康俊炎，溫澤，潘舵，劉默芳

FXR1通過相分離激活后期精子細(xì)胞中mRNA的翻譯

康俊炎，溫澤，潘舵，劉默芳

中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031

減數(shù)分裂后的單倍體精子細(xì)胞經(jīng)過一系列劇烈形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化，包括細(xì)胞質(zhì)丟棄、細(xì)胞核壓縮、頂體和鞭毛形成等，最終發(fā)育為高度特化的精細(xì)胞或精子，此過程被稱為精子形成(spermiogenesis)[1～3]?；诰蛹?xì)胞的形態(tài)變化，研究人員將小鼠的精子形成過程劃分為16個步驟：第1～8步球形精子細(xì)胞期，第9～11步延長形精子細(xì)胞期，第12～14步長形精子細(xì)胞期，第15～16步精子細(xì)胞則基本發(fā)育完成，呈現(xiàn)典型的彎鉤狀[4]。如此復(fù)雜的精子細(xì)胞發(fā)育過程得以有序進(jìn)行，是因為受到一組時空特異性表達(dá)基因的精細(xì)調(diào)控，這組基因被統(tǒng)稱為精子形成基因(spermiogenic gene)。伴隨著精子形成過程中細(xì)胞核的壓縮，精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性將逐步降低直至完全停止[5]。因此，精子形成基因需提前在精母細(xì)胞或早期球形精子細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為信使核糖核酸(mRNA)，然后以翻譯抑制狀態(tài)儲存于信使核糖核蛋白(mRNPs)中，至特定發(fā)育階段再被激活翻譯，合成蛋白質(zhì)發(fā)揮功能。這個現(xiàn)象被稱為“轉(zhuǎn)錄–翻譯解偶聯(lián)”，是精子細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的典型特征[6]。雖然“轉(zhuǎn)錄–翻譯解偶聯(lián)”過程為精子形成提供了一個基因表達(dá)時空性調(diào)控的精巧機(jī)制，但長期以來并不清楚儲存于精子細(xì)胞中的mRNA是如何被有序激活翻譯的？這也是生殖生物學(xué)中的一個未解之謎。

2022年8月12日，在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越中心劉默芳研究組和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院黃旲研究組的聯(lián)合攻關(guān)成果，報道了她們在小鼠后期精子細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)FXR1通過相分離介導(dǎo)mRNA翻譯激活的最新研究。在這項工作中，研究人員聯(lián)合蛋白組學(xué)篩選，RNA多種組學(xué)分析，體外、體內(nèi)實驗以及多個突變小鼠模型，確認(rèn)RNA結(jié)合蛋白FXR1通過相分離介導(dǎo)小鼠后期精子細(xì)胞中mRNA的翻譯激活，從而保障小鼠精子形成過程正常進(jìn)行[7]。這項工作不但揭示了后期精子細(xì)胞中FXR1介導(dǎo)mRNA翻譯激活的新機(jī)制，而且證明了液液相分離(liquid-liquid phase separation, LLPS)為FXR1激活翻譯及保障精子形成和雄性生育必需。

劉默芳研究組長期致力于精子細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控研究，在近期的一項研究中，她們發(fā)現(xiàn)在球形精子細(xì)胞中，小鼠PIWI (MIWI)蛋白與其相互作用小分子非編碼RNA—piRNA形成的MIWI/ piRNA復(fù)合物，通過招募翻譯起始因子EIF3F和RNA結(jié)合蛋白HuR，激活了一組精子形成相關(guān)mRNA的翻譯[8]。然而，她們的早期研究發(fā)現(xiàn)，在延長形精子細(xì)胞中，MIWI/piRNA通過與脫腺苷酶CAF1相互作用誘導(dǎo)了后期精子細(xì)胞中的mRNA降解和清除[9]，表明MIWI/piRNA在進(jìn)入延長形精子細(xì)胞期后就不再發(fā)揮翻譯激活功能。因此，后期精子細(xì)胞中儲存mRNA的翻譯激活機(jī)制仍不清楚。

