徐思遠(yuǎn)，壽佳，吳強(qiáng)

增強(qiáng)子eRNA對(duì)原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)調(diào)控

徐思遠(yuǎn)，壽佳，吳強(qiáng)

上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院比較生物醫(yī)學(xué)研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

遠(yuǎn)端增強(qiáng)子對(duì)關(guān)鍵靶基因的表達(dá)調(diào)控通?？梢詻Q定細(xì)胞的命運(yùn)和功能，激活的增強(qiáng)子可以雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)非編碼(long noncoding)增強(qiáng)子RNA (enhancer RNA, eRNA)調(diào)控靶基因表達(dá)，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子eRNA能夠通過(guò)形成R環(huán)(R-loop)來(lái)促進(jìn)增強(qiáng)子與靶基因的染色質(zhì)遠(yuǎn)距離互作，引起局部三維基因組TAD (topologically associated domain)的改變。為了進(jìn)一步探究eRNA在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的生物學(xué)功能，本研究選取原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇的增強(qiáng)子eRNA(eRNA associated with R-loop formation)作為研究對(duì)象，通過(guò)CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DNA片段編輯技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等遺傳學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，揭示了增強(qiáng)子eRNA對(duì)基因簇表達(dá)的促進(jìn)作用。首先，本研究通過(guò)分析不同組織中增強(qiáng)子eRNA發(fā)現(xiàn)其表達(dá)具有組織特異性；其次，通過(guò)CRISPR誘導(dǎo)增強(qiáng)子內(nèi)CTCF結(jié)合位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)或缺失會(huì)造成增強(qiáng)子eRNA轉(zhuǎn)錄水平降低至2%～10%，同時(shí)基因簇的轉(zhuǎn)錄水平也會(huì)降低至原來(lái)的13%～68%；最后，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或反轉(zhuǎn)eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后，基因簇的轉(zhuǎn)錄水平下降了約60%或40%，表明增強(qiáng)子eRNA在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以調(diào)控基因簇的表達(dá)，為后續(xù)研究原鈣粘蛋白基因簇在大腦中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的思路或方向。

增強(qiáng)子eRNA；簇狀原鈣粘蛋白；eRNA；基因表達(dá)；基因調(diào)控

多細(xì)胞生物中各種細(xì)胞類(lèi)型的分化需要在發(fā)育過(guò)程中建立特定的基因表達(dá)模式。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要由增強(qiáng)子完成，增強(qiáng)子是包含多種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)結(jié)合位點(diǎn)的DNA調(diào)控元件[1～3]。增強(qiáng)子最早發(fā)現(xiàn)于1981年，猿猴空泡病毒40 (simian virus 40, SV40)的重復(fù)序列能夠通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以不依賴(lài)自身序列方向的方式增強(qiáng)β珠蛋白基因的表達(dá)[4]。在之后的研究中，常將候選增強(qiáng)子與報(bào)告基因序列克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因活性和熒光強(qiáng)度，鑒定增強(qiáng)子元件的功能[5]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，染色質(zhì)免疫沉淀與高通量測(cè)序結(jié)合(chromatin immunoprecipitation high-throughput sequencing, ChIP–seq)的實(shí)驗(yàn)方法得到廣泛應(yīng)用，該方法通過(guò)特定的組蛋白修飾和表觀(guān)遺傳學(xué)標(biāo)記識(shí)別候選增強(qiáng)子[6]。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因編輯系統(tǒng)也可用于增強(qiáng)子的鑒定，對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行突變或刪除，有助于篩選出潛在的調(diào)控元件[7]。但是這種方法會(huì)引起內(nèi)源DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)，促發(fā)細(xì)胞的雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制，針對(duì)這種情況，研究者將失活后的Cas9蛋白(dead Cas9, dCas9)與抑制或者激活因子偶聯(lián)靶向至增強(qiáng)子處，通過(guò)檢測(cè)相鄰基因的表達(dá)水平來(lái)識(shí)別增強(qiáng)子[8,9]。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況的不同，增強(qiáng)子可分為沉默增強(qiáng)子和活性增強(qiáng)子[10,11]，活性增強(qiáng)子在激活靶基因時(shí)會(huì)募集大量轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶II (RNA polymerase II, RNAPII)和表觀(guān)遺傳修飾酶，使自身處于開(kāi)放狀態(tài)[12]。使用氯化鉀激活培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞后，在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量由刺激激活的增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子通過(guò)結(jié)合CBP招募RNAPII，在增強(qiáng)子區(qū)域雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生增強(qiáng)子RNA (enhancer RNA, eRNA)[12]。增強(qiáng)子eRNA由活性增強(qiáng)子產(chǎn)生，大類(lèi)上屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)。增強(qiáng)子eRNA通常雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，是長(zhǎng)度相對(duì)較短、豐度相對(duì)較低、易被RNA外切體(RNA exosome)降解的轉(zhuǎn)錄本[13～16]。增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄是否發(fā)揮特定的生物學(xué)功能對(duì)研究增強(qiáng)子性質(zhì)和基因調(diào)控具有重要意義[14]。早期的研究認(rèn)為增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄本是副產(chǎn)物，增強(qiáng)子僅起到募集轉(zhuǎn)錄因子的作用[17]。隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明eRNA在調(diào)控基因表達(dá)方面具有重要功能。增強(qiáng)子eRNA可能與Mediator蛋白復(fù)合物相互作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[18,19]；增強(qiáng)子eRNA可能與CTCF或黏連蛋白(cohesin)相互作用幫助建立穩(wěn)定的增強(qiáng)子–啟動(dòng)子環(huán)[20,21]；增強(qiáng)子eRNA可能招募組蛋白修飾酶來(lái)改變?cè)鰪?qiáng)子區(qū)組蛋白甲基化或乙?；絒22,23]?；蚪M上不同的活性增強(qiáng)子通常可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA，但關(guān)注eRNA自身生物學(xué)功能的研究較少。

