冀 睿，范小瑞，申 慧，岳美杉，劉怡慧，賀俊平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

體溫下2～8 ℃為睪丸環(huán)境中精子發(fā)生的理想溫度[1]。哺乳動(dòng)物睪丸長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫環(huán)境，生精上皮中各級(jí)生精細(xì)胞受損，嚴(yán)重影響精子發(fā)生，導(dǎo)致生殖能力下降[1-4]。有研究報(bào)道，公豬在夏季精液品質(zhì)下降，導(dǎo)致產(chǎn)仔數(shù)降低、生育能力下降[5]，TUNEL 法檢測(cè)到大量生殖細(xì)胞凋亡[6]。陰囊局部熱刺激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號(hào)上調(diào)[6]，成年食蟹獼猴睪丸43 ℃處理30 min 后，生精細(xì)胞的調(diào)亡比例升高[7]；43 ℃熱處理牛睪丸支持細(xì)胞1 h 后，細(xì)胞凋亡比例降低[8]；43 ℃恒溫水浴處理小鼠睪丸15 min 后，睪丸組織質(zhì)量明顯減少、生殖細(xì)胞凋亡率升高[9]。

死亡受體 Fas（Factor associated suicide）及其配體FasL 是細(xì)胞凋亡外源性通路的重要基因[10]。細(xì)胞膜表面的FasL 可與Fas 蛋白結(jié)合，通過死亡結(jié)構(gòu)域聚合為三聚體復(fù)合物FADD（Fas-associated death domain），該復(fù)合物的N 末端與凋亡執(zhí)行蛋白procaspase-8 進(jìn)而誘導(dǎo)procaspase-3 活化，最終引發(fā)生精細(xì)胞凋亡[11-12]。Fas/FasL 系統(tǒng)是一種免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，該機(jī)制可以抑制由Fas 引起的活化淋巴細(xì)胞的凋亡[13-14]。Fas 配體（FasL，CD-95）是一種Ⅱ型膜結(jié)合蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族，能以死亡受體Fas 為誘導(dǎo)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。

研究報(bào)道，F(xiàn)as，F(xiàn)asL 在人[16]、猴[7]、牛支持細(xì)胞[6]、大鼠[17]、小鼠[12，15]睪丸組織中均有表達(dá)，揭示 Fas，F(xiàn)asL 與哺乳動(dòng)物精子發(fā)生有著密切關(guān)系。而在細(xì)胞凋亡的調(diào)控信號(hào)通路中，死亡受體Fas 及其配體FasL在熱應(yīng)激豬睪丸的表達(dá)是否受影響還未見報(bào)道。

本研究以豬為試驗(yàn)對(duì)象，建立豬睪丸熱應(yīng)激模型，探索細(xì)胞凋亡基因Fas，F(xiàn)asL 在熱應(yīng)激豬睪丸組織中的表達(dá)情況，以闡明Fas，F(xiàn)asL 在熱應(yīng)激豬睪丸生殖細(xì)胞中的影響，旨在為研究Fas，F(xiàn)asL 在豬睪丸中精子發(fā)生的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為9 頭14月齡性成熟長(zhǎng)白公豬。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)隨機(jī)建立3 組熱應(yīng)激模型，每組3 頭，分別為對(duì)照組、環(huán)境熱應(yīng)激組（EHS）、局部熱應(yīng)激組（LHS）。其中，對(duì)照組不作任何處理，室溫（20～25 ℃）圈養(yǎng)在豬舍中，每天正常給水、喂食；環(huán)境熱應(yīng)激組每日將豬飼養(yǎng)在37～40 ℃豬舍中3 h，結(jié)束后趕回室溫豬舍，連續(xù)處理7 d；局部熱應(yīng)激組的豬用自制的可控溫加熱墊覆蓋在左側(cè)睪丸陰囊表面（42 ℃加熱1 h）。各組豬睪丸處理結(jié)束后迅速將豬睪丸組織摘取，其中一部分組織切成1.5 cm3小塊置于Bouin 液固定，用于石蠟組織切片的制作；剩余部分凍存于液氮，用于總RNA、總蛋白的提取。采用qRTPCR 與 Western Blotting 檢測(cè) Fas，F(xiàn)asL 的 mRNA 與蛋白的相對(duì)表達(dá)量，通過免疫組織化學(xué)染色觀察生殖細(xì)胞的定位。

