郝 杰 ，楊 茜，吳紅紅，張凱曄，賈小云，高志強(qiáng)，賀立恒

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植最廣泛的糧食作物，可以適應(yīng)各種環(huán)境條件[1-2]，它為世界上大多數(shù)人口提供了蛋白質(zhì)、能量以及礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。提高小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)是小麥生產(chǎn)的主要目標(biāo)。施氮是提高小麥產(chǎn)量與蛋白質(zhì)含量最有效的方法，也是最直接且快速提高小麥經(jīng)濟(jì)效益的措施[3]。因此，氮肥的有效利用在農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境方面起著至關(guān)重要的作用[4-5]。

人們常用增加氮肥的施用量來增加小麥產(chǎn)量。預(yù)計(jì)到2050年，世界人口將會(huì)增加到90 億，如果按現(xiàn)在的栽培措施，當(dāng)?shù)实氖┯昧繛樵瓉淼? 倍以上時(shí)，才能滿足世界人口對(duì)糧食增產(chǎn)的需求[6-8]。然而小麥產(chǎn)量的增加與氮肥施用量并沒有呈現(xiàn)出線性關(guān)系，在過去40 a 里，當(dāng)?shù)适褂昧繛樵瓉淼? 倍以上時(shí)，而糧食產(chǎn)量?jī)H為原來的3 倍[9-10]。氮肥增施的報(bào)酬遞減規(guī)律揭示出氮肥使用量的大幅度增加對(duì)全球可持續(xù)的糧食產(chǎn)量的提高作用逐漸降低，且過量施氮造成的氮肥流失正加劇全球生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的氮污染，這已經(jīng)成為威脅環(huán)境安全的重要因素之一，并導(dǎo)致生物多樣性的減少與氣候的變化[11]。前人利用15N 同位素示蹤法進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)，結(jié)果表明，我國(guó)旱地大田中氮素?fù)p失達(dá)20%以上[12]。

在前人的研究中，關(guān)于AMF（叢枝菌根菌）在提高其他植物氮素利用率方面已有研究報(bào)道。在大田條件下，小麥根系與AMF 也能夠自然形成共生體系。祝英[13]通過盆栽大田試驗(yàn)對(duì)小麥接種光壁無梗囊霉（Acaulospora laevis）、根內(nèi)球囊霉（Glomus intraradices）和單孢球囊霉（Glomus monosporum）3 種AMF 真菌，均能顯著提高六倍體春小麥籽粒產(chǎn)量，改善產(chǎn)量構(gòu)成因素，增加繁殖分配，改善R-V（繁殖與營(yíng)養(yǎng)分配）指數(shù)，并顯著提高收獲指數(shù)。馬放等[14]研究表明，在大田條件下，人工添加AMF 菌劑可顯著提高AMF 對(duì)小麥的侵染率，同時(shí)，小麥株高與地上部生物量分別提高14.08%，24.05%。AMF 對(duì)宿主植物氮吸收的影響不但與菌根真菌自身的種類、根際伴生菌的種類和數(shù)量有關(guān)，也與外界氮源有關(guān)。朱晨[15]研究表明，不同施肥制度對(duì)土壤中菌根真菌多樣性存在影響，然而不同作物不同土壤中驅(qū)動(dòng)菌根真菌群落變化的主要因子卻有差異。但是隨著氮素投入增加，AMF 的多樣性均下降。李晉榮等[16]研究不同施氮水平下AMF 真菌群落對(duì)三葉草生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，菌根真菌的侵染率隨施氮水平的增高而降低，在高氮水平下，AMF 對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)的貢獻(xiàn)率幾乎為零，反而會(huì)抑制三葉草的生長(zhǎng)。

早期關(guān)于AMF 在宿主植物吸收養(yǎng)分方面的研究較多，但并沒有針對(duì)黃土高原特殊立地條件的研究報(bào)道，再加上研究方法的局限性，很大程度上限制了人們對(duì)黃土高原旱地土壤中AMF 群落結(jié)構(gòu)的清晰認(rèn)識(shí)，阻礙了AMF 共生體在旱地小麥生產(chǎn)中的挖掘應(yīng)用潛力。不同施氮水平以及耕作措施對(duì)黃土高原AMF 菌群結(jié)構(gòu)的影響作用尚未見報(bào)道。