大腦能夠通過(guò)軸突–樹(shù)突間的突觸連接形成特定的神經(jīng)元回路，復(fù)雜神經(jīng)元回路的組裝需要細(xì)胞表面特定的分子標(biāo)簽，近60個(gè)簇狀原鈣粘蛋白(clustered protocadherin, c)基因賦予了細(xì)胞表面分子標(biāo)簽的多樣性[24,25]。人類(lèi)c基因位于5號(hào)染色體上，由53個(gè)串聯(lián)排列的基因組成，形成3個(gè)緊密相連的原鈣粘蛋白(,,)基因簇[26]?；虼匕勺儏^(qū)和恒定區(qū)，由15個(gè)高度相似的基因組成，可變區(qū)外顯子包括13個(gè)隨機(jī)表達(dá)型外顯子(-)和2個(gè)C型外顯子(-)，位于可變區(qū)下游的恒定區(qū)包含3個(gè)外顯子。每個(gè)可變區(qū)外顯子通過(guò)順式剪接與下游的3個(gè)恒定區(qū)外顯子相連形成成熟的原鈣粘蛋白mRNA (圖1A)[27,28]。在基因簇下游存在2個(gè)超敏位點(diǎn)(hypersensitive site, HS)增強(qiáng)子元件，分別被命名為和[29]。增強(qiáng)子主要調(diào)控后半部基因表達(dá)(除)，增強(qiáng)子全局調(diào)控基因簇表達(dá)[30]。CTCF(CCCTC-binding factor)作為染色質(zhì)架構(gòu)蛋白在基因簇的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，每個(gè)隨機(jī)表達(dá)型外顯子區(qū)域存在2個(gè)正向CTCF結(jié)合位點(diǎn)(CTCF binding site, CBS)[31～33]。在cohesin的協(xié)助下，外顯子區(qū)域內(nèi)正向的CBS與增強(qiáng)子內(nèi)存在的2個(gè)反向的CBS元件(CBSa和CBSb)發(fā)生遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用，促進(jìn)基因表達(dá)[31,32,34]。當(dāng)增強(qiáng)子內(nèi)的CBS元件反轉(zhuǎn)后，增強(qiáng)子與啟動(dòng)子間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用減少，造成基因簇的表達(dá)水平顯著下降[34～36]。RFX5、REST/NRSF等轉(zhuǎn)錄抑制因子在增強(qiáng)子處的結(jié)合會(huì)減弱增強(qiáng)子–啟動(dòng)子之間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用[37,38]。另外，每個(gè)可變區(qū)外顯子附近會(huì)反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)非編碼lncRNA，這種轉(zhuǎn)錄活動(dòng)引起基因啟動(dòng)子區(qū)DNA去甲基化，促進(jìn)CTCF結(jié)合[39]。最近的研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端調(diào)控元件增強(qiáng)子主要反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA，并且在原位形成R環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)控基因簇的選擇性表達(dá)[40]。

