趙熙寧，張 飛，岳 敏，安 茜，宋亞楠，季春麗，崔紅利，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus L.）是莧科（Amaranthaceae）莧屬（Amaranthus）1年生植物，可作為糧、飼、藥、菜等多種用途的救荒作物[1-6]。籽粒莧富含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物和礦物質(zhì)等，其中，種子油脂含量在10%以上，高于玉米、小麥和水稻等一般禾谷類作物，且油脂中角鯊烯等不飽和脂肪酸含量高達(dá)70%～80%[2]，是一種健康型食用油脂資源；籽粒蛋白質(zhì)含量大于30%，接近牛奶[3]；種子貯藏蛋白品質(zhì)好，沒有引起人體過敏反應(yīng)的蛋白，8 種人體必需氨基酸含量均高于其他谷類作物籽粒[4]。因此，籽粒莧營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種營(yíng)養(yǎng)均衡、適宜于所有人群的健康食源。此外，籽粒莧亦是一種優(yōu)良的高產(chǎn)飼料作物，其莖葉柔嫩，適口性好，纖維素含量低，粗蛋白質(zhì)含量為17.7%～27.1%，用作青貯飼料，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。其青貯飼料和籽實(shí)可代替部分精飼料或餌料，用于畜禽及水產(chǎn)業(yè)[5-6]。

源于籽粒莧成熟種子的AMA1 蛋白是一種優(yōu)質(zhì)貯藏蛋白，其中，人體必需氨基酸含量高且均衡。該蛋白不會(huì)導(dǎo)致人體過敏反應(yīng)，所含8 種人體必需氨基酸含量都高于FAO/WHO 建議的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。已有研究將編碼該蛋白的基因AhAMA1 應(yīng)用于水稻籽粒遺傳改良，以提高稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[7]。

本研究從籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus L.）（cv.SX-04）發(fā)育種子中分離到 AMA1 基因編碼序列（AhAMA1），并檢測(cè)其時(shí)空表達(dá)譜；應(yīng)用生物信息學(xué)工具系統(tǒng)分析AhAMA1 蛋白理化特性；進(jìn)一步構(gòu)建AhAMA1 基因組成型植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)滲透侵染法在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉組織瞬時(shí)表達(dá)AhAMA1，檢測(cè)煙葉組織蛋白質(zhì)、油脂、淀粉含量等生理生化性狀，旨在評(píng)估AhAMA1 基因是否可用于改良生物量大的植物營(yíng)養(yǎng)器官蛋白含量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus L.）種質(zhì)（編號(hào)為 SX-04）與本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種質(zhì)材料均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 籽粒莧不同組織總RNA 提取及AhAMA1基因表達(dá)量分析 以播種后40 d 籽粒莧盆栽苗的根、莖、葉以及不同發(fā)育時(shí)期種子（開花后7，12，17，22 d）為材料。按照Trizol 法提取各組織總RNA。-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ趆ttp://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb查找，獲得本氏煙草內(nèi)參基因NtActin 引物NtActin-F，NtActin-R；獲得籽粒莧內(nèi)參基因AHYPO 引物AHYPO-F，AHYPO-R。依據(jù) GenBank 中籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus）AhAMA1 基因轉(zhuǎn)錄本序列（Z11577.1）ORF（915 nt）設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引物：全長(zhǎng)克隆引物AhAMA1-F1（加粗序列為XbaⅠ）、AhAMA1-R1（加粗序列為SmaⅠ）；全長(zhǎng)PCR 引物AhAMA1-F2，AhAMA1-R2；定量 PCR 引物 AhAMA1-F3，AhAMA1-R3（表1）。

表1 PCR引物

1.2.2 AhAMA1 基因ORF 克隆 按照ABM 試劑盒使用方法，以經(jīng)過濃度、純度測(cè)試的發(fā)育種子總RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。高保真PCR 反應(yīng)體系參照說明書：Sterilized ddH2O（20 μL），2×San Taq PCR Mix（25 μL），DNA（1 μL），上游引物（10 μmol/L，2 μL），下游引物（10 μmol/L，2 μL）。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；S1：95 ℃變性 30 s，S2：退火 Tm（表1）30 s，S3：72 ℃延伸 40 s，循環(huán)數(shù)（內(nèi)參、定量×25）（克隆、全長(zhǎng)×35）次；72 ℃，10 min。按照瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（Biomiga公司）操作說明書，將RT-PCR 擴(kuò)增片段純化回收，然后連接到PBI121 表達(dá)載體上。XbaⅠ，SmaⅠ雙酶切驗(yàn)證連接成功后，使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5a 細(xì)胞中，涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基（含卡那霉素），37 ℃倒置培養(yǎng)。挑單克隆于LB 液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，PCR 檢測(cè)后將有目的條帶的菌落送至生工公司對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA 測(cè)序。

