賀冬梅，尤 琪，吳 潔

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院酶工程實驗室，南京210009）

1型糖尿病（type 1 diabetesmellitus，T1DM）是一種常見的青少年兒童自身免疫性疾病，由于機體異常導(dǎo)致胰島β細胞受到自身反應(yīng)性T細胞介導(dǎo)的免疫攻擊，使其喪失合成和分泌胰島素的功能，引發(fā)代謝失控和血糖水平升高［1］。T1DM患者表現(xiàn)為高血糖，多尿、多飲、多食，體重減輕等癥狀，相關(guān)抗體檢測陽性率高，如胰島素自身抗體（IAA）、谷氨酸脫羧酶抗體（GADA）等［2］。血糖若長期失控，會引發(fā)心腦血管、腎、眼、神經(jīng)等部位的病變［3］。截至目前為止，還沒有根治該疾病的方法，故一旦發(fā)病，患者需終生注射胰島素進行控制，給患者帶來極大的不便和痛苦。

非特異性免疫抑制劑（如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤和環(huán)孢菌素A等）可以在一定程度上抑制免疫系統(tǒng)，控制胰島炎癥，減少β細胞的免疫破壞及凋亡，從而延緩T1DM的發(fā)展。然而長時間、大劑量的治療產(chǎn)生的不良反應(yīng)過大，限制了其在臨床的應(yīng)用［4］?？乖禺愋悦庖咧委熂赐ㄟ^識別胰島特異性抗原，誘導(dǎo)機體對胰島抗原產(chǎn)生免疫耐受且不會造成全身性免疫失調(diào)?？乖禺愋灾委熆捎行а泳弰游锬Ｐ鸵葝uβ細胞的進一步損傷，保護殘存的胰島功能，但臨床治療效果并不顯著。除此之外，當這些抗原被自身抗體識別后，可能會加速T細胞對胰島β細胞的破壞［5］。

非肥胖性糖尿病小鼠（non-obese diabetic，NOD）是一種被廣泛應(yīng)用的自身免疫性糖尿病模型，在無特定病原體和無菌環(huán)境中都可自發(fā)形成糖尿病，但在無菌環(huán)境中T1DM的發(fā)病時間顯著加快［6］。多項研究表明，新生兒的外部環(huán)境如分娩方式、喂養(yǎng)成分、寵物接觸［7］以及抗生素的使用［8］都會影響T1DM，而且通過改變飲食、調(diào)整腸道菌群［9］以及增加微生物的接觸［10］都能夠預(yù)防和延緩T1DM的發(fā)病。還有研究發(fā)現(xiàn)，BBdp大鼠、NOD小鼠以及T1DM患者的腸道菌群多樣性顯著降低，且易引發(fā)炎癥的細菌數(shù)量增加［11］。除此之外，寄生蟲和共生微生物與人類的免疫系統(tǒng)共同進化，這些微生物對促進正常的免疫發(fā)育至關(guān)重要［12］。衛(wèi)生學假說也支持微生物是推動機體免疫系統(tǒng)建立的重要因素的說法，認為發(fā)達國家T1DM和過敏癥等青少年自身免疫性疾病的發(fā)病率居高不下，與幼年時期機體免疫系統(tǒng)缺少與環(huán)境微生物的接觸有關(guān)［13］。因此，利用微生物及其有效成分來誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)耐受的建立，減少免疫系統(tǒng)的敏感性，有望在早期延緩或阻斷自身免疫反應(yīng)，減少胰島β細胞的損傷。

隨著對T1DM發(fā)病機制的不斷深入研究，微生物與宿主免疫調(diào)節(jié)之間的相互關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，亦為T1DM的預(yù)防和治療帶來了新的思路和突破。已有多篇文獻報道微生物疫苗的科學性和安全性，如微生物提取物OM-85廣泛應(yīng)用于兒童呼吸道感染多年。除此之外，T1DM微生物疫苗在動物模型上取得了較好的結(jié)果，甚至有一些疫苗已經(jīng)進入臨床試驗，如卡介苗（BCG）。本文對國內(nèi)外相關(guān)1型糖尿病微生物疫苗的研究進行綜述，對不同疫苗可能的作用機制進行討論，以期為預(yù)防和治療T1MD的臨床研究提供參考。