本研究進(jìn)一步探究活性增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物eRNA在調(diào)控基因簇表達(dá)中發(fā)揮的生物學(xué)功能。本課題組最近的研究揭示了增強(qiáng)子元件的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反向的eRNA[40]。然而增強(qiáng)子eRNA的正向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否具有功能，以及eRNA轉(zhuǎn)錄方向的改變是否會(huì)影響基因簇的表達(dá)還不清楚。本研究在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)對(duì)增強(qiáng)子eRNA進(jìn)行研究。首先，對(duì)增強(qiáng)子eRNA進(jìn)行了組織特異性分析。其次，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的增強(qiáng)子CBS元件刪除或反轉(zhuǎn)的單克隆細(xì)胞株的eRNA和基因簇的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析；最后，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)[41～44]在HEC-1-B細(xì)胞中構(gòu)建增強(qiáng)子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)刪除和反轉(zhuǎn)的單克隆細(xì)胞株，檢測(cè)其eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果為后續(xù)研究基因簇的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和eRNA的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人類(lèi)子宮內(nèi)膜瘤細(xì)胞系HEC-1-B從中科院上海細(xì)胞庫(kù)采購(gòu)；構(gòu)建sgRNA所用質(zhì)粒pGL3-U6- Puromycin來(lái)源于上?？萍即髮W(xué)黃行許教授實(shí)驗(yàn)室，表達(dá)Cas9所用質(zhì)粒pcDNA3.1-WT來(lái)源于北京大學(xué)席建忠教授實(shí)驗(yàn)室；高保真Phanta PCR擴(kuò)增酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量工具酶采購(gòu)自瑞士Roche公司；限制性?xún)?nèi)切酶I、T4 DNA連接酶采購(gòu)自美國(guó)NEB公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒采購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，質(zhì)粒小抽試劑盒采購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用MEM培養(yǎng)基采購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清采購(gòu)自中國(guó)Excell Bio公司；10×PBS緩沖液和胰蛋白酶采購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用青霉素–鏈霉素雙抗、丙酮酸納和谷氨酰胺，轉(zhuǎn)染所用Lipofectamine 3000采購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；無(wú)水乙醇采購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；異丙醇、三氯甲烷采購(gòu)自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；RNA提取液TRIzol Reagent采購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；嘌呤霉素、氯化鈉和SDS采購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；配制LB培養(yǎng)基所需胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂采購(gòu)自英國(guó)的OXOID公司；克隆載體采購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；本研究所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

合成實(shí)驗(yàn)所需sgRNA單鏈(表1)，用ddH2O將引物濃度稀釋至20 μmol/L備用。配制如下反應(yīng)體系(總體積為20 μL)用于引物退火：2 μL 20 μmol/L sgRNA-F，2 μL 20 μmol/L sgRNA-R，2 μL 10× NEB buffer 2，14 μL ddH2O。用移液器吹打混勻后置于95℃水浴鍋中5 min，關(guān)閉電源，蓋上蓋子冷卻至室溫，反應(yīng)結(jié)束后短暫離心收集液體。

用限制性?xún)?nèi)切酶I將環(huán)形質(zhì)粒pGL3-U6- Puromycin切開(kāi)，切膠回收線(xiàn)性化載體。純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，用大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化。次日挑取數(shù)個(gè)克隆進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小抽試劑盒抽提質(zhì)粒，并送擎科生物上海公司進(jìn)行一代測(cè)序。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEC-1-B細(xì)胞系的MEM完全培養(yǎng)基配方為87% MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素–鏈霉素雙抗、1%丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺。所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃ 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

待6孔板細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)，用Lipofectamine 3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。離心管中加入Lipo3000和MEM培養(yǎng)基，另外一個(gè)管中加入Cas9質(zhì)粒，sgRNA質(zhì)粒，p3000和MEM培養(yǎng)基。將液體吹打混勻，并轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，室溫孵育10 min后滴入到6孔板中，細(xì)胞放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 單克隆細(xì)胞株篩選

轉(zhuǎn)染2天后，換用含有2 μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)基進(jìn)行4天的藥物篩選，之后用正常培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)2天。取部分細(xì)胞裂解其基因組，通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定該混合物基因型，若混合物中含有目的片段刪除的細(xì)胞，則對(duì)剩余細(xì)胞進(jìn)行單克隆化鋪板。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后，在倒置顯微鏡下對(duì)含有單個(gè)細(xì)胞團(tuán)的孔進(jìn)行標(biāo)記，再培養(yǎng)1周后，對(duì)所有單克隆細(xì)胞株進(jìn)行基因型鑒定。

用胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，通過(guò)堿裂解法裂解單克隆細(xì)胞基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(總體積為20 μL)如下：10 μL 2 × Taq Mix，0.5 μL 10 μmol/L正向引物，0.5 μL 10 μmol/L反向引物，2 μL基因組模板，7 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最終延伸5 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定單克隆基因型，將陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行送測(cè)。若測(cè)序結(jié)果為雙峰，則將PCR產(chǎn)物純化后通過(guò)TA克隆的方式鑒定單克隆細(xì)胞株的基因型。將PCR產(chǎn)物與克隆載體在室溫條件下孵育5 min后，加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞，冰上冷卻30 min后進(jìn)行熱激，加入500 μL無(wú)抗LB進(jìn)行搖菌，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 h。離心后將菌液涂在含有氨芐抗性的平板上，過(guò)夜倒置培養(yǎng)。次日挑取10個(gè)單菌落進(jìn)行搖菌，抽提質(zhì)粒后送擎科生物公司進(jìn)行一代測(cè)序。鑒定單克隆基因型所用引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR

