劉文秀，高 菲，王 蘭，王 茜

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

苯酚作為石油加工業(yè)、殺蟲(chóng)劑工廠、化工等許多工業(yè)點(diǎn)源的主要污染物之一，可通過(guò)食物鏈在生物體內(nèi)富集，毒性大，腐蝕性強(qiáng)，難降解，是一種重要的環(huán)境危害化合物[1]。2017年苯酚市場(chǎng)報(bào)告顯示，到2025年，全球?qū)Ρ椒拥男枨髮⒗^續(xù)增加，此外苯酚泄漏事故的頻繁發(fā)生，進(jìn)一步增加了苯酚進(jìn)入環(huán)境的可能性[2]。20 世紀(jì)70年代開(kāi)始就有大量研究證實(shí)，苯酚對(duì)水生生物的代謝、生存和生長(zhǎng)有不利影響。研究顯示，苯酚明顯抑制了多刺裸腹溞的活動(dòng)，最終可導(dǎo)致其死亡[3]。即使低濃度的苯酚也會(huì)通過(guò)表皮、胃腸道和呼吸道進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體[4]，對(duì)其健康造成嚴(yán)重的損傷[5-6]。所以，苯酚被列為水生系統(tǒng)優(yōu)先控制污染物之一[7]。

多刺裸腹溞（Moina macrocopa）是浮游生物的一大類群，在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈、生產(chǎn)力和能流中占關(guān)鍵性的位置。枝角類有類似于其他甲殼動(dòng)物的表皮，不僅起保護(hù)作用，而且還與運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖活動(dòng)等生態(tài)習(xí)性相關(guān)[8]。但是表皮不會(huì)隨著身體的生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，當(dāng)長(zhǎng)到一定程度后，表皮會(huì)限制身體生長(zhǎng)，這個(gè)時(shí)候就要蛻皮，蛻掉表皮，身體就會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。表皮是生物抵御外界環(huán)境的第一道防線，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和相關(guān)的蛻皮行為容易受外界環(huán)境的改變，影響機(jī)體的生長(zhǎng)[9]。咪唑類物質(zhì)KK-42 顯著增加了日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）的表皮厚度，促進(jìn)了機(jī)體的生長(zhǎng)[8]。斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲(chóng)在RH-2485 的脅迫下，表皮明顯變薄，且蛻皮行為不正常，次數(shù)減少，從而導(dǎo)致幼蟲(chóng)死亡[10]。多刺裸腹溞幼體受外界污染物的干擾后，表皮結(jié)構(gòu)和蛻皮行為的改變會(huì)影響個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至影響整個(gè)水域生態(tài)系統(tǒng)[11]，從而反映水環(huán)境的污染情況[12]，因此，多刺裸腹溞表皮和蛻皮的研究對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖和水域生態(tài)環(huán)境有著重要意義。

本試驗(yàn)選用多刺裸腹溞為材料，研究了苯酚對(duì)其表皮厚度和蛻皮次數(shù)的影響，為進(jìn)一步研究甲殼動(dòng)物蛻皮生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

多刺裸腹溞（Moina macrocop）采自山西省太原市小店區(qū)北張村，在山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)3 代以上孤雌生殖培養(yǎng)，使其敏感度達(dá)到GB/T 13266—91[13]的要求。溫度控制在（25±1）℃，pH 值為7.2，溶氧量為8.0～8.3 mg/L，每天光照10 h 左右。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚對(duì)多刺裸腹溞表皮的影響 選取健康狀況良好的1日齡幼溞，分別接種到盛有不同質(zhì)量濃度苯酚溶液（0，0.25，0.75，1.25，1.75，2.25 mg/L）的燒杯中，置于培養(yǎng)箱染毒24，48 h，光照周期為光∶暗＝16 h∶8 h。培養(yǎng)期間不喂食。苯酚染毒處理后，將存活的多刺裸腹溞過(guò)濾、清洗，用Bouin's液固定，瓊脂預(yù)包埋，將預(yù)包埋好的溞體經(jīng)系列酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察、拍照，并記錄表皮厚度數(shù)據(jù)。

1.2.2 苯酚對(duì)多刺裸腹溞蛻皮的影響 將0，0.25，0.75，1.25，1.75，2.25 mg/L 的苯酚溶液，置于 10 mL的試管中，內(nèi)裝相同體積的試驗(yàn)用水，每個(gè)管中放1 只1日齡幼溞，每個(gè)濃度有10 個(gè)平行，3 次重復(fù)。置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)期間不喂食，分別觀察和統(tǒng)計(jì)苯酚處理裸腹溞 12，24，36，48 h 的蛻皮情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以3 次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。利用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚對(duì)多刺裸腹溞表皮的影響