1 微生物滅活疫苗

弗氏完全佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）主要包含滅活的結(jié)核分枝桿菌，能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的抗體。佐劑活性來自于油滴中免疫原的持續(xù)釋放，能長期刺激局部免疫反應(yīng)。研究表明，NOD小鼠在注射CFA后，發(fā)病率顯著下降，胰島β細胞的損傷和胰島炎癥明顯減輕［14］。有報道證明，CFA是通過干擾素-γ（IFN-γ）來調(diào)節(jié)CD4＋CD25＋Treg細胞和致病性T細胞之間的平衡，從而維持自身免疫平衡，阻止1型糖尿病的發(fā)生［15］。而早期發(fā)現(xiàn)，CFA免疫可減少針對胰島β細胞的特異性自身反應(yīng)性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的產(chǎn)生，同時使 FasL／Fas凋亡通路受限，減少β細胞的凋亡。除此之外，CFA還抑制CD8＋T細胞在胰島局部的聚集，從而對胰島局部β細胞起到免疫保護作用，但自然殺傷T淋巴細胞（NKT）卻有所增加［16］。因此，完全揭示CFA預(yù)防T1DM的作用機制仍需要更深入的研究。雖然CFA是一種高效的刺激劑，但會引起機體產(chǎn)生過度的免疫應(yīng)答導(dǎo)致皮膚壞死等，因而限制了CFA的臨床使用。

Q熱補體結(jié)合抗原（QFA）來源于滅活的貝氏柯克斯體，QFA疫苗可引起長期的免疫應(yīng)答來應(yīng)對Q熱病原體，并對其他傳染性病原體產(chǎn)生有效的非特異性抑制作用，包括瘧原蟲和細菌病毒。這種非特異性的作用有可能與腫瘤壞死因子（TNF）、IFN-γ以及一氧化氮（NO）暫時性升高有關(guān)，而這些因素都參與細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答［17］。研究證明，9～10周的雌性NOD幼鼠腹腔注射QFA，可有效減輕胰島損傷，保護胰島β細胞，阻止NOD小鼠糖尿病的發(fā)展。但QFA疫苗對IFN-γ缺失的NOD小鼠無效，說明QFA是通過誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，起到預(yù)防 T1DM發(fā)生的作用［18］。同時，IFN-γ是誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的重要物質(zhì)，且NO可阻止自身免疫性疾病如自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生［19］。因此，QFA疫苗的保護效應(yīng)可能是通過NO調(diào)節(jié)機制來實現(xiàn)的。

2 微生物減毒活疫苗

BCG的主要成分是結(jié)核分枝桿菌的減毒株，作為一種預(yù)防兒童肺結(jié)核的疫苗，BCG早在1921年就應(yīng)用于人類［20］。目前，BCG作為1型糖尿病疫苗已經(jīng)進入臨床2期試驗，1期臨床結(jié)果表示，長期1型糖尿病患者經(jīng)多次注射BCG疫苗，胰島素分泌功能出現(xiàn)輕微、暫時性的恢復(fù)（NCT00607230）。BCG疫苗可暫時性地升高TNF，且可以選擇性地消除攻擊胰島的T細胞，促進胰島細胞再生。其作用機制目前尚不清楚，有推測是與CFA和QFA疫苗機制一致，這些外來抗原接種后，激活了體內(nèi)的Treg，這種調(diào)節(jié)性T細胞具有抑制自身反應(yīng)性T細胞的功能，轉(zhuǎn)移至胰島內(nèi)部后，釋放抑制性細胞因子如白介素4（IL-4）和IL-10等引出對自身抗原的耐受信號，促使T細胞向Th2細胞分化，并抑制Th1細胞及其細胞因子包括IFN-γ、IL-2、TNF的產(chǎn)生從而阻止了細胞毒性T細胞對胰島β細胞的破壞和糖尿病的發(fā)生［21］。