本研究根據(jù)黃土高原這一特殊立地條件并結(jié)合主要糧食作物小麥，采用高通量測(cè)序技術(shù)，探索不同施氮條件下AMF 群落結(jié)構(gòu)變化，為建立黃土高原旱地小麥基于菌根群落結(jié)構(gòu)優(yōu)化下的氮素高效利用的可持續(xù)高產(chǎn)高效栽培技術(shù)體系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)區(qū)位于山西晉南旱作麥區(qū)試驗(yàn)基地，屬典型暖溫帶大陸氣候，四季分明，年平均氣溫12.6 ℃，年降雨量 500 mm 左右，7，8，9月降雨量較大，無霜期185 d，主要種植作物為小麥。試驗(yàn)地為夏閑地，黏壤土至粉砂質(zhì)黏壤土，土壤基礎(chǔ)肥力為：有機(jī)質(zhì)8.65 g/kg，全氮 0.74 g/kg，堿解氮 32.93 mg/kg，速效磷2.08 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共設(shè)3 個(gè)施氮水平，分別為：N1.0 kg/hm2；N2.90 kg/hm2；N3.180 kg/hm2。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3 次，共設(shè)置9 個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積100 m2，所有處理均基施磷肥（P2O）590 kg/hm2、鉀肥（K2O）90 kg/hm2，所有肥料均播前一次施入土壤。分別在越冬期（11月21日）、拔節(jié)期（3月21日）、開花期（5月6日）、成熟期（6月4日）4 個(gè)時(shí)期采集各施氮水平下0～100 cm 土層根系土樣，分3 個(gè)土層：L1.0～20 cm；L2.20～60 cm；L3.60～100 cm。土樣分別標(biāo)記、裝袋，將采集到的樣品迅速置于4 ℃冰箱保存。

1.3 AMF多樣性測(cè)定

各土層根際土壤及根系A(chǔ)MF 的多樣性測(cè)定與分析，委托華大基因公司采用目前微生物多樣性分析最為先進(jìn)的技術(shù)——宏基因組測(cè)序方法完成。

1.4 土壤DNA提取

使用Power Soil DNA 分離試劑盒（MO BIO Laboratories）從樣品中提取總DNA。DNA 質(zhì)量和數(shù)量通過波長(zhǎng)260 nm/280 nm 和260 nm/230 nm 的比率進(jìn)行評(píng)估。

1.5 文庫(kù)建庫(kù)及高通量測(cè)序

提取小麥根系土壤樣品總DNA 后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物并采用18s 定制引物，前引物序列AAGCTCGTAGTTGAATTTCG，后引物序列為CCCA ACTATCCCTATTAATCAT[17-19]，在末端加上測(cè)序接頭后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增步驟為：根據(jù)樣品的實(shí)際擴(kuò)增情況將樣品統(tǒng)一稀釋到20 ng/μL，不足的直接使用原液。擴(kuò)增體系（25 μL）：5×反應(yīng)緩沖液 5 μL，5×GC 緩沖液 5 μL，dNTP 原料（2.5 mmol/L）2 μL，前引物（10 μmol/L）1 μL，后引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL。 擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性 98 ℃ 2 min，變性 98 ℃15 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，25～30 個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃5 min，10 ℃保存。擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)，建好的文庫(kù)先進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

根據(jù)雙端測(cè)序序列（PE reads） 之間的重疊（Overlap）關(guān)系，將Hiseq 測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接（Merge）成一條序列 Tags，同時(shí)對(duì)序列（Reads）的質(zhì)量和Merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理各階段樣品序列數(shù)目，評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量。主要通過統(tǒng)計(jì)各階段的序列數(shù)、序列長(zhǎng)度、GC 含量、Q20和Q30 質(zhì)量值、有效值（Effective）等參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。在0.97 的相似度水平下，得到了每個(gè)樣品的OTU 個(gè)數(shù)，然后根據(jù)樣品中共有及特有的OTU數(shù)目繪制Venn 圖，直觀地表現(xiàn)出樣品間的相似度。根據(jù)軟件平臺(tái)進(jìn)行物種注釋及分類學(xué)分析。使用Mothur（version v.1.30）軟件，對(duì)樣品 Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，以及對(duì)樣品采用距離算法得到樣品間的距離矩陣，通過R 語言工具進(jìn)行Beta 多樣性分析來衡量樣品在時(shí)間、空間尺度上的物種組成變化，主要包括非度量多維標(biāo)定法（NMDS）分析、非加權(quán)組平均法（UPGMA）分析、組間物種差異熱圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋性曲線分析