待6孔板細(xì)胞達(dá)到90%密度時(shí)，棄盡細(xì)胞表面培養(yǎng)基。每個(gè)孔加入500 μL TRIzol消化細(xì)胞，并提取細(xì)胞總RNA。隨后使用南京諾唯贊公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。取1 μg總RNA，加入1 μL鏈特異性引物，用ddH2O補(bǔ)至12 μL，在PCR儀上65℃反應(yīng)5 min將RNA模板變性，之后立即冰上冷卻2 min；加入4×gDNA wiper Mix去除基因組DNA，42℃反應(yīng)2 min；加入10×RT Mix和HiScript II Enzyme Mix各2 μL，經(jīng)25℃ 5 min、50℃ 45 min、80℃ 2 min反應(yīng)后得到cDNA文庫(kù)。

將模板用ddH2O稀釋至50 μL，配制熒光定量PCR反應(yīng)體系。在PCR中依次加入以下溶液(總體積為10 μL)：5 μL SYBR Green，0.3 μL 5μmol/L正反向引物混合物，2 μL cDNA模板，2.7 μL ddH2O，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。以作為內(nèi)參基因，采用2–ΔΔCt的方式計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR所用引物見(jiàn)表1。

1.6 HS5-1增強(qiáng)子eRNA組織特異性分析

從ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人類(lèi)HEK293細(xì)胞[45]和小鼠腎臟組織[46]的啟動(dòng)子活性標(biāo)記H3K4me3、增強(qiáng)子活性標(biāo)記H3K27ac和染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并將其導(dǎo)入至UCSC瀏覽器中進(jìn)行分析。將人類(lèi)和小鼠基因簇的增強(qiáng)子區(qū)域進(jìn)行放大，人類(lèi)HEK293細(xì)胞的參考基因組為hg19，小鼠腎臟組織的參考基因組為mm10。FANTOM5數(shù)據(jù)庫(kù)的CAGE數(shù)據(jù)[11]代表增強(qiáng)子eRNA的潛在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，藍(lán)色表示反向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，紅色表示正向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。同時(shí)與之前發(fā)表的人類(lèi)HEC-1-B細(xì)胞和小鼠大腦皮層組織的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照[40]，以此揭示增強(qiáng)子eRNA的組織特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原鈣粘蛋白α基因簇HS5-1增強(qiáng)子eRNA表達(dá)具有組織特異性

增強(qiáng)子eRNA是由激活的增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，通常位于染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域，大量的轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子會(huì)結(jié)合在增強(qiáng)子上，其周?chē)暮诵◇w也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的修飾[16]。全基因組分析表明，哺乳動(dòng)物中的活性增強(qiáng)子雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的eRNA一般具有組織特異性[11]。本課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)HEC-1-B細(xì)胞和小鼠大腦皮層組織中的增強(qiáng)子是活性增強(qiáng)子，在eRNA轉(zhuǎn)錄的區(qū)域富集了RNAP II、H3K4me3、H3K27ac、CTCF和Rad21等信號(hào)，能夠激活基因簇的表達(dá)[40]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄特征，本研究分析了人類(lèi)HEK293細(xì)胞[45]和小鼠腎臟組織[46]的增強(qiáng)子eRNA表達(dá)譜。在HEK293細(xì)胞中，盡管增強(qiáng)子處有CTCF結(jié)合可以使增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的空間距離相互靠近，但ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示增強(qiáng)子處的染色質(zhì)組蛋白上沒(méi)有發(fā)生甲基化和乙?；揎棧茰y(cè)該細(xì)胞系中增強(qiáng)子并未發(fā)生活化，也沒(méi)有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA (圖1B)，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的eRNA的定量結(jié)果相一致[40]。和人類(lèi)HEK293細(xì)胞類(lèi)似，小鼠腎臟組織中增強(qiáng)子也并未活化(圖1C)，這與最近的一篇文章中揭示的小鼠腎臟組織的RNA-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，數(shù)據(jù)顯示整個(gè)基因簇基因幾乎不表達(dá)[39]。這些eRNA的轉(zhuǎn)錄特征分析表明增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄具有組織特異性。