1.2.1 總 RNA 提取、cDNA 合成以及 qRT-PCR 檢測(cè) 各試驗(yàn)組豬睪丸總RNA 由Trizo（lInvitrogen，USA）法提取，1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其在睪丸組織是否表達(dá)完整，采用ND-1000 濃度儀測(cè)定總RNA 濃度。cDNA 由反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，中國(guó)）合成，按照產(chǎn)品說明書標(biāo)注的反應(yīng)體系進(jìn)行基因組DNA 去除，在200 μL 的EP 小管中加入并混勻 2 μL DNA Wipeout Buffer（7×） 以及 1 μg 總RNA，反應(yīng)體系為14 μL，將EP 管常規(guī)放入PCR儀，并設(shè)定42 ℃恒溫條件反應(yīng)2 min；反應(yīng)結(jié)束后，cDNA 合成，反應(yīng)體系為：繼續(xù)在小管中加入并混勻4 μL Quantiscript RT Buffer（5×），1 μL RT Primer Mix，1 μL Reverse-transcription master mix 以及 14 μL TotalRNA，將EP 管常規(guī)放入PCR 儀，設(shè)定加熱反應(yīng)條件：42 ℃，30 min；95 ℃，3 min；4 ℃冷卻。cDNA模板于 -80 ℃保存。Fas，F(xiàn)asL 基因的 CDS 序列以NCBI 提供的Sus scrofa mRNA 全序列為標(biāo)準(zhǔn)，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)并通過華大基因公司合成qPT-RCR 擴(kuò)增引物（表1）。

表1 qRT-PCR 引物序列及片段大小與其擴(kuò)增條件

qRT-PCR 所需相關(guān)試劑由TAKARA 試劑盒提供，18S rRNA 作內(nèi)參基因，基因在樣品的擴(kuò)增過程中，F(xiàn)as，F(xiàn)asL 與內(nèi)參均3 次重復(fù)；在八連管中加樣結(jié)束后，將管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Strata gene Agilent，USA），根據(jù)退火溫度設(shè)置儀器。FasmRNA，F(xiàn)asLmRNA 在對(duì)照組和試驗(yàn)組豬睪丸中相對(duì)表達(dá)量由儀器給出的擴(kuò)增曲線CT 值，結(jié)合18S rRNA對(duì)樣品的標(biāo)準(zhǔn)化，通過2-ΔΔCT計(jì)算得出。