稀釋性曲線（Rarefaction Curve）是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列所代表的物種數(shù)目，并以序列數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線，用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。

由圖1可知，AMF 真菌樣品的稀釋曲線趨于平坦，不會(huì)隨測(cè)序量增加而增長(zhǎng)，已涵蓋絕大多數(shù)的AMF 物種信息。

2.2 不同施氮處理下物種OTU多樣性比較分析

從圖2可以看出，N1，N2，N3處理下共有 OTU個(gè)數(shù)為 125 個(gè)，沒有特有的 OTU，表明在 N1，N2，N3這3 種施氮水平下小麥根際土壤中AMF 群落組成相似度較高。

N1處理下，L1土層含有 123 個(gè) OTU，L2土層含有 122 個(gè) OUT，L1與 L2土層共有的 OTU 為 121 個(gè)，L1與 L3土層共有的 OUT 為 122 個(gè)，L2與 L3土層共有的 OUT 為 122 個(gè)，說明 L1與 L2土壤中 AMF 群落組成相似度低于L1與L3，L2與L3之間的相似度。

N2處理下，L1與 L2土層共有的 OTU 為 119 個(gè)，L1與 L3土層共有的 OTU 為 119 個(gè)，L2與 L3土層共有的 OTU 為 121 個(gè)，說明 L2與 L3土壤中 AMF 群落組成相似度較高。

N3處理下，L1與 L2土層共有的 OTU 為 120 個(gè)，L1與 L3土層共有的 OUT 為 123 個(gè)，L2與 L3土層共有的 OUT 為 119 個(gè)，說明 L1與 L3土壤中 AMF 群落組成相似度較高，L1與 L2次之，L2與 L3最低。

2.3 不同施氮處理下AMF多樣性分布

物種組成分布柱狀圖可反映小麥不同生育時(shí)期根際A MF 不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)。圖3～7 分別展示綱水平、目水平、科水平、屬水平、種水平的群落結(jié)構(gòu)和分類比較結(jié)果。從圖3～7 可以看出，黃土高原旱地小麥在不同生育期不同土層的根際土壤中AMF 物種包括球囊菌門（Glomeromycota）3 綱、4 目、5 科、5 屬、29 種，其中，類球囊屬（Paraglomus）、球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）為優(yōu)勢(shì)屬，sp._VTX00308 與 _sp._VTX00193 為優(yōu)勢(shì)種。

從圖3可以看出，施氮對(duì)土壤中AMF 群落結(jié)構(gòu)影響較大，其中發(fā)生主要變化的是球囊菌綱（Glomeromycetes）與類球囊菌綱（Paraglomeromycetes），二者約占總菌群的95%以上。N1處理下，L2土層類球囊菌綱（Paraglomeromycetes）較高，相對(duì)豐度占總菌群的70%左右；N2處理下，球囊菌綱（Glomeromycetes）較低，相對(duì)豐度占總菌群的30%左右；N3 處理下，隨著土層深度增加，球囊菌綱（Glomeromycetes）呈逐漸降低，而類球囊菌綱（Paraglomeromycetes）呈逐漸增加。

從圖4可以看出，AMF 在目分類水平下，發(fā)生主要變化的為類球囊菌目（Paraglomerales）與球囊霉目（Glomerales），相對(duì)豐度占到總菌群的95%以上，其變化趨勢(shì)與其各自對(duì)應(yīng)的綱水平變化相似。