為了挖掘后期精子細(xì)胞中潛在的翻譯調(diào)控因子，研究人員首先比較了不同發(fā)育階段小鼠的睪丸活躍翻譯蛋白組分。結(jié)果顯示，脆性X綜合征相關(guān)蛋白(Fragile X related protein, FXR)家族成員FXR1大量存在于包含后期精子細(xì)胞的成年小鼠睪丸多聚核糖體翻譯組分中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR1結(jié)合一大群特異性在后期精子細(xì)胞中翻譯的mRNA，且與EIF4G3等多個翻譯相關(guān)因子存在相互作用。上述實驗結(jié)果提示FXR1可能參與了后期精子細(xì)胞中的mRNA翻譯調(diào)控。此前有研究發(fā)現(xiàn)，全身敲除引起小鼠在胚胎期心肌、骨骼肌等發(fā)育不良，最終導(dǎo)致其在圍產(chǎn)期死亡[10]。因此，為探究精子細(xì)胞中FXR1對于其結(jié)合mRNA的調(diào)控作用，研究人員構(gòu)建了在生殖細(xì)胞中特異性敲除的突變小鼠。結(jié)果顯示，F(xiàn)XR1所結(jié)合mRNA在精子細(xì)胞中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，但翻譯活性明顯下降；敲除小鼠精子形成受阻、雄性不育。這些發(fā)現(xiàn)表明FXR1對后期精子細(xì)胞中mRNA的翻譯激活和精子細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要。

研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，成年小鼠中FXR1特異性地在睪丸組織高表達(dá)，且在后期精子細(xì)胞中的表達(dá)水平劇烈增加。更有意思的是，F(xiàn)XR1在后期精子細(xì)胞的胞質(zhì)中呈現(xiàn)明顯顆粒狀分布。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)與核酸可通過多價相互作用介導(dǎo)的液–液相分離在細(xì)胞內(nèi)形成無膜包被的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實現(xiàn)特定細(xì)胞過程的精確時空控制[11,12]，其中最典型的例子就是由RNA結(jié)合蛋白與RNA組成的核糖核蛋白顆粒(mRNP granules)[13]。FXR1同源蛋白FMR1曾被報道具有相分離能力，并與FMR1的翻譯抑制功能相關(guān)[14]。研究人員進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR1蛋白可在體外和體內(nèi)自發(fā)聚集形成高度動態(tài)的液滴或顆粒結(jié)構(gòu)，且高效富集mRNA于這些結(jié)構(gòu)之中。有趣的是，后期精子細(xì)胞中的FXR1顆粒同時富集EIF4G3等翻譯相關(guān)因子及FXR1靶mRNA。因此，研究人員推測FXR1可能通過相分離形成FXR1顆粒，進(jìn)而參與了mRNA的翻譯調(diào)控。為了驗證這一猜想，研究人員通過可表征RNA翻譯狀態(tài)的TRICK報告系統(tǒng)[15]與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，分別在體外培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)后期精子細(xì)胞中探究了FXR1顆粒形成與否和mRNA翻譯激活的相關(guān)性。結(jié)果顯示，野生型FXR1蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)形成顆粒，并激活靶mRNA的翻譯；相分離能力缺失的FXR1突變體(FXR1L351P)不能形成顆粒，雖然可以結(jié)合靶mRNA，但不能激活其翻譯；在FXR1L351P末端融合FUS蛋白IDR區(qū)段重建相分離能力的融合蛋白(FXR1L351P-IDRFUS)恢復(fù)了胞內(nèi)顆粒形成能力及激活靶mRNA翻譯的活性。最后，為了明確FXR1相分離對于小鼠精子形成及可育性的重要性，研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了生殖細(xì)胞中特異性敲入FXR1L351P小鼠模型(Fxr1)。結(jié)果顯示，在Fxr1后期精子細(xì)胞中，F(xiàn)XR1靶mRNA的翻譯活性明顯降低，Fxr1小鼠精子形成受阻、雄性不育。上述結(jié)果共同表明，F(xiàn)XR1相分離介導(dǎo)的mRNA翻譯激活為小鼠精子形成及雄性生育必需。