2.2 HS5-1增強(qiáng)子CTCF位點(diǎn)方向改變導(dǎo)致eRNA轉(zhuǎn)錄水平降低

本課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)基因簇中的增強(qiáng)子eRNA通過(guò)在原位形成R環(huán)的方式介導(dǎo)增強(qiáng)子與基因簇啟動(dòng)子間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用，進(jìn)而激活基因簇的表達(dá)[40]。R環(huán)是指在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，新生的RNA鏈與DNA鏈進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)導(dǎo)致另一條單鏈DNA被置換，產(chǎn)生一種含有RNA-DNA雜合體的三鏈結(jié)構(gòu)，這種R環(huán)結(jié)構(gòu)在基因的表達(dá)調(diào)控和DNA修復(fù)中發(fā)揮了重要的功能[47,48]。本文利用熒光定量PCR對(duì)之前構(gòu)建的增強(qiáng)子CBSa、CBSb位點(diǎn)基因編輯的細(xì)胞克隆與野生型細(xì)胞的和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，在增強(qiáng)子CBS元件反轉(zhuǎn)的細(xì)胞株中，增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低至野生型克隆的5%，基因簇的轉(zhuǎn)錄水平下降至野生型克隆的15% (圖2，A和B)。在增強(qiáng)子CBS元件一條等位基因反轉(zhuǎn)、一條等位基因缺失的雜合子細(xì)胞株中，增強(qiáng)子eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平都顯著降低(圖2，C和D)，這表明CBS元件方向的改變會(huì)引起和基因簇的表達(dá)異常。在這兩種情況中，增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄方向發(fā)生原位反轉(zhuǎn)破壞了原本的eRNA序列，由于R環(huán)傾向于在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域形成，因此可能破壞了R環(huán)結(jié)構(gòu)的方向性，導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄水平降低。同時(shí)的轉(zhuǎn)錄方向在三維空間折疊后不再與基因簇的轉(zhuǎn)錄方向相同，由CBS元件介導(dǎo)的增強(qiáng)子–啟動(dòng)子環(huán)也被破壞，導(dǎo)致基因簇的表達(dá)下降。此外，這兩種情況相比較，第一種單克隆細(xì)胞株中的和基因簇的表達(dá)受到的影響更大。在增強(qiáng)子CBSa位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的雜合子細(xì)胞株中，增強(qiáng)子eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平分別下降90%和40% (圖2，E和F)。在該細(xì)胞株中，CBSa位點(diǎn)方向的改變并不影響的長(zhǎng)度，但是在一定程度上改變了的轉(zhuǎn)錄本序列，因此推測(cè)序列本身在調(diào)控基因簇的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。雖然CBSa位點(diǎn)的原位反轉(zhuǎn)沒(méi)有破壞的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，但這一反轉(zhuǎn)不僅改變了CBSa位點(diǎn)自身的方向，導(dǎo)致增強(qiáng)子與啟動(dòng)子間的相互作用減弱；而且導(dǎo)致增強(qiáng)子內(nèi)部的部分序列發(fā)生改變，這一改變可能破壞了增強(qiáng)子內(nèi)原本的R環(huán)結(jié)構(gòu)。這個(gè)結(jié)果表明CBSa元件方向的改變會(huì)引起的異常轉(zhuǎn)錄。在增強(qiáng)子CBSb位點(diǎn)刪除的純合子細(xì)胞株中，增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有發(fā)生明顯變化(圖2，G和H)。由于的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于兩個(gè)CBS元件之間，因此對(duì)CBSb位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯沒(méi)有破壞的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和其序列本身。這個(gè)結(jié)果表明增強(qiáng)子CBSb元件作為基因簇的邊界，它的缺失不會(huì)引起異常轉(zhuǎn)錄，但其刪除后會(huì)破環(huán)TAD的邊界，引起基因簇的表達(dá)降低(圖2，G和H)?？傊鰪?qiáng)子內(nèi)CTCF結(jié)合位點(diǎn)方向的改變或缺失會(huì)引起eRNA的異常轉(zhuǎn)錄，同時(shí)影響基因簇的表達(dá)。

圖1 原鈣粘蛋白α基因簇HS5-1 eRNA的組織特異性分析

A：人類(lèi)原鈣粘蛋白基因簇()示意圖。人類(lèi)基因簇由15個(gè)可變區(qū)外顯子和3個(gè)恒定區(qū)外顯子組成，15個(gè)可變區(qū)外顯子包括13個(gè)隨機(jī)表達(dá)型外顯子和2個(gè)C型外顯子。每個(gè)基因的可變區(qū)外顯子都攜帶自己的啟動(dòng)子，通過(guò)順式剪接與下游3個(gè)恒定區(qū)外顯子相連。B：ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)中[45]人類(lèi)HEK293細(xì)胞系中增強(qiáng)子處eRNA的特異性分析。依次為H3K4me3、H3K27ac和CTCF的ChIP-seq結(jié)果(橘色)。C：ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)[46]小鼠腎臟組織(紫色)中增強(qiáng)子處eRNA的組織特異性分析。