1.2.2 Western Blotting 檢測(cè) 各組豬睪丸組織總蛋白通過蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）與現(xiàn)配的PMSF 提取，濃度由ND-1000濃度儀測(cè)定。SDS-PAGE 凝膠（武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)）配制的成型膠板中，蛋白樣品在每格的上樣量為200 μg，加樣結(jié)束后在80 V 穩(wěn)定電壓電泳1.5 h，電泳結(jié)束后將有目的條帶的膠條轉(zhuǎn)移至NC 膜，轉(zhuǎn)膜1 h，在5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 浸洗，分別加入第1 抗體：Fas（400 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）、FasL（300 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）、GAPDH（2 500 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），密封，4 ℃層析柜搖床14～16 h；一抗孵育結(jié)束，搖床復(fù)溫 30 min，TBST 浸洗 3 次，每次 10 min，加入第2 抗體：山羊抗兔IgG（6 000 倍稀釋，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)），37 ℃孵育 1 h，TBST 浸洗 6 次，每次5 min；通過高靈敏度發(fā)光試劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)）曝光NC 膜，暗室壓膠片曝光蛋白條帶。Fas 蛋白、FasL 蛋白及內(nèi)參GAPDH蛋白的試驗(yàn)結(jié)果由Image J 與相對(duì)表達(dá)量分析。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 二甲苯與梯度酒精對(duì)石蠟切片進(jìn)行透明、脫水，內(nèi)源性過氧化物酶、羊血清封閉液、生物標(biāo)記素、鏈霉菌抗生素以及DAB 顯色液由邁新試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)）提供。每片滴加 50 μL 3%H2O2，37 ℃恒溫孵育10 min，PBS 緩沖液（pH=7.4）浸洗 3 次，每次 3 min；每片滴加50 μL 羊血清封閉液，37 ℃恒溫孵育10 min，甩凈，在陽(yáng)性組各滴加 50 μL 第1 抗體：Fas（200 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）、FasL（150 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），陰性對(duì)照組滴加50 μL 正常非免疫兔血清；室溫?fù)u床30 min 充分混勻，4 ℃孵育 12～14 h；搖床復(fù)溫 30 min，PBS 浸洗3 次，每次 3 min，每片滴加 50 μL 第2 抗體：多聚化山羊抗兔IgG（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)），37 ℃孵育 30 min，PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；DBA 現(xiàn)配，暗光下在各陽(yáng)性組顯色30 s～120 min，蘇木精復(fù)染6 min，蒸餾水浸洗2 次，每次2 min；梯度乙醇與純二甲苯分別進(jìn)行脫水、透明，封片，光學(xué)顯微鏡獲取抗體在切片中細(xì)胞定位的試驗(yàn)結(jié)果。棕色表示抗體在細(xì)胞免疫陽(yáng)性，陽(yáng)性顏色的深淺與范圍表示抗體的表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有與相對(duì)表達(dá)量相關(guān)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS 16.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）與顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FasmRNA與FasLmRNA相對(duì)表達(dá)量

qRT-PCR 結(jié)果顯示，F(xiàn)asmRNA 在對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)量為1.029±0.251，與對(duì)照組相比，環(huán)境熱應(yīng)激組相對(duì)表達(dá)量為1.293±0.192，是對(duì)照組1.256 倍，但差異不顯著（P＝0.304＞0.05）；局部熱應(yīng)激組相對(duì)表達(dá)量為4.123±0.566，是對(duì)照組的4.007 倍，且差異極顯著（P＜0.01）（圖1-A）；FasLmRNA 在對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量為1.001±0.040，與對(duì)照組相比，環(huán)境熱應(yīng)激組相對(duì)表達(dá)量為0.570±0.062，是對(duì)照組的0.569 倍，且差異極顯著（P＜0.01），局部熱應(yīng)激組相對(duì)表達(dá)量為1.509±0.108，是對(duì)照組1.508 倍，且差異極顯著（P＜0.01）（圖1-B）。

2.2 Fas與FasL蛋白在豬睪丸中的相對(duì)表達(dá)量

Western Blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，多克隆兔抗Fas（34 ku）與 FasL（31 ku）在各組豬睪丸蛋白提取物中均有陽(yáng)性免疫反應(yīng)條帶（圖2-A）。Fas 在對(duì)照組中的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.708±0.0738，在環(huán)境熱應(yīng)激組與局部熱應(yīng)激組中的蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照有所升高，分別為 1.208±0.064，1.904±0.053，分別為對(duì)照組的1.706 倍和2.692 倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）（圖2-B）；FasL 在對(duì)照組中的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.735±0.035，在環(huán)境熱應(yīng)激組的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.344±0.011，低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.468 倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），在局部熱應(yīng)激組的蛋白表達(dá)量為0.887±0.026，高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.208 倍，且差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）（圖2-C）。

2.3 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)

2.3.1 Fas 在豬睪丸中免疫組織化學(xué)染色 Fas 在對(duì)照組豬睪丸中免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性物（棕色）著色于精母細(xì)胞細(xì)胞膜，在精原細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈弱陽(yáng)性表達(dá)（圖3-A）；與對(duì)照組相比，F(xiàn)as 在環(huán)境熱應(yīng)激組中于精原細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)與精母細(xì)胞細(xì)胞膜呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖3-B），在局部熱應(yīng)激組中于精母細(xì)胞細(xì)胞膜與圓形精子細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖3-C）。陰性對(duì)照切片以動(dòng)物非免疫血清（羊）替作一抗，未發(fā)現(xiàn)特異性染色（圖3-D）。

