童瑞年，吳旭日，陳依軍

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院化學生物學研究室，南京210009）

微生物次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣、種類豐富，是新藥研發(fā)的重要來源之一［1］。微生物的次級代謝產(chǎn)物通常由相關(guān)生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters BGCs）編碼的生物合成途徑逐步生物合成產(chǎn)生。微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇大小一般為幾十到幾百kb不等，包含編碼化合物合成前體、骨架裝配、修飾的相關(guān)基因，有時也會存在抗性基因和／或調(diào)控基因［2］。據(jù)推測，實驗室可培養(yǎng)的微生物數(shù)量不及微生物總數(shù)的1%，而且很多微生物在人類設(shè)定的培養(yǎng)條件下會出現(xiàn)基因簇沉默或低表達，嚴重阻礙了微生物來源藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，亟待革新研究策略［3］。完整生物合成基因簇的異源表達策略為從不可培養(yǎng)微生物和基因簇沉默微生物中獲取有價值的次級代謝產(chǎn)物提供了有效手段［4］，其優(yōu)點主要包括：（1）可直接關(guān)聯(lián)不同生物合成基因簇與其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物；（2）采用通用性強的異源表達宿主和遺傳操作系統(tǒng)，實現(xiàn)對任何來源的生物合成基因簇進行簡便的遺傳操作；（3）異源表達宿主多為遺傳背景清晰且穩(wěn)定的菌株，有利于異源基因簇的穩(wěn)定表達和次級代謝產(chǎn)物的累積；（4）可通過理性改造生物合成基因簇，實現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性。

作為一種大片段DNA克隆技術(shù)，TAR（transformation associated recombination）克隆技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的異源表達和次級代謝產(chǎn)物異源生物合成［5］。與常規(guī)的生物合成基因簇異源表達策略相比，基于TAR的基因簇異源表達策略的優(yōu)勢體現(xiàn)為：（1）可從復(fù)雜基因組中選擇性分離目標DNA；（2）所選擇分離的 DNA片段較大，最長可達到 300 kb；（3）操作簡便，實驗周期短；（4）能夠與CRSPR／Cas9技術(shù)偶聯(lián)，進一步提高效率的同時便于基因簇的理性改造，能夠滿足絕大多數(shù)微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇完整異源表達的需求，對微生物來源新藥的研發(fā)具有重要價值。本文從TAR克隆技術(shù)的基本原理出發(fā)，簡要介紹TAR克隆技術(shù)在微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇異源表達方面的研究進展，為微生物來源新藥研發(fā)提供新的研究策略。

1 TAR克隆技術(shù)及其基本原理

TAR克隆技術(shù)是指利用酵母的重組系統(tǒng)從復(fù)雜基因組中選擇性分離目的DNA片段的策略，也是目前唯一能夠選擇性分離長達300 kb片段的方法［6－7］。20世紀 80年代，Botstein等［8－9］首次證明了在酵母細胞內(nèi)兩個含同源序列的DNA分子可以同源重組，并將其開發(fā)用于更普遍的DNA體內(nèi)連接或拼接，后被命名為TAR克隆技術(shù)。但是，當初的TAR克隆技術(shù)對于選擇性分離大片段的效率很低，只有1% ～5%［5，10］。經(jīng)過長期和持續(xù)的策略改變和操作方法優(yōu)化，改良后的TAR克隆技術(shù)在分離長度為250 kb的目的DNA片段時陽性克隆效率被提高至32%，分離長度較小的片段時效率則更高，而傳統(tǒng)的基因組BAC文庫篩選的陽性克隆率僅為 0.003%［11－12］。相比之下，TAR克隆技術(shù)極大地提高了大片段DNA的獲取效率，降低了篩選的工作量，縮短了實驗周期。由于上述優(yōu)勢，TAR克隆技術(shù)近期被不斷嘗試應(yīng)用于合成生物學領(lǐng)域的研究，為克隆和改造生物合成基因簇以及通過異源表達獲得活性次級代謝產(chǎn)物注入了新的活力。