1.2.3 AhAMA1 蛋白理化特性的生物信息學(xué)分析通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)Blast 發(fā)現(xiàn)，籽粒莧AhAMA1（AAM09540.1）與籽粒莧凝集素（AAD33922.1）和尾穗莧（Amaranthus caudatus L.）凝集素（AAQ03084.1）氨基酸序列相似性較高，進(jìn)一步通過DNAMAN對(duì)這3 個(gè)蛋白進(jìn)行同源性分析。使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）軟件預(yù)測(cè)AhAMA1的氨基酸理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和總平均疏水性等理化性質(zhì)；通過NCBI 預(yù)測(cè)分析AhAMA1 保守結(jié)構(gòu)域；通過SignalP 分析AhAMA1 信號(hào)肽；通過NetPhos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析AhAMA1 潛在磷酸化位點(diǎn)；通過SOPMA 軟件折疊預(yù)測(cè)分析AhAMA1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SWISSMODEL 對(duì)AhAMA1 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證AhAMA1 基因功能 將重組質(zhì)粒AhAMA1-GFP-PBI121 以及PBI121 空載體通過熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（Agrobacterium）GV3101 中，在含有利福平和卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌檢，將有目的條帶的農(nóng)桿菌和含空載的農(nóng)桿菌重懸后，采用滲透法侵染本氏煙草葉片。所侵染煙草葉片 3 d 后提取RNA，檢測(cè)A－h(huán)AMA1 基因是否表達(dá)；侵染5 d 后的煙葉樣品和對(duì)照煙葉樣品，經(jīng)冷凍干燥后，用于測(cè)定蛋白質(zhì)、油脂、淀粉、必需氨基酸含量等生理生化性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒莧不同組織器官AhAMA1基因表達(dá)分析

使用Trizol 法分別提取籽粒莧根、莖、葉以及不同發(fā)育時(shí)期種子總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），各 RNA 樣品的 28S，18S，5S 條帶完整，質(zhì)量符合試驗(yàn)要求；半定量PCR 檢測(cè)各組織器官AhAMA1 基因表達(dá)表明（圖2），各組織中煙草內(nèi)參基因AHYPO（a）表達(dá)量一致（條帶亮度相同），AhAMA1 基因（b）表達(dá)量有所差異（條帶亮度不同），揭示AhAMA1 基因在所測(cè)各組織中均有表達(dá)，其中在發(fā)育種子中高量表達(dá)。

2.2 AhAMA1基因ORF克隆

以籽粒莧（cv.SX-04）發(fā)育種子RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，用分別帶有XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因引物進(jìn)行高保真PCR，擴(kuò)增AhAMA1 基因ORF，擴(kuò)增的靶基因片段AhAMA1（915 bp）與 GFP（720 bp）基因連接后經(jīng) XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切后電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，PCR 擴(kuò)增的條帶與預(yù)期目的基因條帶（1 635 bp）相符。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，該P(yáng)CR 擴(kuò)增產(chǎn)物序列與AhAMA1 基因ORF 序列完全一致。

2.3 AhAMA1基因植物組成型表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切后的AhAMA1-GFP與經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切的PBI121 表達(dá)載體進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒，再用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，獲得陽(yáng)性菌落。提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定以及DNA 測(cè)序，結(jié)果如圖3所示，AhAMA1 基因 ORF-GFP 亞克隆到 PBI121 載體的多克隆位點(diǎn)，獲得了AhAMA1 基因組成型植物表達(dá)載體AhAMA1-GFP-PBI121（圖4）。

2.4 AhAMA1蛋白的生物信息學(xué)分析

使用NCBI 對(duì)AhAMA1 基因序列進(jìn)行分析可知，AhAMA1 cDNA 全長(zhǎng)為1 183 bp，起始密碼子位于cDNA 的47 bp 處，終止密碼子位于961 bp 處，開放閱讀框（ORF）為915 bp，編碼304 個(gè)氨基酸，其所編碼的蛋白命名為AhAMA1 蛋白（AAM09540.1）。將其與籽粒莧凝集素（AAD33922.1）和尾穗莧凝集素（AAQ03084.1）進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)顯示，其蛋白序列一致性高達(dá)99.12%，親緣關(guān)系很近（圖5）。

應(yīng)用ProtParam 對(duì)AhAMA1 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，其分子式為C1582H2406N412O461S12，原子總數(shù)為 4 873，相對(duì)分子質(zhì)量為 34.96 ku。AhAMA1 蛋白由304 個(gè)氨基酸組成，其中，Arg＋Lys（帶正電）29 個(gè)、Asp＋Glu（帶負(fù)電）30 個(gè)，pI 值6.65；總平均親水性-0.343，是親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)值32.78，屬于穩(wěn)定蛋白。

