姜明亮，郎紅，李曉楠，祖野，趙靖，彭沈凌，劉振，戰(zhàn)宗祥，樸鐘云

植物孤基因研究進(jìn)展

姜明亮1，郎紅1，李曉楠2，祖野2，趙靖1，彭沈凌1，劉振1，戰(zhàn)宗祥2，樸鐘云2

1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，吉林 132101 2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽(yáng) 110866

孤基因(orphan genes)處在一個(gè)特殊的進(jìn)化分支上，和其他任何已鑒定的基因沒有顯著的序列相似性。孤基因普遍存在于每個(gè)物種中，比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所有已測(cè)序的物種中均包含一部分孤基因，不同的篩選條件所獲得的數(shù)量不等。孤基因經(jīng)常與各種脅迫響應(yīng)、物種特異性進(jìn)化和物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)。但多數(shù)孤基因沒有被很好的注釋，甚至沒有可以被識(shí)別的功能結(jié)構(gòu)域，為孤基因的功能表征帶來了一定困難。相對(duì)于保守基因而言，孤基因的研究較少，這就導(dǎo)致了孤基因的重要性可能被“埋沒”。本文從孤基因起源與進(jìn)化、植物孤基因篩選及功能等方面進(jìn)行了綜述，并分析了目前存在的挑戰(zhàn)和未來的研究重點(diǎn)與解決方案，以期為研究孤基因功能及其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

植物孤基因；起源；進(jìn)化；篩選；基因功能

隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的物種基因組被測(cè)序，進(jìn)而科研人員對(duì)孤基因(orphan genes)的關(guān)注與研究也日益增加[1]。孤基因，也叫譜系特異性基因(lineage-specific genes)、分類學(xué)上限制基因(taxonomically restricted genes, TRGs)，或稱為orphans[2～4]。這些基因與之前已經(jīng)鑒定出來的基因沒有序列相似性，孤基因的概念最先在酵母()基因組測(cè)序研究中被提出，人們發(fā)現(xiàn)酵母基因組中有將近30%的基因?qū)儆诠禄蚍懂燵5～9]。這類基因也可被細(xì)分為科特異、屬特異或種特異孤基因等。研究表明，孤基因可能與各種生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)、重要的物種特異性適應(yīng)過程或物種特異性性狀相關(guān)，也可能參與某些重要的信號(hào)途徑或?qū)τ谀承┬碌姆烙鶛C(jī)制起到重要作用[10～12]。孤基因的起源有多種方式，例如從非編碼序列衍生，或起源于基因復(fù)制、馴化的轉(zhuǎn)座子、早期移碼突變和重疊/反義讀框等[11,13]。此外，孤基因進(jìn)化速度非?？?，并伴隨著更低的轉(zhuǎn)錄水平或組織特異性表達(dá)[14]。許多研究已經(jīng)證實(shí)，鑒定孤基因的策略主要是通過比較分析已經(jīng)測(cè)序的各個(gè)物種基因組來實(shí)現(xiàn)的[1]。

1 孤基因的起源與進(jìn)化

自下一代測(cè)序技術(shù)(next generation technologies)問世以來，對(duì)眾多基因組分析表明，孤基因廣泛存在于各種生物體中[15,16]。孤基因代表著分類學(xué)中最特殊的一個(gè)方面，位于基因組學(xué)、遺傳學(xué)、比較和結(jié)構(gòu)生物學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)和進(jìn)化論的交叉點(diǎn)，這就使得利用傳統(tǒng)方法研究孤基因變得尤為困難[17]。有機(jī)體中蛋白數(shù)量相對(duì)恒定，促使物種進(jìn)化過程中基因的產(chǎn)生和滅絕要處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，同時(shí)假設(shè)眾多孤基因組成了一個(gè)巨大的、動(dòng)態(tài)的“新基因庫(kù)”，比較合理的解釋就是部分新進(jìn)化基因的產(chǎn)生源于孤基因的進(jìn)化成熟[18]。隨著孤基因的出現(xiàn)，并在基因組中固定下來，能夠參與生命活動(dòng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是其進(jìn)化成熟的標(biāo)志[11]。孤基因來源于新產(chǎn)生的蛋白編碼基因，是新興的從非基因序列中產(chǎn)生的，被認(rèn)為是古老基因的后裔，但其編碼序列已經(jīng)變得難以被識(shí)別[6,19]。