TAR克隆技術(shù)是基于含同源序列的DNA片段的自由末端在酵母細胞內(nèi)能夠高效同源重組的原理而建立［13］。TAR克隆載體兩端各含一個特異性靶向目的基因的序列即目的DNA片段“捕獲臂”，長度一般達到60 bp以上就能實現(xiàn)目的片段的選擇性捕獲。同時，TAR載體還包含酵母著絲粒序列（CEN）和酵母選擇性標記（His3），便于陽性載體在酵母細胞中的復(fù)制和篩選。線性化的TAR載體與含有目的DNA片段的基因組共轉(zhuǎn)入基因改造的釀酒酵母細胞Saccharomyces cerevisiae VL6-48。借助酵母的重組系統(tǒng)，TAR載體兩端的捕獲臂與目的DNA片段兩端的同源序列發(fā)生同源重組，重組后的質(zhì)粒在酵母中自我復(fù)制和游離，從而實現(xiàn)目的DNA片段的選擇性獲取。在Larionov等［14］對TAR載體改造前的初級版中，被克隆的目的DNA片段中需要含有至少一個自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence，ARS），作為在酵母細胞中的復(fù)制起點。由于真核生物基因組中每20～40 kb就出現(xiàn)一段ARS樣序列，理論上即使TAR載體不含任何ARS序列也能夠?qū)崿F(xiàn)目的DNA片段的選擇性獲取和復(fù)制。但是，原核生物基因組中缺少ARS樣序列，導致TAR克隆技術(shù)無法應(yīng)用于細菌來源次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的選擇性獲取。2003年，Larionov等［14］通過在TAR克隆載體中插入來源于酵母的ARS元件（ARSH4），使得TAR克隆技術(shù)快速高效獲取的生物合成基因簇或DNA片段具備了真核和原核微生物的通用性，拓寬了該策略的應(yīng)用范圍。

2 TAR克隆技術(shù)的應(yīng)用

2.1 基于TAR克隆技術(shù)的基因簇組裝

雖然大量的微生物在現(xiàn)有實驗室條件下無法培養(yǎng)，但是可以從環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）中選擇性克隆這些微生物的生物合成基因簇，并在模式宿主中異源表達，為從無法培養(yǎng)微生物中篩選獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性強的次級代謝產(chǎn)物提供了可能。

以前，基于cosmid／fosmid文庫的DNA克隆技術(shù)是從eDNA篩選微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的經(jīng)典手段。美國洛克菲勒大學Brady教授課題組在該方面開展了一系列研究，篩選獲得了多種結(jié)構(gòu)新穎且具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物［15－18］。然而，基因組功能分析顯示，不少微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇如PKS-NRPS雜合基因簇長達上百kb，但cosmid／fosmid文庫可插入的DNA片段大小一般限制在45 kb以內(nèi)，難以將一個大型生物合成基因簇完整克隆，需要將克隆的多個片段通過重疊延伸PCR技術(shù)拼接組裝成完整的基因簇［19－20］。隨后，再通過在模式宿主菌中異源表達所拼接的基因簇，生物合成特定的微生物次級代謝產(chǎn)物。顯而易見，基于PCR的片段裝配存在操作過程繁瑣，陽性克隆率低和實驗周期長等缺陷。針對這些問題，Kim等［21］于2010年構(gòu)建了TAR克隆載體pTARa（圖1-A），包含酵母、大腸埃希菌和鏈霉菌3部分元件。pTARa載體可以在酵母細胞中進行基因簇片段的快速拼接和裝配，也可以轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌進行目的基因簇的分析和擴增，還可以借助接合轉(zhuǎn)移將目的生物合成基因簇整合到鏈霉菌染色體而實現(xiàn)異源表達，合成目標次級代謝產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，Kim等［21］將構(gòu)建的eDNA cosmid克隆和pTARa載體共轉(zhuǎn)染至釀酒酵母，借助其高效同源重組系統(tǒng)快速組裝出完整的次級代謝生物合成基因簇，包括PKS、NRPS和FRI 3個基因簇，長度分別為39、89和90 kb。與傳統(tǒng)PCR拼接技術(shù)相比，基于TAR的基因簇組裝技術(shù)基本克服了操作繁瑣和實驗周期長的問題，提高了從eDNA中獲得完整生物合成基因簇的效率。