應(yīng)用NCBI 相關(guān)工具對(duì)AhAMA1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明，該蛋白屬于Agglutinin 超家族（圖6）。SignalP 分析顯示，AhAMA1 蛋白不具有信號(hào)肽。NetPhos 潛在磷酸化位點(diǎn)分析顯示，AhAMA1的磷酸化位點(diǎn)有絲氨酸（11 個(gè)）、蘇氨酸（7 個(gè)）和酪氨酸（8 個(gè)）3 種。

由SOPMA 軟件折疊預(yù)測(cè)分析得出（圖7），該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α 螺旋（藍(lán)色區(qū)域）、伸展鏈（紅色區(qū)域）、β 轉(zhuǎn)角（綠色區(qū)域）和無(wú)規(guī)則卷曲（紫色區(qū)域）組成，且占比分別為11.51%，36.18%，4.93%和47.37%。應(yīng)用SWISS-MODEL 軟件對(duì)AhAMA1 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)圖建模（圖8），結(jié)果表明，該蛋白為單體，無(wú)配體；該蛋白的氨基酸序列與模板序列的一致性達(dá)到61%；X-射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)，該蛋白是同型二聚體。

通過MEGA7 軟件構(gòu)建AhAMA1 蛋白（AAM09 540.1）與其他植物相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化（圖9）結(jié)果顯示，AhAMA1 蛋白與籽粒莧凝集素親緣關(guān)系較近，這些蛋白包括籽粒莧凝集素（AAD33922.1）、尾穗莧凝集素（AAQ03084.1）、藜麥（Chenopodium quinoa willd）蛋白（XP_021738461.1）、葡萄（Vitis vinifera L.）蛋白（XP_002264858.1）、獼猴桃（Actinidia）蛋白（PSS21691.1）、番木瓜（Carica Papaya L.）蛋白（XP_021912292.1）、碧桃（Amygdalus persica L.var.persica f.duplex Rehd.）蛋白（XP_020412901.1）、菠菜（Spinacia oleracea L.）蛋白（XP_021858216.1）、甜瓜（Cucumis melo）蛋白（XP_008460024.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.） 蛋白（XP_016752429.1）、海島棉（Gossypium barbadense Linn.）蛋白（PPS03489.1）、木本棉（Gossypium arboreum（A2））蛋白（XP_017632584.1）和苦瓜（Momordica charantia L.）蛋白（XP_022145136.1）。

2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)AhAMA1基因在煙葉組織瞬時(shí)表達(dá)分析

將重組表達(dá)質(zhì)粒 AhAMA1-GFP-PBI121 和PBI121 空載分別通過熱激法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101 中，在含有利福平和卡那霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌檢。將有目的條帶和含空載的農(nóng)桿菌重懸后侵染煙草葉片。選用侵染2 d 后的煙草葉片提取RNA 檢測(cè)，檢測(cè)AhAMA1 基因是否成功表達(dá)，結(jié)果如圖10，11 所示，AhAMA1 基因在煙葉組織中成功表達(dá)。

2.6 瞬時(shí)表達(dá)AhAMA1基因的煙葉油脂、蛋白質(zhì)和淀粉積累分析

選取侵染5 d 后的煙葉樣品，冷凍干燥后，萃取并測(cè)定蛋白質(zhì)、油脂以及淀粉含量。如圖12 所示，野生型煙草及對(duì)照葉片蛋白含量為11.19%，瞬時(shí)表達(dá)AhAMA1 基因的煙草葉片蛋白含量為22.39%，是野生型煙草的2 倍；油脂及淀粉含量檢測(cè)相比野生型有所降低；必需氨基酸含量相比野生型均有增加（表2），異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸相比野生型分別增長(zhǎng) 42%，53%，33%，48%，47%，11%，14%，21%。