分類單元中的保守基因能為研究物種核心進(jìn)程提供依據(jù)，而分類單元中的孤基因則能為物種進(jìn)化進(jìn)程和生物功能的研究奠定基礎(chǔ)[20]。研究表明，通過對(duì)孤基因的基因組背景和序列進(jìn)行分析，可以追溯其起源，有些可以追溯到基因復(fù)制(gene duplica-tion)的高度歧化產(chǎn)物[21,22]，或起源于重疊/反義閱讀框(overlapping or anti-sense open reading frames)，或從非編碼序列區(qū)域(non-coding sequence regions)衍生，但是因基因復(fù)制而產(chǎn)生新功能的旁系同源基因(paralogues)并不屬于孤基因的范疇[11,20,23]。一些孤基因含有轉(zhuǎn)座因子，促進(jìn)了孤基因的形成，這已經(jīng)成為孤基因進(jìn)化的主要模式，也就是常說的孤基因衍生于馴化的轉(zhuǎn)座子(domesticated transposons)[6]。也有許多研究表明，早期移碼突變(early frame-shift mutations)產(chǎn)生的新基因中也包含一部分孤基因，由于測(cè)序的物種越來越多，基因組密度也越來越大，這一起源方式會(huì)變得更容易被識(shí)別[24]。研究普遍認(rèn)為非基因區(qū)域是新基因起源之地，但是現(xiàn)在對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)的調(diào)控模式、序列和功能結(jié)構(gòu)還知之甚少，因此這類基因是如何形成的還很難被預(yù)測(cè)[17]。

孤基因可能是從非編碼序列重新進(jìn)化而來，或者是從舊的編碼序列中衍生出來[11]。研究表明，擬南芥()中超過50%的孤基因和琴葉擬南芥()的非編碼區(qū)域具有相似性，推斷這些孤基因的出現(xiàn)似乎是從頭形成()[25]。研究證實(shí)，一個(gè)物種基因庫(kù)中從頭產(chǎn)生的新基因可能比零星的基因復(fù)制更普遍，也是孤基因產(chǎn)生的主要方式之一[26～30]。新產(chǎn)生的孤基因在適應(yīng)環(huán)境或人工馴化過程中隨著時(shí)間變成熟[31]。對(duì)擬南芥、酵母等物種孤基因分析發(fā)現(xiàn)，新進(jìn)化孤基因的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度通常更短，這主要是由于孤基因在進(jìn)化過程中擁有更少的外顯子，而在某些物種中則是外顯子長(zhǎng)度顯著變短[32,33]。近來研究發(fā)現(xiàn)，大豆()中21.7%的基因?yàn)樽罱鹪吹墓禄?，且主要以單拷貝形式存在[34]。孤基因的成熟是隨機(jī)的、且隨著時(shí)間的推移而變得特異化[35]。孤基因的進(jìn)化顯得更加快速或“激進(jìn)”。水稻()孤基因中的微衛(wèi)星(microsatellites)和低復(fù)雜度區(qū)域(low-com-plexity regions)顯得更為普遍，這些區(qū)域一度被認(rèn)為是基因進(jìn)化的強(qiáng)大推動(dòng)力[25]。Plissonneau等[36]分析了小麥()真菌病原菌菌株()的完整基因組的進(jìn)化孤區(qū)域，表明病原體具有廣泛的染色體結(jié)構(gòu)多態(tài)性，可能推動(dòng)毒力的進(jìn)化。此外，孤基因是富含編碼假定效應(yīng)子的基因，其中包括一個(gè)在小麥感染病菌期間上調(diào)最大的假定效應(yīng)子基因[36]。年輕基因的前景如何主要取決于其能否安全快速的融入到重要的生命進(jìn)程或代謝網(wǎng)絡(luò)中，對(duì)酵母中孤基因的研究表明，調(diào)控過程出現(xiàn)很快，但是在蛋白與蛋白互作方面發(fā)展的較為緩慢[37]。雖然孤基因的起源和進(jìn)化仍然是一個(gè)謎，但是孤基因的出現(xiàn)有助于人們理解物種進(jìn)化是如何發(fā)生的，因此需要使用基因組和轉(zhuǎn)錄組等數(shù)據(jù)來加速對(duì)孤基因的篩選和研究。