2.2 基于TAR克隆技術(shù)的微生物次級代謝產(chǎn)物的異源生物合成

TAR克隆技術(shù)不僅可用于從eDNA任意組裝不可培養(yǎng)微生物的基因簇，也可用于從已知基因組信息的微生物中直接特異性分離特定的生物合成基因簇，避免了構(gòu)建和篩選文庫，有助于加快次級代謝產(chǎn)物異源生物合成的研究進程。

Figure 1 Physicalmap of the TAR vectorCapture arms are inserted in pCAP01，pCAP03 and pCAP05 to construct specific capture vector by restriction sites shown in the vector maps.Capture arms are incorporated into pTARa using recombination system in S.cerevisiae yeast element（blue）；E.coli element（green）；actinobacter element（red）and broad-host-range element（gray）

2.2.1 G＋菌基因簇的異源表達 放線菌是典型的G＋菌，其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物種類繁多，是抗生素等活性化合物的重要來源。據(jù)不完全統(tǒng)計，迄今發(fā)現(xiàn)的抗生素近70%為放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。因此，TAR克隆技術(shù)在G＋菌生物合成基因簇的異源表達應(yīng)用較多［22－25］。為更加有效地異源表達 G＋菌的生物合成基因簇，美國加州大學Scripps海洋研究所Moore教授課題組在pTARa基礎(chǔ)上構(gòu)建了酵母-大腸埃希菌穿梭鏈霉菌整合型捕獲質(zhì)粒TAR載體pCAP01，并已商業(yè)化銷售（圖1-B）。pCAP01含有pUC的復(fù)制起始位點ori，便于在大腸埃希菌中進行多拷貝復(fù)制，并能夠穩(wěn)定攜帶大于50 kb的外源DNA片段。同時，pCAP01載體還含有卡那霉素／新霉素抗性基因aph（3）Ⅱ，用于在大腸埃希菌和鏈霉菌中進行陽性克隆的篩選。此外，pCAP01載體的骨架上還存在φ13整合元件，能通過接合轉(zhuǎn)移將目的基因簇從大腸埃希菌轉(zhuǎn)移至異源表達的鏈霉菌宿主并定點整合在染色體。由于φ13整合元件適用范圍廣，很多鏈霉菌可以作為基因簇異源表達合成次級代謝產(chǎn)物的宿主菌。此外，pCAP01在酵母細胞中為單拷貝，有利于維持大型質(zhì)粒的穩(wěn)定性，避免了在TAR克隆過程中產(chǎn)生隨機同源重組，有效降低了假陽性率。如圖2所示，基于TAR克隆載體pCAP01的次級代謝產(chǎn)物異源生物合成流程大體分為：（1）構(gòu)建含捕獲臂的pCAP01捕獲質(zhì)粒；（2）將pCAP01捕獲質(zhì)粒與含目的基因簇的基因組DNA同時轉(zhuǎn)至釀酒酵母原生質(zhì)體；（3）通過 PCR篩選捕獲目的基因簇的pCAP01質(zhì)粒，并測序驗證；（4）大腸埃希菌擴增制備該重組質(zhì)粒；（5）利用屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至鏈霉菌宿主，經(jīng)篩選獲得陽性克隆菌株；（6）發(fā)酵培養(yǎng)陽性菌株，實現(xiàn)目的基因簇的異源表達和次級代謝產(chǎn)物的異源生物合成。

