耿思宇，張姍姍，徐培林，王景雪

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.中山大學(xué)教育部基因工程重點實驗室，廣東 廣州 510275）

油菜是我國重要的油料作物，其外植體高效再生系統(tǒng)的建立對于油菜的遺傳改良、基因功能研究等都具有重要的意義。以往的研究認(rèn)為，基因型、激素等對外植體的高效再生都具有重要作用。油菜不同品種在外植體再生能力方面存在著明顯的基因型依賴性，且多數(shù)品種的分化能力并不理想。因此，在油菜基因轉(zhuǎn)化中，針對不同材料優(yōu)化培養(yǎng)基，建立高效外植體再生系統(tǒng)是進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化的前提。

油菜中外植體的植株再生一般是通過器官發(fā)生的方式實現(xiàn)的。在蕓苔屬中已有用不同外植體如下胚軸[1]、子葉[2]、花莖[3]、葉片[4]、表皮及亞表皮細(xì)胞的薄細(xì)胞層[5]、根系[6]、花藥、小孢子[7-8]、原生質(zhì)體[9-10]等獲得再生植株的報道。植物組織培養(yǎng)涉及因素較多，并且各因素間具有復(fù)雜的相互作用，因此，經(jīng)驗的積累尤為重要。前人雖然已對影響植株再生的諸多因素如培養(yǎng)基、基因型[11-13]、不同外植體之間的差異以及所使用植物激素的數(shù)量[14]等進(jìn)行了研究，但是所用的植物激素僅限于少數(shù)幾種，并且多數(shù)是根據(jù)所用材料選擇高效的植物激素組合，對于不同激素組合的比較研究較少。

對于一個高效的再生體系而言，除了選擇最適宜的培養(yǎng)基和外植體外，還必須保證用于組織培養(yǎng)的供試材料處于良好的生理條件。一般來說，來源于溫室生長的植株以及在無菌條件下生長的無菌苗是較好的外植體來源。OVESNA 等[15]研究表明，供體植株的年齡也會影響外植體的再生能力。對不同遺傳背景材料的植株再生能力的研究表明，不同的遺傳背景對植株的再生能力具有一定的影響，Brassica oleracea 基因組最容易再生，而Brassica rapa最難轉(zhuǎn)化[16]。

本試驗利用3 種不同的油菜基因型材料，對6-BA，NAA，GA3等植物激素以及 AgNO3在下胚軸植株再生中的作用進(jìn)行研究，以明確不同激素種類在外植體再生中的作用，并根據(jù)所選用材料對不同培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，選出了最佳的培養(yǎng)基，進(jìn)而建立甘藍(lán)型油菜的高效外植體下胚軸高效再生體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試油菜品種為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）湘油 14 號、湘油 15 號和 Y03-211，其種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料研究所提供。

供試培養(yǎng)基分為2 種，即誘導(dǎo)油菜再生植株分化培養(yǎng)基（主要成分列于表1）和誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基（以附加和不附加植物激素，組成4 種不同的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，即：RM1.1/2 MS；RM2.MS＋0.2 mg/L NAA；RM3.MS＋0.1 mg/L NAA；RM4.MS＋0.2 mg/L IAA）。

1.2 試驗方法

油菜種子用 0.1%（m/V）HgCl2消毒 8 min，無菌水沖洗 5～6 次，置于 MS 固體培養(yǎng)基上，23～25 ℃，16 h/8 h（白天/黑夜）光照條件下發(fā)芽，制備成無菌苗。將5～6 d 苗齡的無菌苗下胚軸切成約0.5～1.0 cm 的切段，將下胚軸切段分別置于表1所列的培養(yǎng)基上，以誘導(dǎo)外植體在切口處形成愈傷組織和分化再生芽苗。下胚軸切段接種后，觀察不同培養(yǎng)基上外植體開始形成愈傷組織的時間、外植體的出愈率、外植體分化芽苗總數(shù)以及外植體上分化正常苗數(shù)。試驗設(shè)3 次重復(fù)，每個處理接種的外植體數(shù)不小于30 個。