2 植物孤基因的篩選

2.1 影響植物孤基因篩選的因素

隨著許多物種基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的陸續(xù)公布，使得孤基因和保守基因的篩選和鑒定變?yōu)榭赡躘38]。目前，孤基因的篩選和鑒定主要通過與表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequences tags, ESTs)、非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant database, nrdb)或已經(jīng)完成測(cè)序的各種基因組進(jìn)行比較分析來完成。影響孤基因篩選的因素有很多，主要包括：

(1)篩選程序。比較分析的程序主要圍繞BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)展開，包括BLASTP、TBLASTN、BLASTN、TBLASTX、PSI- BLAST和BLAT (BLAST-Like Alignment Tool)等。在相似條件下，不同程序的組合篩選所獲得的孤基因數(shù)量不同。

(2)-value。利用不同-value篩選得到的孤基因數(shù)量大不相同，例如對(duì)楊樹()基因組中孤基因的篩選，不同-value使得篩選結(jié)果存在較大差異，-value越大，所獲得的孤基因數(shù)量越少，反之越多[39,40]。目前，普遍采用的-value為1E-03甚至更低，而最高的1E-01相對(duì)較為寬松，但較少采用。

(3)所比對(duì)的近源物種基因組數(shù)量以及數(shù)據(jù)庫(kù)更新時(shí)間。比對(duì)的近源物種基因組數(shù)量越多可能得到的孤基因越少，但質(zhì)量越高。數(shù)據(jù)庫(kù)隨著時(shí)間的推移而更新，注釋的基因數(shù)量逐步增加，保守基因更容易被識(shí)別，從而在孤基因中被剔除掉，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性也越來越高。

(4)基因組組裝和注釋質(zhì)量。不同基因組版本影響孤基因的篩選，尤其是基因組的注釋質(zhì)量對(duì)孤基因的篩選影響更大。例如水稻TIGRv5基因組中的孤基因比TIGRv2中少，但準(zhǔn)確性卻得到大幅度提升[39,41]。此外，還會(huì)有更多的條件影響孤基因的篩選，如所屬不同譜系中的孤基因、特定脅迫條件中的孤基因等。

2.2 植物孤基因的普遍存在性

隨著越來越多的物種基因組測(cè)序的完成，人們發(fā)現(xiàn)孤基因普遍存在于每個(gè)物種中，占比從小于1%～32%不等，且利用不同條件所篩選得到的孤基因數(shù)量不同[14,42]。植物孤基因的篩選工作始于擬南芥，Lin等[20]將擬南芥基因組序列與8個(gè)已測(cè)序的植物基因組序列、植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)組裝的特異轉(zhuǎn)錄本和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較分析，鑒定了1324個(gè)擬南芥特異基因(lineage-specific genes,) (表1)，通過一系列生物信息學(xué)分析證實(shí)了孤基因在蛋白水平上進(jìn)化速度較快，同時(shí)也表明在花器官中具有更高的甲基化程度。而利用更高的-value (1E-01)進(jìn)行篩選，在擬南芥中只鑒定到165個(gè)孤基因，并發(fā)現(xiàn)一些孤基因在脅迫條件下優(yōu)先在花、根中表達(dá)，或上調(diào)表達(dá)[39]。同樣，Donghue等[25]也對(duì)擬南芥孤基因進(jìn)行了篩選，共鑒定了958個(gè)擬南芥特異基因，并證明孤基因的表達(dá)具有組織特異性，在多個(gè)組織和多個(gè)發(fā)育階段中呈現(xiàn)低表達(dá)水平，同時(shí)孤基因在響應(yīng)一系列非生物脅迫過程中顯著富集。

Jiang等[43,44]利用更嚴(yán)格的篩選方法，將白菜()基因組和89個(gè)已測(cè)序植物基因組、植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的267個(gè)物種的特異轉(zhuǎn)錄本和nrdb等進(jìn)行比對(duì)，最終在白菜基因組中鑒定了529個(gè)蕓薹種孤基因(orphan genes,)。通過對(duì)水稻孤基因的篩選和分析，利用不同的篩選程序和-value等，分別篩選獲得37個(gè)[45]和1926個(gè)[41]孤基因。Guo等[41]對(duì)水稻中篩選得到的1926個(gè)孤基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明微衛(wèi)星在孤基因進(jìn)化和表達(dá)過程中起到重要作用。Yang等[39]借助于BLASTP和TBLASTN程序分別從水稻和楊樹中鑒定到638和109個(gè)孤基因，證實(shí)孤基因在少外顯子的基因上進(jìn)行富集，同時(shí)也表明草本和木本植物、單子葉植物和雙子葉植物之間的功能存在差異。此外，楊樹孤基因可作為研究碳固定和生物燃料的候選基因[39]。Lin等[40]利用楊樹基因組和30個(gè)已經(jīng)測(cè)序的基因組進(jìn)行比對(duì)分析，篩選得到40個(gè)孤基因，和楊樹基因組以外的任何序列沒有相似性，同時(shí)也沒有功能注釋，并通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些孤基因可能在木本植物中參與譜系特異性生物學(xué)進(jìn)程。