Yamanaka等［26］利用基于pCAP01質(zhì)粒的TAR克隆技術(shù)捕獲海洋放線菌Saccharomonospora sp.CNQ-490中一個長為67 kb的NRPS沉默生物合成基因簇，并對其調(diào)控基因進行了理性改造，將改造過的基因簇異源表達于模式鏈霉菌Streptomyces coelicolor，發(fā)酵產(chǎn)生了該基因簇編碼的二氯化脂肽類抗生素taromycinA。Larson等［27］利用全合成同源臂和簡單的酶切、連接反應(yīng)替代了所有的載體裝配步驟，簡化了pCAP01捕獲載體的構(gòu)建，使其更適用于高通量篩選。利用改進后的TAR克隆技術(shù)，選擇性分離了Streptomyces sp.CNT-302中長度為54 kb的Ⅱ型PKS途徑的生物合成基因簇，并異源表達于S.coelicolor M512，成功獲得了具有抗腫瘤活性的芳香聚酮化合物宇宙霉素cosmomycin及其類似物。

Figure 2 Strategy of TAR-based heterologous expression

2.2.2 G－菌基因簇的異源表達 TAR克隆技術(shù)不僅在G＋菌基因簇的異源表達合成次級代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用較為廣泛，在發(fā)掘G－菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎次級代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用逐漸增多［28－30］。通常，G－菌基因簇的異源表達宿主應(yīng)與原宿主的遺傳背景相似或相近，目前已開發(fā)的一些G－菌宿主如Myxococcus xanthus、Pseudomonas putida和 E.coli具有生長迅速、操作簡便等優(yōu)勢。為建立基于TAR克隆的G－菌基因簇異源表達系統(tǒng)，Moore教授課題組［31］將酵母元件與G－菌廣宿主元件RK2家族相組合，構(gòu)建了可用于變型桿菌宿主的多宿主TAR克隆載體pCAP05（圖1-D）。pCAP05包含ori V復(fù)制起點和trfA基因，能在多種G－菌中低拷貝數(shù)復(fù)制。同時，它具有與pCAP03（G＋菌TAR克隆載體，圖1-C）相同的酵母細胞元件，能利用反相選擇標記以減少背景影響，提高了陽性克隆的篩選效率。該課題組利用該 G－菌 TAR克隆載體從Pseudoalteromonas luteoviolacea 2ta16基因組中捕獲了紫色桿菌素的生物合成基因簇，并在兩種變形桿菌宿主Pseudomonas putida KT2440和Agrobacterium tumefaciens LBA4404實現(xiàn)了紫色桿菌素的異源生物合成［29］。與此同時，他們發(fā)現(xiàn)異源宿主與原宿主相近與否并不是決定成功異源表達的唯一因素，特殊的宿主調(diào)控機制和生物合成元件均會影響次級代謝產(chǎn)物的異源生物合成，這對進一步開發(fā)G－菌異源表達宿主具有重要的指導意義。

3 基于TAR克隆技術(shù)基因簇異源表達策略的改進

雖然TAR克隆技術(shù)能夠從基因組中捕獲目的基因簇并異源表達和合成微生物次級代謝產(chǎn)物，但線性載體通過非同源末端連接自連導致該技術(shù)的陽性率很低，只有0.5%～2%，由此帶來的篩選工作量巨大、實驗周期仍然較長。針對這一局限，研究者從多個角度對基于TAR克隆技術(shù)的微生物次級代謝產(chǎn)物異源生物合成策略進行了改進，大致可歸納為以下兩類。

