任 娟孫 興阮 佳譚 鐳詹 雁徐超群?

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 610075；2.四川省中醫(yī)藥科學院，四川 成都 610041）

馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir 為鼠李科植物，在 《中藥大辭典》 和一些地方習用志上多有記載，其性味苦、平、無毒，具有清熱解毒、止痛活血之功效，可治療跌打損傷、癰腫潰膿等癥，化學成分主要是三萜、總黃酮、環(huán)肽等［1］，具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗?jié)?、抗腫瘤等作用［2-4］。課題組前期對馬甲子總三萜進行純化分離，得到2 個單體化合物，分別為2α，27-二反式對羥基肉桂酰氧基-白樺脂酸和白樺脂酸，其中前者為新化合物，命名馬甲子素［5］；后者具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗 HIV 等多種活性，有很好的發(fā)展前景［6］，由于前者是以后者為母核的五環(huán)三萜類化合物，故推測它可能具有抗腫瘤活性，并發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性更強［7］。為了將馬甲子總三萜制成安全、有效、質量可控的藥物，本實驗測定該成分中馬甲子素、白樺脂酸的油水分配系數(shù)，為相關制劑開發(fā)奠定基礎。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；THZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學儀器有限公司）；BSA224S 分析天平（德國賽多利斯公司）；3K15 低溫高速離心機（美國Sigma 公司）；SB5200D 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

馬甲子素對照品（自制，含有量≥98%，批號20150801）；白樺脂酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號 111802-201402）；馬甲子總三萜（自制，批號 20171008）。馬甲子（多年生）于2017年7月采自四川省雙流縣牧馬山，經四川省中醫(yī)藥科學院舒光明研究員鑒定為鼠李科馬甲子屬植物馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir。乙腈為色譜純（美國Sigma 公司）；十二烷基硫酸鈉（德國 Clariant 公司，批號 DEA4004255）；正辛醇、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為分析純。

2 方法

2.1 馬甲子素、白樺脂酸含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相 0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，98% A；5～55 min，98%～0A）；體積流量 1.0 mL／min；柱溫 30 ℃；檢測波長 320 nm；ELSD 漂移管溫度 45 ℃；進樣量 10 μL；馬甲子素、白樺脂酸分別用 DAD、ELSD 檢測器檢測，色譜圖見圖1。由圖可知，該色譜條件下各成分分離度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取馬甲子素、白樺脂酸對照品適量，置于50 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解定容，制得質量濃度分別為0.502 0、0.935 0 mg／mL的貯備液，再分別將其稀釋成0.050 2、0.025 1、0.012 6、0.006 3、0.003 1、0.001 6 mg／mL，以及0.935 0、0.467 5、0.233 8、0.116 9、0.058 4、0.029 2 mg／mL，即得。

2.1.3 線性關系考察 將馬甲子素對照品溶液在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y=2.684 6×103X＋1.097 7（r=0.999 8），線性范圍 1.6～50.2 μg／mL。將白樺脂酸對照品溶液在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，以質量濃度的對數(shù)值為縱坐標（lgY），峰面積的對數(shù)值為橫坐標（lgA）進行回歸，得方程為 lgM=1.320 7lgA＋2.420 7（r=0.999 5），線性范圍29.2～935.0 μg／mL。

2.1.4 精密度試驗取 0.006 3、0.42 mg／mL 馬甲子素、白樺脂酸對照品溶液各 10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得兩者峰面積 RSD 分別為1.80%、2.42%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，在“2.1.1”色譜條件下于 0、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL 測定，測得馬甲子素、白樺脂酸峰面積RSD 分別為 1.24%、1.08%，表明溶液在 24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的馬甲子總三萜0.005 8 g（相當于馬甲子素0.040 6 mg、白樺脂酸3.350 2 mg）6 份，精密加入對照品溶液（馬甲子素 0.020 7 mg／mL、白樺脂酸 1.68 mg／mL）各2 mL，按 “2.1.3”項下方法制備溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，馬甲子素、白樺脂酸平均加樣回收率分別為101.32%、98.47%，RSD 分別為2.85%、3.01%。

2.2 溶解度測定 精密稱取馬甲子總三萜0.1 g，共 11 份，置于11 個10 mL 具塞試管中，精密加入蒸餾水、40%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正辛醇、0.5% 吐溫-80、0.5%十二烷基硫酸鈉各5 mL，置于恒溫振蕩器中，（37±0.5）℃下 120 r／min 振搖 24 h 以充分溶解，其間始終保持具塞試管中有固體藥物。然后，將藥物轉移至離心管中，10 000 r／min 離心10 min，取上清液過濾，在 “2.1.1”項色譜條件下測定溶解度，結果見表1。由表可知，白樺脂酸、馬甲子素在蒸餾水中的溶解度較低，以至于無法測定；隨著乙醇體積分數(shù)增加，兩者溶解度逐漸增大；加入表面活性劑（吐溫-80、十二烷基硫酸鈉）后，也可改善其溶解度。

表1 馬甲子素、白樺脂酸溶解度測定結果Tab.1 Results of solubility determination of paliurusene and betulinic acid