Li等[46]利用BLAST和基于微陣列的基因組雜交方法，鑒定了578個(gè)豇豆()孤基因。Graham等[47]利用BLAST比較分析鑒定了2525個(gè)豆科(Leguminosae)特異EST contigs，這些基因中只有不到3%和已經(jīng)表征的豆科基因存在明顯的同源性，分析表明孤基因中的一類CCPs (Cys cluster proteins)中的大多數(shù)基因的進(jìn)化是通過本地復(fù)制和歧化選擇而來。此外，多個(gè)植物基因組中的孤基因被鑒定，包括蠟燭果()[48]、甜橙()[49～51]、木豆()[52]、高粱()[53,54]、玉米()[54]、二穗短柄草()[54]、煙草()[55]、馬鈴薯()[55,56]、番茄()[55]、辣椒()[55]、矮牽牛()[55]、小麥[53]、蘋果(Borkh.)[57]和葡萄()[58,59]等。對(duì)孤基因的序列特征分析表明，與進(jìn)化保守基因相比，孤基因具有更低的多外顯子基因占比、更高的GC含量和更短的序列長(zhǎng)度，在進(jìn)化上顯得更加“激進(jìn)”和快速。

隨著比較基因組學(xué)的不斷發(fā)展，多個(gè)篩選和鑒定孤基因的數(shù)據(jù)庫(kù)、軟件、程序或網(wǎng)頁(yè)被建立，如ORFanFinder在線服務(wù)器(http://cys.bios.niu.edu/ orfanfinder)[60]、ATTED-II共表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// atted.jp)[61]、GreenPhylDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://greenphyl. cirad.fr)[62,63]、小麥孤基因數(shù)據(jù)庫(kù)TOGD[64]、禾本科孤基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.ahau.edu.cn/pogd)[54]和SMOTE-ENN-XGBoost等[65]。多個(gè)物種的孤基因已經(jīng)被篩選和鑒定，針對(duì)孤基因表達(dá)的模式分析證實(shí)了其在進(jìn)化過程中可能起到的重要作用。

綜上所述，孤基因的篩選工作證實(shí)了孤基因的普遍存在性，代表性植物孤基因的篩選結(jié)果見表1。但是，絕大部分孤基因的功能還是未解之謎，今后需要進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證及解析其功能。

3 植物孤基因功能研究

孤基因表達(dá)具有高度特異性和低水平表達(dá)特征，參與多種生物和非生物脅迫響應(yīng)，具有調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和影響物種特異性進(jìn)化等功能[66]。雖然孤基因功能研究較為緩慢且成果較少，但隨著植物中第一個(gè)擬南芥孤基因(, AT3G30720)功能被表征[11,67～69]，關(guān)于植物孤基因功能研究的報(bào)道不斷涌現(xiàn)，正逐步揭開其神秘的面紗。

3.1 特異調(diào)控表達(dá)模式

擬南芥中發(fā)現(xiàn)的孤基因與保守基因相比，在花組織中的甲基化程度更高，并且具有更高的組織特異性和更低的表達(dá)水平[20,25]。研究表明，39個(gè)、47個(gè)和39個(gè)水稻特異基因分別在花組織、雌蕊組織和根組織中表現(xiàn)出較高水平的特異表達(dá)[39]。7個(gè)、12個(gè)、15個(gè)和5個(gè)楊樹特異基因分別在雌花、木質(zhì)部、形成層和葉組織中表現(xiàn)出相對(duì)較高的特異表達(dá)水平[39]。Lin等[40]研究表明，孤基因在幼葉或成熟葉、莖皮和根中的表達(dá)與對(duì)應(yīng)的組織發(fā)育有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)。大多數(shù)在白菜的不同器官、組織和發(fā)育階段均有表達(dá)，少數(shù)表現(xiàn)出組織特異性、器官特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)模式[43]。豇豆孤基因也被認(rèn)為是在人工選擇條件下，維持馴化作物農(nóng)藝性狀和適應(yīng)性性狀平衡的一個(gè)主要因素[46]。此外，蠟燭果特異基因(-specific genes,)呈現(xiàn)高度組織特異性表達(dá)[48]；甜橙孤基因優(yōu)先在愈傷組織中表達(dá)[49]。因此，植物孤基因表現(xiàn)出了特異調(diào)控表達(dá)模式。

