驗比較了甲醇-水、 乙腈-水流動相， 發(fā)現(xiàn)后者分離效果較好， 而且峰數(shù)多，基線平穩(wěn)， 同時由于安神補腦液所含成分比較復雜， 等度洗脫難以進行有效分離， 故采用梯度洗脫。 然后， 本實驗又向流動相中加入不同體積分數(shù)（0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.6%） 甲酸， 發(fā)現(xiàn)0.4%甲酸能較好地改善拖尾現(xiàn)象， 并且峰形尖銳。

3.4 柱溫、 體積流量選擇 本實驗調(diào)節(jié)柱溫20、25、 35 ℃， 發(fā)現(xiàn)25 ℃下各成分色譜峰分離度和峰形較好。 安神補腦液中維生素B1 極性很大， 出峰時間過快， 受其他極性成分的影響較明顯， 文獻[9］ 報道， 流動相中加入鹽可延緩該成分出峰時間， 而本實驗采用初始低體積流量的方法也實現(xiàn)了較好分離， 并且操作簡便易行。

3.5 檢測波長選擇 本實驗通過紫外檢測器對樣品進行全波長（190～400 nm） 掃描， 發(fā)現(xiàn)278 nm處各成分色譜峰峰形良好， 基線穩(wěn)定。

4 結論

本實驗建立HPLC-DAD-ESI-TOF／MS 法分析安神補腦液中化學成分， 結果發(fā)現(xiàn)40 種， 并鑒定出其中20 種， 然后測定維生素B1、 次黃嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、大黃素含有量， 可為該制劑藥效物質(zhì)基礎及質(zhì)量評價研究提供方法學支持。