表1 誘導(dǎo)油菜再生植株分化培養(yǎng)基主要成分

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對再生芽苗誘導(dǎo)的影響

下胚軸外植體接種到各種培養(yǎng)基上后，經(jīng)1～2 d，大多數(shù)外植體在切口處開始膨大；到3～4 d 時，切口處開始出現(xiàn)愈傷組織；到7 d 時，外植體切口處愈傷組織誘導(dǎo)基本完成。愈傷組織開始出現(xiàn)時是松散狀的，以后逐漸長成致密狀。從表2可以看出，在供試的培養(yǎng)基中，所有材料都能獲得80%以上的出愈率。說明這些培養(yǎng)基均可以高效地誘導(dǎo)愈傷組織。

表2 不同基因型、不同激素組合的出愈率 %

大約在外植體接種20 d 后，在致密型愈傷組織上先出現(xiàn)綠色小芽點，繼而發(fā)育成小芽苗。從表3可以看出，培養(yǎng)基中植物激素對外植體再生芽苗的分化有重要影響。其中，6-BA 對油菜再生植株分化是必需的，3 個品種在無6-BA 的MN 培養(yǎng)基中，雖然都得到了90%以上的出愈率，但均未獲得再生苗，說明6-BA 是油菜下胚軸芽苗再生所必需的。對不同激素組合的研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型對激素組合的要求不同，多數(shù)情況下6-BA 與GA3的組合優(yōu)于6-BA 和NAA 的組合。就3 個基因型平均分化率而言，MBG 培養(yǎng)基的平均分化率（11.56%）大于MBN 培養(yǎng)基（5.81%）；MB3G 培養(yǎng)基的平均分化率（9.58%）大于MB3N 培養(yǎng)基（1.14%）。

表3 不同基因型、不同激素組合的分化率 %

不同基因型最適合的激素組合不盡相同，如湘油15 號、Y03-211 最適合的培養(yǎng)基為MBG，而湘油14 號最適合的培養(yǎng)基組合為MBN。試驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加GA3，雖然能夠提高再生植株分化率，但是也顯著提高了再生植株中玻璃苗的比例。如湘油15 號在MB3A 培養(yǎng)基上，總分化率為26.00%，其中，正常苗分化率為22.29%；而在MB3AG 培養(yǎng)基上，總分化率為56.51%，其中，正常苗分化率為37.94%。即添加GA3后，總分化率增加30.51%，但是正常苗分化率卻僅增加了15.65%。

2.2 AgNO3在芽苗分化中的作用

表4 AgNO3對不同基因型、不同激素組合分化率的影響 %

從表4可以看出，幾乎在所有的培養(yǎng)基中添加AgNO3都能夠顯著提高正常芽苗分化率。其中，最為明顯的是湘油15 號，其在MBG 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率為11.83%，而在MBGA 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率為38.29%，較MBG 培養(yǎng)基提高了26.46 百分點；湘油14 號在MB3G 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率為7.95%，而在MB3GA 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率則為32.05%，較MB3G 培養(yǎng)基提高了24.10 百分點。

通過對16 種含有6-BA 培養(yǎng)基上的不同品種正常芽苗分化率比較發(fā)現(xiàn)，供試培養(yǎng)基中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L Ag-NO3）培養(yǎng)基最有利于誘導(dǎo)再生植株分化，3 個供試品種的最高正常芽苗分化率（湘油15 號為38.29%；Y03-211 為20.00%；湘油14 號為32.63%）均是在該培養(yǎng)基上得到的（圖1）。因此，將MBGA 培養(yǎng)基作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基。3 個供試品種下胚軸外植體在MBGA 培養(yǎng)基上再生植株分化情況如圖2所示。