3.1 CRISPR／Cas9系統(tǒng)偶聯(lián)TAR克隆技術(shù)

在理論上，目的基因簇捕獲臂兩端各引入一個雙鏈斷裂可以提高TAR克隆的效率［32］。但是，由于待克隆的目的基因簇較大且處于復(fù)雜的基因組中，一般很難在臨近基因簇兩端選擇合適的核酸內(nèi)切酶剪切位點而不破壞目的基因簇的完整性［14］。與核酸內(nèi)切酶相比，CRISPR／Cas9系統(tǒng)不依賴于特定的酶切位點，只需識別長度為20 nt的特異性序列，幾乎可以在任意位點引入雙鏈斷裂。因此，CRISPR／Cas9系統(tǒng)與TAR克隆技術(shù)的偶聯(lián)在微生物次級代謝產(chǎn)物異源生物合成方面的優(yōu)勢顯著。Nicholas等［33］通過 CRISPR／Cas9偶聯(lián) TAR克隆技術(shù)在目的DNA片段兩端引入雙鏈斷裂使TAR克隆的陽性克隆率提高至32%，減少了篩選工作量，縮短了實驗周期。CRISPR／Cas9系統(tǒng)偶聯(lián)TAR克隆技術(shù)的操作流程如圖3所示：（1）設(shè)計并轉(zhuǎn)錄合成靶向目的基因簇兩端的sgRNA，體外裝配Cas9-sgRNA復(fù)合物；（2）利用Cas9-sgRNA復(fù)合物處理含目的基因簇的基因組，并在目的基因簇兩端切割基因組；（3）將Cas9-sgRNA處理的基因組和線性化的捕獲質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至酵母原生質(zhì)體，以通過同源重組捕獲目的基因簇；（4）PCR篩選捕獲目的基因簇的TAR質(zhì)粒。含目的基因簇的TAR質(zhì)粒則可被轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌擴增，并通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至模式宿主菌實現(xiàn)特定微生物次級代謝產(chǎn)物的異源生物合成。Meng等［34］利用 CRISPR／Cas9偶聯(lián) TAR克隆技術(shù)從Streptomyces pristinaespiralis中選擇性克隆pristinamycin I基因簇，敲除負調(diào)控基因后整合至基因改造宿主 S.pristinaespiralisΔPIIΔpapR3，實現(xiàn)了pristinamycin I的高效生物合成。

Figure 3 Selective cloning of biosynthetic gene cluster of interest by CRISPR／Cas9-meditated TAR

3.2 陽性克隆的反向篩選

在TAR克隆過程中，降低TAR克隆載體自環(huán)化所致的高背景同樣可以提高陽性克隆率。Moore教授課題組在TAR克隆載體pCAP01的基礎(chǔ)上，引入強啟動子pADH1基因和反向選擇性標記URA3基因，構(gòu)建了可減少高背景影響的新TAR克隆載體 pCAP03（圖2-C）。結(jié)果顯示，加入 URA3反向標記后，含有自環(huán)化載體的酵母克隆不能在含5-FOA的平板上生長，酵母克隆數(shù)量大幅減少，陽性克隆率達到80%，極大地縮短了篩選陽性克隆的工作量和時間。借助pCAP03載體，Moore教授課題組［35］成功地從86株海洋放線菌基因組中分離出PKS-NRPS雜交途徑的生物合成基因簇tlm及其相關(guān)的ttm基因簇，并在模式鏈霉菌S．coelicolor M1152中異源表達，合成了一系列硫代季酮酸類次級代謝產(chǎn)物，其中包括脂肪酸合成酶抑制劑硫乳霉素。

4 展 望

本文概述了TAR克隆技術(shù)的基本原理及其在微生物次級代謝產(chǎn)物異源生物合成的中的應(yīng)用，充分展現(xiàn)了該技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)微生物來源藥物的重要工具的科學意義和應(yīng)用價值。雖然基于TAR克隆技術(shù)的基因簇異源表達策略正在不斷發(fā)揮其功能和價值，但目前尚存在一些明顯的缺點，有待于進一步改進：（1）TAR克隆技術(shù)對高GC含量基因簇的捕獲能力較弱；（2）TAR克隆技術(shù)無法用于研究非成簇存在的基因所編碼的次級代謝產(chǎn)物；（3）有些基因簇編碼的酶或次級代謝產(chǎn)物對酵母有毒性，這些基因簇無法通過TAR克隆技術(shù)克隆和異源表達；（4）理論上TAR克隆技術(shù)對捕獲片段無長度限制，但目前能捕捉的基因簇最大約為300 kb。然而，隨著對微生物次級代謝研究的不斷深入和不同學科或技術(shù)間的交叉融合，基于TAR克隆技術(shù)的微生物次級代謝產(chǎn)物異源生物合成策略將會日趨完善，為微生物生物合成基因功能的研究和微生物來源新藥發(fā)現(xiàn)提供強有力的工具和手段。

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