綜上所述，在后期精子細(xì)胞中特異性高表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白FXR1通過相分離形成FXR1顆粒，同時招募EIF4G3等翻譯相關(guān)因子，介導(dǎo)了一群后期精子細(xì)胞發(fā)育必需基因的翻譯激活，從而保障了精子細(xì)胞發(fā)育的正常進(jìn)行(圖1)。這項研究工作發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR1在后期精子細(xì)胞mRNA翻譯激活中扮演了重要角色，揭示了精子細(xì)胞翻譯調(diào)控的新機(jī)制。同時，不同于以前“mRNP 顆粒是用于儲存翻譯抑制狀態(tài)mRNA”的認(rèn)識，該研究發(fā)現(xiàn)FXR1相分離為其翻譯激活作用必需，提示mRNP 顆粒也參與翻譯激活過程。此外，該研究發(fā)現(xiàn)相分離缺陷Fxr1敲入小鼠精子形成受阻且雄性不育，重現(xiàn)了敲除小鼠表型，證明了相分離具有重要的生理意義。

圖1 FXR1相分離介導(dǎo)后期精子細(xì)胞mRNA翻譯激活并驅(qū)動精子形成

在小鼠精子細(xì)胞的發(fā)育過程中，F(xiàn)XR1蛋白水平逐漸升高并通過液液相分離在后期精子細(xì)胞中形成顆粒，富集mRNA、招募翻譯機(jī)器，促進(jìn)翻譯、保障精子細(xì)胞發(fā)育和精子形成。根據(jù)文獻(xiàn)[7]修改繪制。

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2022-08-02;

2022-08-12

國家重點研發(fā)計劃項目(編號：2017YFA0504400，2021YFC2700200)，國家自然科學(xué)基金項目(編號：91940305，31830109，31821004，32171186，91940302，31961133022，32170815，91640201)，中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(編號：XDB19010203)，上海市科委(編號：2017SHZDZX01，19JC1410200，17JC1420100，21PJ1413800，21ZR1470200)，上海高水平地方高校創(chuàng)新團(tuán)隊(編號：SHSMU-ZDCX20210902)，國家博士后創(chuàng)新人才支持計劃(編號：BX20180331，BX20190081)，中國博士后科學(xué)基金(編號：2018M642018，2020M670986)，生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室開放基金(編號：SKLRM-K202101)，基因工程教育部重點實驗室資助 [Supported by the National Key R&D Program of China (Nos. 2017YFA0504400, 2021YFC2700200), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 91940305, 31830109, 31821004, 32171186, 91940302, 31961133022, 32170815, 91640201), the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No. XDB19010203), the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (Nos. 2017SHZDZX01, 19JC1410200, 17JC1420100, 21PJ1413800, 21ZR1470200), the Innovative Research Team of High-level Local Universities in Shanghai (No. SHSMU-ZDCX20210902), the National Postdoctoral Program for Innovative Talent Grant (Nos. BX20180331, BX20190081), China Postdoctoral Science Foundation (Nos. 2018M642018, 2020M670986), the Open Fund of State Key Laboratory of Reproductive Medicine (No. SKLRM-K202101), and the Foundation of Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education]

康俊炎，博士，研究方向：非編碼RNA在精子發(fā)生中的功能機(jī)制。E-mail: kangjunyan@sibcb.ac.cn

劉默芳，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：非編碼RNA在癌癥發(fā)生和精子發(fā)生中的功能機(jī)制。E-mail: mfliu@sibcb.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-254