2.3.2 FasL 在豬睪丸中免疫組織化學(xué)染色 FasL在對(duì)照組豬睪丸中主要定位于支持細(xì)胞的胞質(zhì)、圓形精子細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核、精母細(xì)胞的胞核與細(xì)胞膜（圖4-A）。與對(duì)照組相比，F(xiàn)asL 在環(huán)境熱應(yīng)激組中在圓形精子細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，支持細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)（圖4-B），在局部熱應(yīng)激組中的支持細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞以及精母細(xì)胞均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖4-C）。陰性對(duì)照切片以動(dòng)物非免疫血清（羊）替作一抗，未發(fā)現(xiàn)特異性染色（圖4-D）。

3 結(jié)論與討論

Fas 及FasL 在各類組織和細(xì)胞中有凋亡調(diào)控的作用[18]，有研究表明，F(xiàn)as 抗體表達(dá)在生精細(xì)胞、FasL 抗體表達(dá)在支持細(xì)胞[16-17]，揭示 Fas 及 FasL 與精子發(fā)生密切相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)asLmRNA 與蛋白的表達(dá)量在環(huán)境熱應(yīng)激組中低于對(duì)照組，在局部熱應(yīng)激組高于對(duì)照組，結(jié)果與43 ℃恒溫水浴加熱小鼠睪丸[9]、熱處理牛支持細(xì)胞[8]結(jié)果相近，揭示FasL 在睪丸局部高溫條件下參與調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞的凋亡，環(huán)境高溫中FasL 可能以自分泌或旁分泌的形式作用于細(xì)胞凋亡的調(diào)控。本研究中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)as 抗體主要免疫陽(yáng)性著色（棕色）于生精細(xì)胞及精子細(xì)胞中，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道并證實(shí)[19-20]。與對(duì)照組相比，F(xiàn)as 在環(huán)境加熱組中，精原細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的免疫陽(yáng)性反應(yīng)物著色度深于對(duì)照組，揭示精原細(xì)胞是熱應(yīng)激敏感的細(xì)胞類型；在局部熱應(yīng)激組中，F(xiàn)as 抗體陽(yáng)性表達(dá)于圓形精子細(xì)胞，揭示圓形精子細(xì)胞對(duì)瞬時(shí)熱應(yīng)激敏感。

對(duì)照組中，F(xiàn)asL 抗體在支持細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞以及精母細(xì)胞都有表達(dá)，支持細(xì)胞上表達(dá)FasL 已有文獻(xiàn)證實(shí)[21-23]，研究表明，F(xiàn)asL 表達(dá)于生殖細(xì)胞[10]，后經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)asL 也表達(dá)在精子細(xì)胞[24]與精母細(xì)胞[25]。在局部熱應(yīng)激組中，F(xiàn)asL 抗體強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，推測(cè)睪丸表面溫度高，睪丸組織內(nèi)生殖細(xì)胞細(xì)胞膜上的蛋白活性升高，死亡受體FasL 大量表達(dá)。

對(duì)照組中FasL 免疫陽(yáng)性反應(yīng)物著色深于環(huán)境熱應(yīng)激組，推測(cè)環(huán)境熱刺激處理后，F(xiàn)as，F(xiàn)asL 抗體的表達(dá)可能不依賴于外源性通路或者由于死亡受體Fas 敏感性太高，少量配體FasL 足夠與其結(jié)合，揭示了生物體自我保護(hù)的一種凋亡方式。

本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)asmRNA 和Fas蛋白在環(huán)境熱應(yīng)激組與局部熱應(yīng)激組中的表達(dá)均升高，揭示Fas對(duì)死亡受體FasL 的敏感性升高。生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞表達(dá)的FasL 都以旁分泌或自分泌形式作用于鄰近的生殖細(xì)胞，促使生殖細(xì)胞凋亡。熱應(yīng)激引起凋亡基因Fas，F(xiàn)asL 在豬睪丸組織中蛋白與mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，以及Fas 與FasL 抗體在睪丸生殖細(xì)胞中定位的改變，揭示Fas，F(xiàn)asL 可能與熱誘導(dǎo)的豬繁殖率下降有關(guān)。