圖2 HS5-1增強(qiáng)子CTCF位點(diǎn)方向改變導(dǎo)致eRNA轉(zhuǎn)錄水平降低

A：增強(qiáng)子CBS反轉(zhuǎn)的單克隆細(xì)胞株基因型示意圖。B：增強(qiáng)子eRNA和基因表達(dá)的定量分析。C：增強(qiáng)子CBS編輯后的單克隆細(xì)胞株基因型示意圖。D：增強(qiáng)子eRNA和基因表達(dá)的定量結(jié)果。E：增強(qiáng)子CBSa反轉(zhuǎn)的單克隆細(xì)胞株基因型示意圖。F：增強(qiáng)子eRNA和基因表達(dá)的定量分析。G：增強(qiáng)子CBSb刪除的單克隆細(xì)胞株基因型示意圖。H：增強(qiáng)子eRNA和基因表達(dá)的定量結(jié)果。NS：沒(méi)有顯著性差異；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

2.3 HS5-1增強(qiáng)子eRNA對(duì)原鈣粘蛋白α基因簇的激活功能

在此之前，已有的研究利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除了eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)來(lái)探究其生物學(xué)功能[40]。為了進(jìn)一步研究增強(qiáng)子eRNA對(duì)基因簇的調(diào)控作用，同時(shí)排除CBS元件的影響，根據(jù)FANTOM5數(shù)據(jù)庫(kù)揭示的增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，設(shè)計(jì)靶向正反向轉(zhuǎn)錄區(qū)域的成對(duì)sgRNA，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除增強(qiáng)子eRNA分子的雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(圖3A)。根據(jù)編輯區(qū)域設(shè)計(jì)成對(duì)引物對(duì)單克隆細(xì)胞株的基因型進(jìn)行鑒定，凝膠電泳結(jié)果和一代測(cè)序結(jié)果表明，增強(qiáng)子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被成功刪除(圖3，B和C)。通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)基因簇的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，在缺失eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后，基因簇的轉(zhuǎn)錄下降了70% (圖3D)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明增強(qiáng)子eRNA的雙向轉(zhuǎn)錄過(guò)程甚至是轉(zhuǎn)錄本可以調(diào)控基因簇的表達(dá)。此外，CTCF蛋白敲低也造成增強(qiáng)子eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(圖3，E和F)。增強(qiáng)子與可變型啟動(dòng)子間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用不僅需要eRNA的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)需要CTCF/cohesin等染色質(zhì)架構(gòu)蛋白的參與[40]。CTCF蛋白的減少，導(dǎo)致增強(qiáng)子–啟動(dòng)子之間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用減弱，染色質(zhì)環(huán)的破壞導(dǎo)致eRNA轉(zhuǎn)錄水平的下降。

增強(qiáng)子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的刪除，同時(shí)造成了增強(qiáng)子CBSa位點(diǎn)的缺失，由于CBSa位點(diǎn)具有重要的調(diào)控作用，因此基因簇的表達(dá)下降可能是由于CBSa位點(diǎn)被破壞所導(dǎo)致的。為了排除CBSa位點(diǎn)的干擾以及探究eRNA轉(zhuǎn)錄方向的改變是否會(huì)影響基因簇的表達(dá)，利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)將的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)(圖4A)。通過(guò)對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行篩選，總共獲得了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的雜合子單克隆(圖4，B和C)。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的單克隆細(xì)胞株中，增強(qiáng)子eRNA自身轉(zhuǎn)錄下降了80%左右；與此同時(shí)，其調(diào)控的基因簇的轉(zhuǎn)錄水平降至原來(lái)的一半(圖4D)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)不僅改變了自身的轉(zhuǎn)錄方向，同時(shí)也破壞了其與基因簇轉(zhuǎn)錄方向的協(xié)同性。此外，轉(zhuǎn)錄方向的變化使得原本轉(zhuǎn)錄出的RNA序列隨之改變，由于共轉(zhuǎn)錄R環(huán)主要在啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處形成，序列本身的改變會(huì)動(dòng)搖、甚至是破壞R環(huán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致基因簇周?chē)娜旧|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。原本由形成的R環(huán)結(jié)構(gòu)所介導(dǎo)的增強(qiáng)子–啟動(dòng)子之間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用也被破壞，導(dǎo)致基因簇的表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明原位反轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)方向會(huì)影響基因簇的表達(dá)。

圖3 使用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除HS5-1增強(qiáng)子eRNA雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

A：敲除增強(qiáng)子eRNA轉(zhuǎn)錄起始區(qū)所用sgRNAs及單克隆基因型鑒定所用引物示意圖。B：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株基因型鑒定凝膠電泳圖。以野生型細(xì)胞作為對(duì)照，F(xiàn)1和R1的目的產(chǎn)物片段為1798 bp，刪除轉(zhuǎn)錄起始區(qū)后產(chǎn)物片段為1079 bp，F(xiàn)1和R2的目的產(chǎn)物片段為826 bp。C：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株基因型鑒定一代測(cè)序圖。紅色堿基為PAM位點(diǎn)，紅色箭頭表示Cas9切割位點(diǎn)；粉色框內(nèi)為上游接口處堿基，黃色框內(nèi)為下游接口處堿基。D：野生型克隆、增強(qiáng)子eRNA轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域刪除的單克隆細(xì)胞株中基因表達(dá)的定量分析。E：敲低CTCF后的蛋白質(zhì)免疫印記。F：CTCF敲低后的增強(qiáng)子eRNA和基因表達(dá)的定量分析。TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；WT：野生型；KD：敲低。**：<0.01；***：<0.001。