表1 代表性植物孤基因篩選結(jié)果

—：表示參考文獻(xiàn)中未計(jì)算孤基因的比例；BLAST：Basic Local Alignment Search Tool；BLAT：BLAST-Like Alignment Tool。

3.2 脅迫響應(yīng)

高度脅迫特異響應(yīng)是孤基因的重要特征之一[70]。在擬南芥中，十字花科特異基因()及其在甘藍(lán)()中的同源基因()的超量表達(dá)能提高植株對(duì)維管束枯萎病的抗性，同時(shí)超量表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的耐旱特性[71]。在煙草中，超量表達(dá)和基因也能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病菌的抗性，這說明孤基因在不同物種中具有相似功能。同樣，在擬南芥和大豆中超量表達(dá)擬南芥孤基因增強(qiáng)了植株對(duì)蚜蟲、真菌和病毒的抗性，同時(shí)表明基因通過調(diào)節(jié)初級(jí)代謝和環(huán)境變化之間的復(fù)雜關(guān)系，來參與對(duì)生物/非生物干擾的優(yōu)化和耐受性調(diào)節(jié)[11,72,73]。2個(gè)擬南芥特異性POFs (proteins with obscure features)也能提高氧化應(yīng)激的耐受性[74]。小麥中的早熟禾亞科特異基因()能增強(qiáng)宿主對(duì)產(chǎn)毒性禾谷鐮刀菌()的抗性[31]。利用酵母雙雜交文庫(kù)篩選和雙分子熒光互補(bǔ)等方法發(fā)現(xiàn)TaFROG能與TaSnRK1α蛋白(sucrose non-fermenting-related kinase 1α)相互作用，這種互作增強(qiáng)了小麥對(duì)病菌的抗性，為小麥育種提供了新的抗性基因源[31]。TaFROG還能在植物體內(nèi)與NAC-like轉(zhuǎn)錄因子TaNACL-D1和TaSnRK1α形成不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物，構(gòu)成了小麥族內(nèi)響應(yīng)病害調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分[75]。此外，Osp24 (orphan secreted protein 24)通過與TaFROG競(jìng)爭(zhēng)和TaSnRK1α的結(jié)合區(qū)域，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)因子的作用，證實(shí)了宿主和真菌病原體的孤蛋白在相互作用過程中的抵消作用[76]。Osp24和TaFROG分別是病原體和宿主中的孤蛋白，在真菌與植物的相互作用中，二者都可能受到共同進(jìn)化的影響[76]。另一項(xiàng)關(guān)于小麥孤基因的研究發(fā)現(xiàn)，孤基因和能與小麥赤霉病菌分泌的小蛋白相互作用，這種互作增強(qiáng)了小麥對(duì)赤霉病的抗性，表明孤基因是小麥和赤霉病菌共同進(jìn)化的重要組成部分，是調(diào)節(jié)抗性的潛在候選基因[77]。根腫菌()作為一種土傳病害，能特異性侵染多種十字花科植物，導(dǎo)致根腫病的發(fā)生[78,79]。白菜在遭受根腫菌侵染條件下，52個(gè)中的41個(gè)能響應(yīng)根腫菌脅迫，其中39個(gè)上調(diào)表達(dá)，結(jié)果表明可能在蕓薹屬植物應(yīng)對(duì)生物脅迫中起重要作用[43]。然而，在白菜與根腫菌相互作用中的功能還需要深入研究。水稻AA基因組譜系特有的羥基肉桂酰酪胺(hydroxycinnamoyl tyra-mine, HT)基因簇(、、和)，被證實(shí)有助于增強(qiáng)水稻抗病性，該基因簇通常在特定組織或脅迫下表現(xiàn)出共表達(dá)模式[80]。此外，水稻中新發(fā)現(xiàn)的抗病孤基因，能在單子葉植物和雙子葉植物中誘導(dǎo)高度敏感反應(yīng)，表明新抗性基因可擴(kuò)展到野生水稻之外，包括野生禾本科植物[81]。對(duì)單子葉植物特有的脂肪族酚胺–羥基肉桂酰腐胺(hydroxycinnamoyl putrescine, HP)基因簇的遺傳和生化分析表明，和對(duì)水稻免疫和細(xì)胞死亡具有積極的調(diào)節(jié)作用[82]。