表2 煙葉中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg/g

3 結(jié)論與討論

農(nóng)作物及飼草植物蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成決定其蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和用途。分離一些編碼優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的基因，應(yīng)用于農(nóng)作物等植物的遺傳改良以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來(lái)取得了一些可喜進(jìn)展。ZHENG 等[8]利用PEG 法分別將來(lái)源于豌豆（Pisum sativum Linn）和菜豆（Phaseolus vulgaris Linn）的球蛋白基因整合到水稻基因組中，結(jié)果表明，菜豆球蛋白占總內(nèi)胚乳蛋白質(zhì)的4%。張秀君等[9-11]將馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）花粉特異水溶性蛋白的cDNA 用基因槍法轉(zhuǎn)入玉米（Zea mays L.）中，結(jié)果顯示，獲得的轉(zhuǎn)基因玉米成熟種子蛋白含量提高，賴氨酸提高10%～54%。王為民等[12]將馬鈴薯高賴氨酸基因用基因槍法轉(zhuǎn)入水稻（Oryza sativa）龍?zhí)馗和中優(yōu)早5 號(hào)，結(jié)果顯示，龍?zhí)馗 種子中蛋白質(zhì)含量提高27.69%、賴氨酸含量提高16.15%；中優(yōu)早5 號(hào)種子中蛋白質(zhì)含量提高35.18%、賴氨酸含量提高了45.09%。高越峰等[13]將四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus（L.）DC.）高賴氨酸蛋白基因 Lys 通過基因槍法轉(zhuǎn)入水稻，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株葉片中賴氨酸含量均提高，最高增幅16.04%。王逸群等[14]將從辣椒（Capsicum annuum L.）成熟花粉中克隆的高賴氨酸蛋白基因CFLR 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入谷稈兩用水稻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9 個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片的賴氨酸含量均有提高，最高增幅22.71%。蔣家煥等[15]將四棱豆Lys 基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻臺(tái)粳9 號(hào)，并獲得了轉(zhuǎn)基因抗性植株，野生水稻種子賴氨酸含量?jī)H為0.27%，而轉(zhuǎn)基因水稻種子為0.349%，相比野生型提高了29.3%；轉(zhuǎn)基因水稻種子蛋白含量提高了27.4%，轉(zhuǎn)基因水稻秸稈蛋白含量提高了30.9%。孔維文等[16]將抗蟲基因半夏（Pinellia ternata）凝集素基因PTA 和馬鈴薯的高賴氨酸基因SB401通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法同時(shí)轉(zhuǎn)入雜交水稻1826 中，獲得了含PTA，SB401 基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株。吳超等[17]將四棱豆高賴氨酸基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入脆莖粳稻中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻秸稈中賴氨酸含量最高為0.350%，粗蛋白含量最高為7.27%。李科等[18]將馬鈴薯中高賴氨酸蛋白基因SB401 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)水稻品種日本晴中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9 個(gè)純合的T4水稻轉(zhuǎn)化株系種子的蛋白質(zhì)、賴氨酸和其他氨基酸含量均提高。MOMMA 等[19]將大豆球蛋白基因通過電擊法轉(zhuǎn)入水稻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻種子中大豆球蛋白含量為40～50 mg/g，占種子總蛋白含量的4%～5%。這些研究表明，轉(zhuǎn)基因提高植物蛋白含量和改良蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是可行的，但不同蛋白基因異源表達(dá)產(chǎn)生的效果不同。

許明等[20]采用 RT-PCR 方法，從籽粒莧（cv.千穗谷1 號(hào)）幼嫩種子克隆出AMA1 基因的完整開放閱讀框序列，結(jié)果表明，該序列與GenBank 登錄的籽粒莧AMA1 基因的核苷酸序列只有一個(gè)堿基的差異，但是不影響所編碼氨基酸，原核表達(dá)獲得了相應(yīng)的目標(biāo)蛋白；進(jìn)一步將AMA1 基因在水稻胚乳中特異性表達(dá)，可一定程度提高水稻種子3 種限制性必需氨基酸含量。彭雪娟[7]用胚乳特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AMA1 基因在水稻種子中表達(dá)，改進(jìn)了稻米的蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。TAMáS 等將[21]AMA1 基因通過基因槍轉(zhuǎn)化法成功導(dǎo)入小麥中，結(jié)果使小麥氨基酸含量提高，而且面粉中有關(guān)面粉質(zhì)量的功能參數(shù)得以改善。

本研究從籽粒莧種植材料（cv.SX-04）發(fā)育種子分離到 AhAMA1 的 ORF 序列（916 bp），與 Gen Bank 登錄的籽粒莧AMA1 基因序列完全一致；AhAMA1 編碼304 個(gè)氨基酸，分子量為34.96 ku。表達(dá)分析揭示該基因在發(fā)育種子后期高表達(dá)，與籽粒莧種子蛋白質(zhì)快速富集期相吻合。成功構(gòu)建了AhAMA1的組成型植物表達(dá)載體AhAMA1-GFP-PBI121，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染使其在本氏煙葉組織中瞬時(shí)表達(dá)。煙葉生化測(cè)試顯示，AhAMA1 瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致煙葉組織中蛋白質(zhì)含量顯著提高，含量達(dá)22.39%，是野生型煙草葉片蛋白含量的2 倍；8 種必需氨基酸均有顯著增加，且對(duì)油脂及淀粉含量影響未達(dá)顯著水平。

總之，本研究表明，源于籽粒莧編碼優(yōu)質(zhì)貯藏蛋白（8 種必需氨基酸含量高且均衡）的AhAMA1基因可以應(yīng)用于高生物量植物營(yíng)養(yǎng)器官的蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)遺傳改良，從而提高這些蛋白及8 種必需氨基酸用于功能飼料/餌料或加工其他產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)值。