從圖5可以看出，N1處理下，L3土層相比于其他2 個(gè)土層球囊霉科（Glomeraceae）較高，占總菌群的15%左右，而類球囊霉科（Paraglomeraceae）在L2土層中分布較多，相對(duì)豐度占總菌群的70%左右；N2處理下，L2土層相比于其他2 個(gè)土層球囊霉科（Glomeraceae）較高，相對(duì)豐度占總菌群的25%左右，而類球囊霉科（Paraglomeraceae）在L3土層中分布較多，相對(duì)豐度占總菌群的70%左右；N3處理下，隨著土層深度增加，類球囊霉科（Paraglomeraceae）逐漸降低，而類球囊菌綱（Paraglomeromycetes）逐漸增加，相對(duì)豐度占總菌群的45%左右。

由圖6可知，AMF 在屬分類水平下，不同處理下發(fā)生主要變化的是類球囊屬（Paraglomus）、球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus），其變化趨勢(shì)與科水平上的變化趨勢(shì)相似。

由圖7可知，在種水平上，AMF 群落結(jié)構(gòu)受不同施氮量的影響，其變化比較明顯，含量較為豐富的優(yōu)勢(shì)菌種為sp._VTX00308 與_sp._VTX00193，二者總量占到總菌群的65%以上。

2.4 不同施氮處理Alpha多樣性指數(shù)分析

使用 Mothur（version v.1.30）軟件，對(duì)不同施氮量各土層樣品進(jìn)行聚類后的樣品復(fù)雜性分析。衡量9 個(gè)樣品的物種豐度（richness）及物種多樣性（diveristy）有4個(gè)指標(biāo)：Shannon，Simpson，Ace，Chao1。Chao1 和Ace 指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，Shannon 和Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性。

由表1可知，N2處理下，相比于對(duì)照（N1）與高氮（N3）處理，各土層的 Shannon 指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，根際土壤AMF 多樣性最高，這表明適宜的施氮量會(huì)提高土壤中AMF 多樣性。

表1 不同施氮量各土層Alpha 多樣性指數(shù)分析

N1處理下，L3土層的 Shannon 指數(shù)最大，Simpson 指數(shù)最小，這表明在L3土層根際土壤AMF 多樣性較高，且L3土層的Chao1 和Ace 指數(shù)最大，其豐度也較高。

N2處理下，在L2土層的Shannon 指數(shù)最大，Simpson 指數(shù)最小，這表明在L2土層根際AMF 多樣性較高；Chao1 和Ace 指數(shù)在L3土層均最大，根際土壤AMF 豐度較高。

N3處理下，Shannon 指數(shù)隨著土層的加深逐漸增大，Simpson 指數(shù)隨著土層的加深而逐漸減小，這表明隨著土層的加深，小麥根際AMF 多樣性呈逐漸增加的趨勢(shì)；Chao1 和Ace 指數(shù)在L1土層最大，在L2土層最低，這表明L1土層根際土壤AMF 豐度較高，L2土層根際土壤AMF 豐度較低。

2.5 不同施氮處理Beta多樣性分析

圖8是對(duì)樣品聚類分析后的樣品熱圖，樣品熱圖是基于距離算法得到樣品間的距離矩陣，通過R語言工具繪制樣品熱圖，可根據(jù)顏色梯度的變化直觀看出兩兩樣品間的差異性。從圖8可以看出，N2L1與 N2L2，N2L3與 N1L2，N3L1與 N1L1這3組樣品中AMF 菌群的相似度較高，N3L2與各樣品的AMF 菌群的差異性較大。

UPGMA 聚類樹與柱狀圖結(jié)合繪圖是將聚類樹與豐度柱狀圖結(jié)合起來展示的一種分析手段。圖中左側(cè)為樣品聚類樹（同UPGMA），用以判斷各樣品間物種組成的相似性；圖右側(cè)為各樣品屬水平的豐度柱狀圖，用以判斷各樣品間物種豐度的相似性。

由圖9可知，N2L1 與 N3L2，N3L3與 N1L3，N3L1與N1L1這3 種處理組合下，樣品的相似度較高，3 種處理下，樣品中優(yōu)勢(shì)菌群為類球囊屬（Paraglomus）、球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus），N2L2與其他各樣品差異較大，N2L2樣品中球囊霉屬（Glomus）相對(duì)豐度最高。