2.3 油水分配系數(shù)測定

2.3.1 正辛醇飽和的磷酸鹽溶液（水相）、水飽和的正辛醇溶液（油相）制備 根據2015年版《中國藥典》 附錄中的配制方法，分別制備pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、人工胃液、人工腸液、0.1 mol／L氫氧化鈉溶液，再取適量磷酸鹽緩沖液，稀釋后的 0.1 mol／L 磷酸調節(jié) pH 至 2.5、3、4、5、6，0.1 mol／L 氫氧化鈉溶液再調節(jié)其至 7、8。然后，取100 mL 不同pH 的磷酸鹽溶液、人工胃液、人工腸液、蒸餾水，置于500 mL 錐形瓶中，加入100 mL 正辛醇，室溫下振搖 24 h，靜置過夜，分取上層（油相）和下層（水相）。

2.3.2 油水分配系數(shù)-時間曲線繪制 采用經典搖瓶法。精密稱取馬甲子總三萜適量于量瓶中，“2.3.1”項下油相溶解稀釋，移取 10 mL 稀釋后油相和1 mL 水相于具塞試管中，恒溫搖床上振搖（室溫，120 次／min），于 2、4、6、8、10、12、24 h取樣，10 000 r／min 離心 10 min，過濾，取續(xù)濾液適量，在 “2.1.1”項色譜條件下測定馬甲子素、白樺脂酸含有量C1，計算油水分配系數(shù)P，公式為P=10×C1／（C0-C1）（C0為藥物在油相中的初始濃度，C1為平衡后藥物在油相中的濃度），繪制油水分配系數(shù)-時間曲線，結果見表2～3、圖2～3。由此可知，pH 為 2.5、6、7 時，白樺脂酸油水分配平衡時間為 8 h；pH 為 2.5、4、5、8 時，蒸餾水、人工胃液、人工腸液中白樺脂酸油水分配平衡時間為 10 h；pH 為 5、6 時，蒸餾水、人工胃液中馬甲子素油水分配平衡時間為8 h；pH 為2.4、3、4、7、8 時，人工腸液中馬甲子素油水分配平衡時間為10 h，表明振搖時間應大于10 h 以保證藥物在充分分配平衡。

圖2 白樺脂酸油水分配系數(shù)-時間曲線Fig.2 Oil-water partition coefficient-time curves for betulinic acid

2.4 不同pH 下油水分配系數(shù)測定［8-10］精密稱取馬甲子總三萜適量，置于量瓶中，用 “2.3.1”項下不同pH 油相溶解稀釋，移取10 mL 稀釋后的各油相和1 mL 各水相于具塞試管中，置于恒溫搖床上振搖 10 h（室溫，120 次／min），10 000 r／min 離心 10 min，過濾，取續(xù)濾液適量，在 “2.1.1”項色譜條件下測定馬甲子素、白樺脂酸含有量，計算兩者油水分配系數(shù)，結果見圖4、表4。

表2 時間對白樺脂酸油水分配系數(shù)的影響（n=3）Tab.2 Effect of time on oil-water partition coefficient of betulinic acid（n=3）

表3 時間對馬甲子素油水分配系數(shù)的影響（n=3）Tab.3 Effect of time on oil-water partition coefficient of paliurusene（n=3）

圖3 馬甲子素油水分配系數(shù)-時間曲線Fig.3 Oil-water partition coefficient-time curves for paliurusene

3 討論

大部分藥物的溶解度參數(shù)（δ）范圍為8～12，而正辛醇為10.24，恰好處在中值附近，并與細胞膜溶解度參數(shù)（10.3）非常接近，這使得藥物在該溶劑中可形成近似理想的溶液。另外，正辛醇相較于其他惰性溶劑具有更好的極性和溶解性，藥物在分配過程中更容易進入其中，從而更加便于測定，故選擇該溶劑作為油相。課題組前期測定了馬甲子總三萜在水、磷酸鹽緩沖液中的飽和溶解度，發(fā)現(xiàn)馬甲子素、白樺脂酸溶解度較低，HPLC 法無法測定其含有量，再將油相、水相等體積混合，發(fā)現(xiàn)由于兩者水溶性均較差，導致測定結果誤差大，最終確定油相、水相比例為10 ∶1，此時穩(wěn)定性大大提高。

圖4 pH 值對白樺脂酸、馬甲子素油水分配系數(shù)的影響Fig.4 Effects of pH values on oil-water partition coefficients of betulinic acid and paliurusene

表4 pH 值對白樺脂酸、馬甲子素油水分配系數(shù)的影響（n=3）Tab.4 Effects of pH values on oil-water partition coefficients of betulinic acid and paliurusene（n=3）

藥物在體內的溶解、吸收、分布、轉運與其水溶性、脂溶性，即油水分配系數(shù)（P）有關［11］，藥物通過細胞膜時需要特定疏水性、親水性，而lgP可作為預先判斷藥物在腸道中吸收情況的重要依據。其中，lgP＜0 時藥物水溶性太強，腸道中不容易被吸收；lgP＞5 時，藥物脂溶性太強，導致很難從細胞膜內側釋放；0＜lgP＜5 時，可從胃腸道給藥吸收，而且在 1～3 時藥物吸收較為理想［12-14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，馬甲子總三萜中白樺脂酸、馬甲子素的 lgP分別為 2.91～3.15、1.96～2.13，在 0～5 范圍內，表明兩者均可用于胃腸道藥物吸收，而且后者胃腸道吸收能力可能更強。

根據前期預實驗及相關文獻可知，馬甲子總三萜中主要化學成分的溶解度較小，但本實驗發(fā)現(xiàn)其中的主要化合物具有良好的胃腸道吸收能力，是屬于低溶解度具有一定滲透性的藥物。因此，將馬甲子總三萜制成口服藥物時，應注意提高藥物在體內的溶出，可考慮制成固體分散體［15］、包合物［16］、微乳［17］等。