在苯酚脅迫24 h 后，多刺裸腹溞的表皮厚度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)（圖1，2），尤其在苯酚質(zhì)量濃度為0.25 mg/L 時(shí)，表皮厚度達(dá)到最大值（P＜0.01）；在最高質(zhì)量濃度2.25 mg/L 時(shí)，與對(duì)照組相比，表皮厚度顯著降低（P＜0.05）；其他處理組與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

從圖3，4 可以看出，在苯酚脅迫48 h 后，隨著苯酚質(zhì)量濃度的升高，多刺裸腹溞的表皮厚度下降。在質(zhì)量濃度0.75～1.25 mg/L 時(shí)，表皮厚度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；在 1.75 ～2.25 mg/L 時(shí)，表皮厚度極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

2.2 苯酚對(duì)多刺裸腹溞蛻皮的影響

由圖5可知，苯酚脅迫24 h 時(shí)，隨著苯酚質(zhì)量濃度的增加，多刺裸腹溞的蛻皮次數(shù)下降，尤其在2.25 mg/L 的苯酚質(zhì)量濃度下，蛻皮次數(shù)與對(duì)照組有極顯著差異（P＜0.01），其他苯酚處理組與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

從圖6可以看出，苯酚脅迫48 h 后，多刺裸腹溞的蛻皮與24 h 有相似的趨勢(shì)。0.75 mg/L 苯酚處理組的蛻皮次數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；1.25～2.25 mg/L 苯酚處理組的蛻皮次數(shù)極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

甲殼動(dòng)物為了生長(zhǎng)發(fā)育，必須蛻去舊的外骨骼，形成新的更大的外骨骼[14]。在蛻皮周期中，表皮動(dòng)態(tài)的變化主要表現(xiàn)為：表皮中有機(jī)和無(wú)機(jī)成分沉積量的多少、表皮各亞皮層的厚度以及上皮細(xì)胞的高度變化[15]。在這個(gè)過(guò)程中牽涉到舊表皮的降解和新表皮的形成，主要包括糖類、脂類、膠原纖維、蛋白質(zhì)和鈣鹽的合成和降解。陳香麗[8]研究表明，日本沼蝦蛻皮后期，咪唑類物質(zhì)KK-42 促進(jìn)了外表皮對(duì)水的吸附，內(nèi)表皮中的糖類等有機(jī)物被降解后的重吸收，以及上皮細(xì)胞的重吸收作用，使得上皮細(xì)胞的厚度顯著增加，表皮增厚，NAGase 活性增強(qiáng)。赤擬谷盜（Tribolium castaneum）隨著UVA 輻射時(shí)間的增加，表皮分泌物先增加后減少，表皮先增厚后變薄，表皮結(jié)構(gòu)受損[16]。在本研究中，苯酚脅迫24，48 h 后，多刺裸腹溞表皮厚度與對(duì)照組相比顯著降低，說(shuō)明苯酚對(duì)多刺裸腹溞的表皮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但具體的機(jī)制仍不清楚。

甲殼動(dòng)物的蛻皮是個(gè)重要而復(fù)雜的生理過(guò)程，既受體內(nèi)蛻皮激素的調(diào)控，又與營(yíng)養(yǎng)水平、鹽度、溫度、光照等外界生態(tài)因子密切相關(guān)[17]。在蛻皮周期紊亂或環(huán)境惡劣導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良的情況下，甲殼動(dòng)物蛻皮后的個(gè)體會(huì)變小，甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)直至死亡[18]。環(huán)境污染物對(duì)甲殼類動(dòng)物蛻皮的不良影響在20 世紀(jì)70年代首次被描述，此后有20 多種化學(xué)物質(zhì)被報(bào)道[19]。新型非甾醇蛻皮激素類殺蟲(chóng)劑W200013使棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）產(chǎn)生早熟、致死的蛻皮[20]。水中Ca2+，Mg2+和鹽濃度波動(dòng)幅度過(guò)大會(huì)影響凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的蛻皮[21]。在大型溞（Daphnia magna）中，藥物[22-23]、農(nóng)藥[24-26]、多溴二苯醚（PBDEs）[19]、多氯聯(lián)苯（pcb）[24]、異種雌激素[27-28]和五氯酚[29]均對(duì)蛻皮有抑制作用，這與本研究的結(jié)果一致。這些化學(xué)物質(zhì)改變枝角類動(dòng)物蛻皮的機(jī)制在很大程度上仍不清楚，但可能反映了蛻皮過(guò)程中內(nèi)分泌控制的紊亂[19]。

綜上所述，用苯酚處理多刺裸腹溞的幼溞，能顯著抑制表皮的厚度和蛻皮次數(shù)，推測(cè)多刺裸腹溞的蛻皮可能與表皮的厚度有一定的相關(guān)性，變薄的表皮可能提前抑制了蛻皮活動(dòng)，尚待進(jìn)一步研究。