3 結(jié)論與討論

AMF 作為一種共生真菌對(duì)小麥根系土壤中氮的固定、分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)等都產(chǎn)生了重要影響，施氮處理影響了小麥根際土壤AMF 菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了小麥植株氮素代謝。前人研究表明，農(nóng)田中肥料的使用會(huì)影響AMF 群落結(jié)構(gòu)，特別是氮肥的大量投入，改變了AMF 的種群組成[20-21]。土壤肥力包括速效磷、有機(jī)質(zhì)含量等，對(duì)AMF 孢子的數(shù)量有很大影響。土壤pH 值變化會(huì)直接影響AMF 豐度及其多樣性[22]?？梢?，通過一定的栽培技術(shù)措施間接地調(diào)節(jié)土壤肥力、水分和pH 值，能優(yōu)化AMF 菌群結(jié)構(gòu)[23]。本試驗(yàn)研究表明，施氮處理會(huì)顯著影響根際AMF 菌群結(jié)構(gòu)，且在適量氮肥施用（中氮，N2）處理下，小麥根際土壤AMF 多樣性要高于對(duì)照（N1）與高氮（N3）處理，與前人在其他作物上的研究結(jié)果一致。張貴云等[24]研究表明，不同施氮水平對(duì)小麥AMF 群落結(jié)構(gòu)的形成以及分布具有顯著的影響，但隨氮素投入增多，AMF 多樣性下降。劉洋等[25]研究表明，適量的氮肥與磷、鉀肥的配合施用，相比于不施肥處理顯著增加了土壤中AMF 多樣性，施入一定量的氮肥可顯著增加菌根真菌系統(tǒng)的多樣性。

黃土高原旱地小麥根際土壤AMF 物種組成豐富，不同施氮處理下，小麥根際土壤AMF 菌群結(jié)構(gòu)組成不同。N2L1與 N3L2，N3L3與 N1L3，N3L1與 N1L1等3 種處理組合下，樣品相似度較高，N2L2與其他樣品差異較大，N2L2樣品中球囊霉屬（Glomus）相對(duì)豐度最高。劉佳[26]研究表明，不同施肥處理樣地中根圍土壤孢子數(shù)量在不同土壤深度也有差異。0～30 cm土層孢子數(shù)量明顯多于30 cm 以下土層。郭輝娟等[27]研究表明，檸條根際AMF 菌絲定殖率及孢子密度在0～10 cm 土層達(dá)到最大值。本試驗(yàn)研究表明，對(duì)照（N1）與中氮（N2）處理下，小麥根際 AMF 豐度在L3土層達(dá)到最大值，N3處理下，隨著土層的加深，小麥根際AMF 多樣性呈逐漸增加的趨勢(shì)，AMF豐度在L1土層達(dá)到最高，而其多樣性沒有表現(xiàn)出一致性規(guī)律，這可能與土壤中其他理化性狀有關(guān)。

特別提出的是，土壤根際AMF 菌群結(jié)構(gòu)以及其他微生物不僅受施氮等栽培技術(shù)措施的影響，還受自然條件等多方面因素制約，導(dǎo)致根際AMF 多樣性研究呈復(fù)雜化趨勢(shì)。試驗(yàn)在開始設(shè)計(jì)時(shí)考慮不同耕作制度對(duì)黃土高原旱地根際土壤中AMF 影響較大，為便于分析，選擇其中的一種氮肥處理因子對(duì)樣品進(jìn)行分析，忽略了另外一些自然因素對(duì)AMF菌群結(jié)構(gòu)的影響，給試驗(yàn)帶來一定的誤差。為了準(zhǔn)確闡明其他栽培方式對(duì)根際土壤AMF 的分布特征的影響，還需要通過定點(diǎn)試驗(yàn)，結(jié)合其他栽培方式及土壤的理化性狀進(jìn)一步探索與研究，為建立基于菌群結(jié)構(gòu)及其功能優(yōu)化基礎(chǔ)上的旱地綠色高效栽培技術(shù)提供理論支撐。