寄生蟲感染NOD小鼠后能下調(diào)小鼠自身免疫性T細胞的產(chǎn)生，穩(wěn)定Th1／Th2細胞之間的平衡，增加抗炎因子中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和IL-10的表達，保護胰島β細胞不受Th1細胞介導(dǎo)的自身免疫性損傷，從而阻止T1DM的發(fā)生［22］。寄生蟲感染還能使胰腺內(nèi)的CD4＋T細胞水平升高，CD8＋T細胞和NK細胞的水平下降［23］。鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型在感染肥頭絳蟲后，能調(diào)節(jié)血糖，緩解模型小鼠高血糖癥狀。但研究發(fā)現(xiàn)絳蟲感染沒有上調(diào)Treg細胞的產(chǎn)生，而是增加了巨噬細胞表面細胞程序性死亡受體配體1（PDL-1）的表達［24］。除此之外，寄生蟲治療已在多種自身免疫性疾病治療中展開臨床試驗，結(jié)果表明無明顯不良反應(yīng)，這為寄生蟲疫苗在T1DM的研究中打下堅實的基礎(chǔ)［25］。

此外，病毒也可以預(yù)防糖尿病的發(fā)生。眾多研究表明，人類腸道病毒如柯薩奇病毒（CVB）感染與T1D的發(fā)生密切相關(guān)。幼年雌性NOD小鼠注射低劑量柯薩奇病毒B3減毒株（CVB3）后，形成糖尿病抵抗模型，這些模型可延緩T1DM的發(fā)生，改善胰島損傷，并降低其發(fā)病率［26］。Filippi等［27］認為，病毒感染延遲T1DM發(fā)病的可能機制是暫時性上調(diào)淋巴細胞的PDL-1表達而引起的免疫抑制，因為活化的T細胞和NK細胞等表達的細胞程序性死亡受體1（PD-1）與PDL-1結(jié)合后作為共刺激信號對T細胞免疫起到負調(diào)節(jié)作用。而病毒感染可減少T1DM的發(fā)病率則可能是通過增加Treg細胞來調(diào)節(jié)免疫平衡。但人類腸道病毒B組病毒卻可以加速胰島炎和β細胞凋亡［28］，說明病毒株的類型和劑量的選擇是病毒疫苗應(yīng)用的關(guān)鍵。

3 微生物亞單位疫苗

盡管多項數(shù)據(jù)表明，失活和減毒的微生物疫苗在動物實驗中能有效阻止1型糖尿病的發(fā)展，但其仍然存在未知的不良反應(yīng)，所以發(fā)現(xiàn)并分離微生物的有效成分將成為一個更安全的途徑。

大腸埃希菌熱不穩(wěn)定腸毒素（LT）是一種黏膜免疫原和黏膜免疫佐劑，LT由A和B亞單位兩個部分組成。A亞單位具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，B亞單位（LTB）是LT的受體結(jié)合亞單位。LTB可以通過促進Treg細胞的增殖發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，同時上調(diào)細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）的表達，而CTLA-4則可通過與共刺激分子B7協(xié)調(diào)作用，使T細胞的活化受到限制。除此之外，LTB還可以通過某種機制促進不成熟DC細胞（iDC）的大量產(chǎn)生，抑制T細胞的活化來誘導(dǎo)免疫耐受，改善自身免疫性疾病的免疫攻擊［29］。早期研究發(fā)現(xiàn)LTB可以緩解治療組NOD小鼠的胰島炎癥，增加IL-10的分泌，同時還可減少巨噬細胞、CD4＋T細胞、B細胞以及組織相容性復(fù)合體2（MHC-II）在胰腺的聚集。這些結(jié)果顯示LTB的早期干預(yù)可有效阻止NOD小鼠糖尿病的發(fā)展，但NOD小鼠年齡大于10周后，LTB免疫治療無法達到預(yù)防效果［30］。

OM-85是由革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的提取物組成，廣泛用于治療兒童反復(fù)性上呼吸道感染，具有較高的安全性［31］。Alyanakian等［32］證實，口服OM-85可以延遲NOD小鼠的發(fā)病時間，而腹腔注射OM-85則可以阻止小鼠T1DM的發(fā)生。重要的是，NOD小鼠在3～6周齡開始接受OM-85治療，效果最佳。由于口服胰島素的生物利用度較低，所以很難發(fā)揮其療效，但有實驗將大腸埃希菌提取蛋白OM-89與胰島素共同灌胃后，顯著降低了NOD小鼠的發(fā)病率，且降低胰島部位的IL-4以及 NO合成酶（iNOS）的分泌［33］，但微生物提取物OM-85和OM-89成分復(fù)雜，還需要進行更多試驗和評估。

脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細胞壁中的一種成分，是激活巨噬細胞、中性粒細胞等的重要因素。多篇文獻報道，NOD小鼠于早期尾靜脈和腹腔注射LPS可以延緩糖尿病的發(fā)生以及減少發(fā)病率［34］。Caramalho等［35］也發(fā)現(xiàn)，4周齡、6～8周齡以及12周齡的NOD小鼠在連續(xù)多次腹腔注射LPS后，顯著性的降低了小鼠T1DM的發(fā)生。即使在小鼠胰島發(fā)生單核細胞浸潤后進行給藥，同樣可以阻止糖尿病的發(fā)展。而LPS的保護機制被證明與增加Treg細胞的產(chǎn)生，減少Th1炎性細胞因子的合成，誘導(dǎo)免疫耐受有關(guān)。但最主要的是多次注射LPS疫苗能引發(fā)DC細胞的亞基低表達Toll樣受體 4（TLR4），以及下調(diào) TLR4及其下游的MyD88x信號通路，減少炎性細胞因子的釋放［36］。這些數(shù)據(jù)說明，早期進行LPS干預(yù)能有效預(yù)防糖尿病的發(fā)生。

鏈球菌制劑OK-432作為免疫刺激劑，可激活巨噬細胞和殺傷性T細胞。已有實驗證明，腹腔注射OK-432可保護胰島細胞，有效阻止NOD小鼠和BBdp大鼠自發(fā)形成T1DM［37］。低劑量的環(huán)磷酰胺具有免疫增強作用，會加速自身免疫介導(dǎo)的胰島B細胞的破壞，從而促進NOD小鼠自發(fā)性糖尿病的過程，但OK-432治療后的小鼠卻不受環(huán)磷酰胺的影響［38］。

4 微生物核酸疫苗

TLR家族成員在免疫細胞表面表達，能識別保守的微生物結(jié)構(gòu)，如LPS、病毒DNA和RNA等，并且能夠激活下游信號通路，引起機體的免疫應(yīng)答，在微生物誘導(dǎo)免疫耐受的過程中扮演重要的角色［39］。將含有CpG基序的無蛋白編碼的DNA質(zhì)粒注射到NOD小鼠體內(nèi)時，可以減輕小鼠胰島炎癥，減少T細胞的增殖，阻止針對胰島抗原的免疫反應(yīng)以及糖尿病的發(fā)展。體外實驗中，CpG寡核苷酸可以誘導(dǎo)NOD小鼠脾細胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-10［40］。但 Lee等［41］卻表示，接種含有細菌 CpG序列的DNA疫苗對小鼠的糖尿病沒有起到預(yù)防作用，所以細菌DNA疫苗在改善糖尿病過程中的試驗方案和作用機制還有待明確。

5 微生物活載體疫苗

減毒活沙門氏菌聯(lián)合前胰島素原和TGF-β的疫苗在NOD小鼠8周齡時，持續(xù)給藥3周，可以安全有效地減輕NOD小鼠的胰島炎癥，保護胰島素分泌細胞并阻止糖尿病的發(fā)展。結(jié)果顯示，聯(lián)合疫苗免疫后可以提高NOD小鼠IL-10和IL-2的水平，但對促炎因子 IL-6，IL-12和 IFN-γ等沒有影響［42］。

Duan等［43］將益生菌酸奶中發(fā)現(xiàn)的加氏乳桿菌與能產(chǎn)生胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的人類基因組合成重組菌進行口服灌胃。與對照組相比，STZ誘導(dǎo)的T1DM小鼠在口服重組菌90 d后，小腸和胰腺中的總胰島素水平提高60%，血糖水平降30%。且該重組菌能誘導(dǎo)腸道細胞變成胰島素分泌細胞，從而達到治療效果［43］。