孤基因是可用于識(shí)別參與某些環(huán)境適應(yīng)的新基因，被視為一種有價(jià)值的基因資源。在擬南芥中超量表達(dá)唇形科特異孤基因()能對(duì)根冠性狀產(chǎn)生重大影響，并調(diào)節(jié)植株對(duì)干旱脅迫敏感性[83]。深入的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，的5′-UTR表達(dá)變化是通過與負(fù)調(diào)節(jié)因子MYB基因SIN_ 1023179 (SiMYB181)的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)[83]。研究證實(shí)千穗谷()中存在的一組獨(dú)特的孤基因，被認(rèn)為可能是維持植物對(duì)不同脅迫條件下耐受能力的一個(gè)重要因素[84]。86個(gè)蠟燭果特異基因被證實(shí)主要參與多個(gè)逆境脅迫響應(yīng)途徑，包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、光合作用、過氧化物酶體和磷酸戊糖途徑[48]。超量表達(dá)豇豆孤基因能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性，證實(shí)是提高豇豆抗旱性的新基因[46]。低溫脅迫能顯著誘導(dǎo)麻瘋樹()/家族孤基因在葉片與根中的表達(dá)，表明基因參與麻瘋樹低溫響應(yīng)過程，同時(shí)為選育麻瘋樹耐低溫新品種提供了候選基因[85]。相反，水稻孤基因?qū)λ镜蜏啬褪苣芰哂胸?fù)調(diào)控作用[86]。通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，表明基因也與水稻種子淹水條件下的快速生長(zhǎng)相關(guān)[87]。

小麥孤基因在非生物和/或生物脅迫下具有應(yīng)激反應(yīng)性與可誘導(dǎo)性，表明其潛在的重要性[88]。研究人員選擇了1007個(gè)功能未知的擬南芥基因，其中包含一部分孤基因，評(píng)估了其對(duì)應(yīng)的純合子T-DNA插入突變體對(duì)缺氧、低溫、高溫、鹽分、氧化和滲透脅迫的反應(yīng)[12]。結(jié)果表明，其中832個(gè)突變體對(duì)多種非生物脅迫表現(xiàn)出耐受性或敏感性，這意味著功能未知的基因可能在非生物脅迫反應(yīng)信號(hào)或一般適應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]。以上這些功能未知的基因構(gòu)成了一個(gè)具體的基因庫(kù)，可以在植物應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫的防御策略中扮演著重要角色。

3.3 物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)

遺傳和生化證據(jù)表明，在控制淀粉含量中發(fā)揮重要作用[67]。研究表明，能調(diào)節(jié)擬南芥葉片的碳氮分配，其RNAi株系的淀粉含量顯著增加，蛋白含量顯著下降[67]；將基因轉(zhuǎn)化到大豆后，顯著提高了T1到T3代大豆種子中蛋白質(zhì)含量，表型和野生型幾乎無差異，這為大豆蛋白的生產(chǎn)提供了新思路。另有研究表明，隨著花粉的發(fā)育表達(dá)量逐漸增加，并且在成熟花粉粒中達(dá)到最高值[11,68,69]。擬南芥過表達(dá)株系的淀粉含量減少、蛋白含量增加，而RNAi株系在一天周期內(nèi)光照結(jié)束時(shí)表現(xiàn)出葉片淀粉含量增加、蛋白質(zhì)含量減少[67,69]?；蛟谖镔|(zhì)代謝調(diào)節(jié)中起著重要作用，在不同物種中也具有相似的功能[89]。例如，大豆中過表達(dá)顯著增加了葉片和種子中的蛋白質(zhì)含量，而種子中的油和纖維含量、葉片中淀粉含量顯著減少，且轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表型無差異[68]。水稻過表達(dá)植株的葉片和種子中淀粉含量顯著減少、蛋白質(zhì)含量顯著增加；玉米過表達(dá)植株的種仁中蛋白質(zhì)含量顯著增加、淀粉含量顯著減少[69]。深入研究發(fā)現(xiàn)，AtQQS和轉(zhuǎn)錄調(diào)控子AtNF-YC4 (nuclear factor Y, subunit C4)互作，且擬南芥過表達(dá)植株的表型與過表達(dá)的表型相似，增加了蛋白質(zhì)含量、降低了淀粉含量。同樣，過表達(dá)和均減少了煙草葉片中淀粉含量、提高了葉片和種子中的總蛋白質(zhì)含量，證明了二者在調(diào)節(jié)碳氮分配中的作用[73]。以上結(jié)果表明，一個(gè)物種的孤基因通過與保守蛋白互作，參與到另一個(gè)物種的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，因此可以作為碳氮分配的調(diào)節(jié)劑。另一項(xiàng)研究證實(shí)，過表達(dá)擬南芥十字花科特異基因(,)顯著降低了植株中淀粉含量，而敲除植株中淀粉含量顯著增加，推測(cè)可能在的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，尤其在初級(jí)代謝、適應(yīng)內(nèi)部和外部環(huán)境變化、影響衰老過程的整合中發(fā)揮作用[90]。