圖4 使用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)反轉(zhuǎn)HS5-1增強(qiáng)子eRNA PEARL的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

A：反轉(zhuǎn)eRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)所用sgRNAs及單克隆基因型鑒定所用引物示意圖。B：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株基因型鑒定凝膠電泳圖。以野生型細(xì)胞作為對(duì)照，F(xiàn)1和R1的目的產(chǎn)物片段為1798 bp，雜合子中一條等位基因目的產(chǎn)物片段為1504 bp，F(xiàn)1和F2的目的產(chǎn)物片段為921 bp。C：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株基因型鑒定一代測(cè)序圖。紅色堿基為PAM位點(diǎn)，紅色箭頭表示Cas9切割位點(diǎn)；藍(lán)色框內(nèi)為上游接口處堿基，綠色框內(nèi)為反轉(zhuǎn)序列，黃色框內(nèi)為下游接口處堿基。D：野生型克隆、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的單克隆細(xì)胞株eRNA和基因表達(dá)的定量分析。TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；WT：野生型；inv：反轉(zhuǎn)。**：<0.01；***：<0.001。

3 討論

鈣粘蛋白是Ca2+依賴(lài)性細(xì)胞粘附分子，鈣粘蛋白之間特異的細(xì)胞間粘附在組織的形成和維護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[49]。原鈣粘蛋白屬非經(jīng)典鈣粘蛋白，在神經(jīng)元間的自身識(shí)別和非自身回避、神經(jīng)元存活和遷移、軸突–樹(shù)突間的連接等功能中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在某些神經(jīng)以及精神疾病中，原鈣粘蛋白可以作為疾病診斷的標(biāo)志物[24,25]。原鈣粘蛋白基因簇下游的遠(yuǎn)距離順式調(diào)控元件和在調(diào)控基因簇的表達(dá)中發(fā)揮重要功能[29]。此外，原鈣粘蛋白基因的表達(dá)需要CTCF/cohesin復(fù)合物介導(dǎo)的增強(qiáng)子–啟動(dòng)子之間的遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用[31,32,34]。

增強(qiáng)子eRNA轉(zhuǎn)錄是否具有功能一直是eRNA研究領(lǐng)域的重點(diǎn)問(wèn)題[14]。最近的研究表明基因簇的增強(qiáng)子內(nèi)主要反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生eRNA來(lái)激活基因表達(dá)(圖5A)[40]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究增強(qiáng)子eRNA的功能，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的增強(qiáng)子CTCF結(jié)合位點(diǎn)編輯的細(xì)胞株進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)CTCF結(jié)合位點(diǎn)方向的改變會(huì)引起的異常轉(zhuǎn)錄。由于eRNA的轉(zhuǎn)錄豐度較低，在對(duì)其克隆時(shí)并未獲取其完整的序列，只得到了一個(gè)804 bp的分子序列[40]。增強(qiáng)子CTCF結(jié)合位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的細(xì)胞株(圖2，A～D)轉(zhuǎn)錄的eRNA分子包括了上游CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)，說(shuō)明將CBS元件反轉(zhuǎn)不僅改變了的轉(zhuǎn)錄方向，而且改變了原本的序列。在增強(qiáng)子CBSa位點(diǎn)反轉(zhuǎn)的細(xì)胞株中(圖2，E和F)，由于CBSa位點(diǎn)的序列包含在804 bp的eRNA分子內(nèi)，因此這一反轉(zhuǎn)同樣改變了原本的序列。這兩種情況都可能破壞了原本的R環(huán)結(jié)構(gòu)，造成和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，因此推測(cè)的序列具有調(diào)控基因簇基因表達(dá)的功能(圖5B)。利用CRISPR DNA片段編輯技術(shù)刪除eRNA的雙向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)表明，增強(qiáng)子的正向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同樣具有調(diào)控功能(圖3)。尤其是當(dāng)只反轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)同樣可以影響基因簇的表達(dá)，這一結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)錄的方向性可能對(duì)基因簇具有調(diào)控作用(圖4)。上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)利用CRISPR系統(tǒng)編輯eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域，同樣改變?cè)械霓D(zhuǎn)錄本序列，轉(zhuǎn)錄本序列的變化將會(huì)影響原本穩(wěn)定的R環(huán)結(jié)構(gòu)(圖5C)。