乳酸菌作為一種降血糖的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，幾乎無不良反應(yīng)，且作用溫和、性質(zhì)穩(wěn)定、效果明顯而持久，對有效防治糖尿病具有十分重要的現(xiàn)實意義，已經(jīng)成為近年來的研究熱點。將T1DM的自身抗原GAD65與抗炎因子IL-10和anti-CD3共同導(dǎo)入乳酸菌重組成新型疫苗，這種疫苗能有效緩解新發(fā)T1DM小鼠的胰島炎癥，保護剩余胰島β細胞，并恢復(fù)其機體血糖水平。與此同時，乳酸菌重組疫苗還能通過增加Treg細胞的表達來調(diào)節(jié)免疫平衡，減少胰島的自身免疫性攻擊［44］。

6 微生物疫苗預(yù)防T1DM的可能作用機制

微生物疫苗阻止T1DM發(fā)展的具體機制尚不清楚，但很多發(fā)現(xiàn)可以解釋這種預(yù)防作用（如圖1所示）。微生物疫苗在接種后，激活了體內(nèi)的Treg細胞，釋放抑制性細胞因子如IL-4、IL-10等引出對自身抗原的耐受信號。除此之外，微生物成分還能促使宿主的T細胞向Th2細胞分化，抑制Th1細胞的分化，從而阻止了Th1細胞對胰島β細胞的破壞，最終改善了胰島炎及T1DM。由于胰島β細胞的異常凋亡和清理，導(dǎo)致大量自身抗原的暴露，最終導(dǎo)致胰島損傷。而小鼠注射CFA后，可減少針對胰島β細胞的特異性自身反應(yīng)性CTL的產(chǎn)生，使FasL／Fas凋亡通路受限，從而減少β細胞的凋亡［45－46］。DC細胞是體內(nèi)最主要的專職抗原呈遞細胞，成熟的DC細胞能將信號傳遞給效應(yīng)T細胞從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)。而LT疫苗卻能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量的不成熟DC細胞，從而使T細胞無法正常激活。LT疫苗使T細胞無應(yīng)答的機制還包括上調(diào)CTLA-4的表達［47］。微生物疫苗的抑制機制還可能與下調(diào)巨噬細胞表面的免疫受體有關(guān)，如TLR。有研究表明，T1DM患者和小鼠模型體內(nèi)都存在TLR4信號通路異常情況［48］，然而LPS多次注射后會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)的巨噬細胞低表達TLR4，導(dǎo)致TLR4及其下游通路表達的炎性因子 TNF-α和IFN-β等降低。正常情況下，PD-1通過與其配體PDL-1發(fā)揮免疫調(diào)控作用，而PDL-1基因敲除以及PD-1／PDL-1途徑被抑制時，NOD小鼠出現(xiàn)更強烈的T細胞免疫應(yīng)答［49］。而病毒感染能上調(diào)APC細胞的PDL-1表達，從而對T細胞免疫進行負調(diào)節(jié)，從而保護胰島細胞。

圖1 微生物疫苗預(yù)防T1DM的可能作用機制（表示促進表示抑制表示分泌表示損傷）

7 展 望

胰島β細胞損傷至T1DM的發(fā)生是一個不可逆的過程，因此在胰島炎癥發(fā)生早期阻止機體免疫系統(tǒng)對β細胞的損傷成為T1DM預(yù)防研究的重點。雖然多種免疫抑制劑取得了較好的臨床效果，卻無法避免隨之而來的藥物毒性和對免疫系統(tǒng)的破壞。本文介紹了幾種具有較大開發(fā)潛能的微生物疫苗種類，這些疫苗通過對機體進行早期免疫刺激，進而誘導(dǎo)自身免疫耐受，阻止效應(yīng)T細胞對胰島β細胞的攻擊，為微生物疫苗在T1DM預(yù)防的臨床應(yīng)用中提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。但目前這些微生物疫苗離獲得臨床實質(zhì)性應(yīng)用仍然存在一定距離，今后還需要進一步了解各種微生物疫苗主要的作用成分及其具體作用機制，改善微生物有效成分分離純化的方法和效率以及探究這些疫苗的臨床使用標準。同時，如何區(qū)分保護性微生物刺激也是疫苗研究中值得探討的問題。

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