以大白菜(L. ssp.)基因?yàn)槟繕?biāo)序列構(gòu)建的擬南芥過表達(dá)轉(zhuǎn)基因庫(kù)中，17個(gè)株系的果糖含量相對(duì)于野生型顯著增加(如OE)、4個(gè)顯著減少；29個(gè)株系葡萄糖含量顯著增加(如OE)、1個(gè)株系顯著減少；20個(gè)株系蔗糖含量顯著增加、10個(gè)株系顯著減少(如OE)；34個(gè)株系總可溶性糖含量增加(如OE)、1個(gè)株系顯著減少、8個(gè)株系無顯著變化，這表明可廣泛影響可溶性糖代謝[44]。以O(shè)E為例進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，大白菜基因敲除植株互補(bǔ)了OE株系表型，即敲除植株中的蔗糖含量相對(duì)于野生型顯著增加，果糖、葡萄糖和總可溶性糖含量顯著減少，機(jī)理研究表明可能通過依賴于蔗糖合成酶的方式影響可溶性糖含量[44]。這些結(jié)果表明，在可溶性糖代謝中起著重要的作用，可能是改善白菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要基因。

對(duì)水稻AA基因組譜系特有基因簇的研究發(fā)現(xiàn)，該基因簇區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)座子元件顯著富集，該研究不僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)參與苯丙烷代謝的基因簇，且闡明了基因簇形成的關(guān)鍵原因，研究結(jié)果為植物抵御病原體提供了新的代謝池[80]。Fang等[82]研究表明，超量表達(dá)控制HP代謝物合成的基因簇(、或)提高了水稻對(duì)真菌病原體稻瘟菌的抗性，同時(shí)超量表達(dá)和會(huì)促進(jìn)HP的積累，為抗病分子育種提供了重要理論依據(jù)。

3.4 影響物種特異性進(jìn)化

孤基因的生物功能對(duì)于闡明物種進(jìn)化進(jìn)程和生物適應(yīng)性具有重要意義[91]。Hanada等[92]報(bào)道了植物串聯(lián)重復(fù)世系特異性擴(kuò)張?jiān)谥参镞m應(yīng)環(huán)境刺激過程中起到重要作用。此外，水稻和擬南芥中的種特異性孤基因在花粉和精細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與新基因的起源相關(guān)聯(lián)[93]。近來的研究還揭示了轉(zhuǎn)移到核基因組的線粒體DNA數(shù)量與陸生植物中孤基因數(shù)量之間的高度相關(guān)性，表明線粒體基因組可能在陸生植物的核孤基因進(jìn)化中發(fā)揮作用[94]。普通小麥中的顯性雄性不育基因被證實(shí)屬于小麥亞族特異基因，賦予小麥、大麥()和二穗短柄草的雄性不育性，其在花藥中的表達(dá)與逆轉(zhuǎn)錄酶元件插入啟動(dòng)子有關(guān)[95]。另一項(xiàng)關(guān)于小麥孤基因的研究證實(shí)，大多數(shù)孤基因主要在生殖相關(guān)組織中優(yōu)先表達(dá)，尤其是在初生雄蕊中[88]。水稻孤基因?qū)λ镜目焖偕L(zhǎng)具有重要作用，該研究為更好地在育種中利用孤基因提供了理論依據(jù)[87]。孤基因影響物種特異性進(jìn)化的實(shí)例相對(duì)較少，開展相關(guān)研究的難度相對(duì)較大，未來還需要深入探索。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