圖5 增強(qiáng)子eRNA PEARL調(diào)控原鈣粘蛋白α基因簇表達(dá)的示意圖

A：在野生型細(xì)胞中，增強(qiáng)子eRNA(紫色)在增強(qiáng)子處形成R環(huán)激活基因簇表達(dá)。B：使用CRISPR DNA片段編輯系統(tǒng)反轉(zhuǎn)增強(qiáng)子及其兩邊的CTCF位點(diǎn)，不會(huì)改變?cè)鰪?qiáng)子eRNA轉(zhuǎn)錄本的5′端序列(紫色)，但會(huì)改變eRNA轉(zhuǎn)錄本的3′端序列(綠色)，因此可能會(huì)改變?cè)镜腞環(huán)結(jié)構(gòu)，造成基因簇的表達(dá)降低。C：反轉(zhuǎn)eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)會(huì)完全改變其自身序列(橙色)，增強(qiáng)子內(nèi)的R環(huán)結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，導(dǎo)致基因簇的表達(dá)降低。TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

由于eRNA是由增強(qiáng)子DNA序列轉(zhuǎn)錄的，遺傳學(xué)方法在一定程度上破壞了增強(qiáng)子區(qū)域。因此，在確定eRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的前提下，可以通過(guò)定點(diǎn)突變的方式研究eRNA的功能。此外，一些輔助激活因子已被證實(shí)在調(diào)控eRNA轉(zhuǎn)錄，維持增強(qiáng)子活性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮作用[22,50]，關(guān)于輔助抑制因子的研究也開(kāi)始逐步開(kāi)展。例如，以炎癥性巨噬細(xì)胞為模型，研究者發(fā)現(xiàn)GPS2和SMRT輔助抑制因子與輔助激活因子CBP和Mediator拮抗調(diào)控增強(qiáng)子活性[51]。輔助抑制因子的結(jié)合可以阻止增強(qiáng)子活化、抑制eRNA的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)輔助抑制因子被敲低后，增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄被重新激活[51]。在基因簇中，增強(qiáng)子CBSb位點(diǎn)附近結(jié)合RFX5、REST/NRSF等轉(zhuǎn)錄抑制因子[37,38]。因此，這些轉(zhuǎn)錄因子可能作為eRNA轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子阻止增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄，去除這些因子后可能會(huì)增加增強(qiáng)子活性。

本研究主要討論了基因簇下游增強(qiáng)子產(chǎn)生的eRNA在基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮的激活功能，對(duì)已經(jīng)報(bào)道的增強(qiáng)子eRNA的生物學(xué)功能是一種補(bǔ)充。通過(guò)檢測(cè)增強(qiáng)子CBS位點(diǎn)編輯的細(xì)胞株中eRNA和基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，以及利用CRISPR系統(tǒng)編輯增強(qiáng)子eRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄水平下降會(huì)導(dǎo)致基因簇的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。這些結(jié)果表明，增強(qiáng)子eRNA在調(diào)控基因簇的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步理解eRNA的生物學(xué)功能提供幫助。

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Additional evidence ofenhancer eRNAfor protocadherin alpha gene regulation

Siyuan Xu, Jia Shou, Qiang Wu

The regulation of target genes by distal enhancers usually determines the fate and function of cells. Active enhancers in specific regions of chromatin may transcribe bidirectionally to produce long non-coding enhancer RNA (eRNA) to regulate gene expression. We recently found that an antisense enhancer eRNA(eRNA associated with R-loop formation) regulates gene expression of members of theclusterR-loop formation. To further explore the biological function of eRNA, we performed additional genetic and molecular experiments such as CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DNA-fragment editing, RT-PCR, and qPCR. First, we performed expression analyses of theeRNAand found that it was expressed in a tissue-specific manner. In addition, upon CRISPR DNA-fragment deletion or inversion of the CTCF sites in theenhancer region, the expressionof eRNAwas reduced to 2%–10% and the expressionofgene cluster was also reduced to 13%–68% of the original levels. Finally, deletion of the bidirectional transcription start site (TSS) ofeRNA or inversion of TSS of the eRNAresulted in approximately 60% or 40% decrease of levels ofgene expression. In summary, these data suggested a functional role of theeRNA in gene regulation of thecluster, providing a new direction for future researches on the regulatory mechanisms of clusteredgene expression in the brain.

enhancer RNA; clustered protocadherin; eRNA; gene expression; gene regulation

2022-05-15;

2022-06-30;

2022-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31630039, 91940303)和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(編號(hào)：19JC1412500, 21DZ2210200)資助[Supported by the National Nature Science Foundation of China (Nos. 31630039, 91940303) and the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality Program (Nos. 19JC1412500, 21DZ2210200)]

徐思遠(yuǎn)，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：生物學(xué)。E-mail: xus1yuan@126.com

吳強(qiáng)，博士，教授，研究方向：三維基因組學(xué)。E-mail: qiangwu@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-160

(責(zé)任編委: 單革)