2.3 基因型對芽苗分化的影響

從表2，3 可以看出，不同品種再生植株分化能力不同。在培養(yǎng)基成分相同時，3 個供試品種中具有不同的芽苗分化率，說明基因型對芽苗分化具有重要影響。整體來說，湘油14 號再生能力較強，Y03-211 號次之，湘油15 較差。湘油14 號對培養(yǎng)基的適應(yīng)性要比湘油15 號強一些，但是試驗中觀察到湘油14 號在供試培養(yǎng)基上再生苗的玻璃化比湘油15 號嚴(yán)重。本試驗中還發(fā)現(xiàn)，除了培養(yǎng)基成分對玻璃苗的發(fā)生有較大影響外，不同品種在是否容易產(chǎn)生玻璃苗上也表現(xiàn)不同。3 個品種中，玻璃苗發(fā)生最多的是湘油14 號。分化出的玻璃苗表現(xiàn)為葉片水漬狀，葉色是不正常的綠色，葉片發(fā)脆易斷，不能誘導(dǎo)生根。所以，玻璃苗是無效的分化苗，在組織培養(yǎng)過程中應(yīng)該盡量減少其生成。

2.4 生根培養(yǎng)基的選擇

油菜芽苗再生后，要經(jīng)過誘導(dǎo)生根才能成為完整的再生植株。因此，生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果直接影響轉(zhuǎn)化后抗性芽苗發(fā)育成完整的再生植株的概率。一個高效率的生根培養(yǎng)基對提高轉(zhuǎn)化效果十分重要。大約3 cm 長的油菜芽苗移入生根培養(yǎng)基后，10 d 后開始有白色的根狀突起出現(xiàn)，之后根狀突起發(fā)育為不定根；經(jīng)過30 d 左右的生長，發(fā)育為生長良好的根系。

從表5可以看出，油菜生根使用植物生長素NAA 誘導(dǎo)比使用IAA 誘導(dǎo)或不使用植物激素誘導(dǎo)生根效果要好；不同培養(yǎng)基生根率不同，在4 種培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)油菜生根效果最好的培養(yǎng)基是MS＋0.2 mg/L NAA，生根率可以達(dá)到90%。

表5 不同生根培養(yǎng)基比較

3 結(jié)論與討論

本試驗通過不同激素組合培養(yǎng)基的篩選發(fā)現(xiàn)，基因型、激素組合以及培養(yǎng)基中AgNO3的添加對再生植株的分化都具有重要影響。培養(yǎng)基中6-BA 對油菜芽苗分化是必要的，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少6-BA時，3 個品種均無芽苗分化。而NAA 對于愈傷組織的形成和芽苗生根非常重要，培養(yǎng)基中增加NAA時，下胚軸的出愈率明顯增加，這與前人的研究結(jié)果相同[17-18]。已往的研究表明，AgNO3對于包括油菜在內(nèi)的蕓薹屬作物的再生植株分化具有顯著的促進(jìn)作用[19-22]。一般認(rèn)為，AgNO3對芽分化的促進(jìn)作用是AgNO3抑制了植物組織培養(yǎng)中乙烯的生成。本試驗中，AgNO3對于所選用的材料再生植株的高頻率分化具有明顯的促進(jìn)作用；NAA 對誘導(dǎo)愈傷組織和芽苗生根具有重要作用。

油菜的芽苗分化是通過器官分化的途徑發(fā)生的。本研究表明，細(xì)胞分裂素6-BA 對誘導(dǎo)外植體的芽苗分化是必需的，6-BA 與GA3的組合優(yōu)于6-BA與NAA 的組合。在本試驗所選用的油菜材料和培養(yǎng)基組成中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3）培養(yǎng)基最有利于誘導(dǎo)再生植株分化；RM2（MS＋0.2 mg/L NAA）培養(yǎng)基最有利于誘導(dǎo)再生芽苗生根。本研究利用不同的油菜材料建立并完善了高效的外植體再生系統(tǒng)，為建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了一定的基礎(chǔ)。