高通量測(cè)序技術(shù)促進(jìn)了全基因組測(cè)序的發(fā)展，這使得每一個(gè)新測(cè)序物種中的孤基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，該部分獨(dú)特的基因也不斷帶來驚喜。孤基因可能作為物種進(jìn)化過程中重要的持續(xù)不斷的基因源，孤基因的產(chǎn)生可能使物種形成了一種新的適應(yīng)機(jī)制。孤基因的產(chǎn)生、變成熟亦或消亡，可能是受到了進(jìn)化壓力的影響，闡明孤基因進(jìn)化進(jìn)程，可能會(huì)有助于人們理解物種進(jìn)化趨勢(shì)。到目前為止，人們對(duì)孤基因的了解主要基于比較基因組研究和表達(dá)分析。然而，植物孤基因的功能分析仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。幸運(yùn)的是，科研人員在試圖揭開孤基因功能的奧秘時(shí)，許多有代表性的研究成果不斷涌現(xiàn)。例如針對(duì)[31]、[44]和[67]等基因的功能表征，為孤基因的分子基因組學(xué)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。未來，還有許多需要深入研究的方向，例如：孤基因是如何參與到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用的？哪些因素影響孤基因的進(jìn)化？孤基因在進(jìn)化過程中是如何在一個(gè)基因組中固定下來并發(fā)揮重要作用的？

為了更好、更全面的研究孤基因的功能及其作用機(jī)制，除生物信息學(xué)分析方法外，需要借助于最新的技術(shù)方法來進(jìn)行探索。例如，通過CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)[96～98]，構(gòu)建基因敲除突變體庫(kù)，加速孤基因功能表征；通過特定條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白組學(xué)提前確定具有表達(dá)證據(jù)的孤基因，從而為其功能表征提供有力的依據(jù)；也可以通過酵母單雜交(yeast one-hybrid, Y1H)文庫(kù)篩選[99]、酵母雙雜交(yeast two-hybrid, Y2H)文庫(kù)篩選[100]、免疫沉淀–質(zhì)譜聯(lián)用(immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS)篩選[101]等技術(shù)鑒定孤基因的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析孤基因作用機(jī)制，這些都將為在育種中應(yīng)用孤基因作為重要基因源提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

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Progress on plant orphan genes

Mingliang Jiang1, Hong Lang1, Xiaonan Li2, Ye Zu2, Jing Zhao1, Shenling Peng1, Zhen Liu1, Zongxiang Zhan2, Zhongyun Piao2

Orphan genes are located in a special evolutionary branch and have no significant sequence similarity with any other identified genes. Orphan genes are prevalent in every species, comparative genomics analyses found that all sequenced species contained a portion of orphan genes, and the number of orphan genes obtained by distinct screening conditions is different. Orphan genes are often associated with various stress responses, species-specific evolution and substance metabolism regulation. However, most of the orphan genes have not been well annotated or even have no recognizable functional domains, which brings some difficulties to the functional characterization of orphan genes. Compared with conserved genes, there is less research on orphan genes, which leads to the possibility that the importance of orphan genes may be “unrewarded”. In this review, we summarize the origin and evolution of orphan genes, plant orphan gene screening and functions, and analyse the existing challenges and future research priorities and solutions, which provide theoretical basis for the study of orphan gene function and action mechanisms.

plant orphan genes; origin; evolution; screening; gene functions

2022-05-10;

2022-07-23;

2022-08-08

第五批吉林省青年科技人才托舉工程項(xiàng)目(編號(hào)：QT202123)資助[Supported by the Fifth Batch of Jilin Province Youth Science and Technology Talent Promotion Project (No. QT202123)]

姜明亮，博士，講師，研究方向：蔬菜分子生物學(xué)。E-mail: jiangmingliang@jlnku.edu.cn

郎紅，博士，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)。E-mail: langhong@jlnku.edu.cn

姜明亮和郎紅并列第一作者。

戰(zhàn)宗祥，博士，講師，研究方向：蕓薹屬蔬菜作物的資源創(chuàng)新與重要性狀的形成和調(diào)控機(jī)制。E-mail: zhanzxiang@syau.edu.cn

樸鐘云，博士，教授，研究方向：蔬菜分子生物學(xué)。E-mail: zypiao@syau.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-154

(責(zé)任編委: 孔令讓)