王若柳，范驍輝，袁 瑋，張金華，王書芳?

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.大理藥業(yè)股份有限公司，云南 大理 671000）

參麥注射液是國家基本藥物目錄收載的常用復(fù)方中藥注射液，由紅參、麥冬2 味藥材制成，具有養(yǎng)陰生津、益氣固脫、生脈等功效，具有抗心率失常［1］、抗炎［2］、抗腫瘤［3］等作用，臨床上用于治療冠心?。?］、心力衰竭［5］、休克［6］等。人參皂苷是參麥注射液中主要活性成分，如人參皂苷Rg1具有延緩衰老［7］、抗腦缺血再灌注損傷作用［8］；人參皂苷 Re 具有抗缺血性心律失常、抗氧化、鎮(zhèn)靜、抗利尿作用［9］；人參皂苷 Rf 具有抗疲勞作用；人參皂苷Rb1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均具有保護(hù)作用［10］；人參皂苷Rc 具有抗血小板聚集作用［11］；人參皂苷 Ro 具有抗胃癌作用［12］；人參皂苷Rb2、Rb3對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［13］；人參皂苷 Rd 具有抗癌［12］、神經(jīng)保護(hù)作用［14］。

然而，在國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅對參麥注射液中總皂苷及紅參中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1含有量測定提出了要求［15］，難以全面控制其質(zhì)量；相關(guān)文獻(xiàn)大多也只對其中少數(shù)人參皂苷含有量進(jìn)行了測定［16-20］；曹樹萍等［21］建立HPLC 法測定其中9種人參皂苷的含有量，但未涉及到人參皂苷 Ro、Rb3。因此，本實驗建立 HPLC法同時測定參麥注射液中9種人參皂苷（人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd）的含有量，為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配置四元梯度泵、在線脫氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器、ChemStation 工作站控制系統(tǒng)；AE240 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試藥 參麥注射液由大理藥業(yè)股份有限公司提供，人參皂苷 Rg1（批號 151103）、Re（批號151129 ）、Rf（批號 150922 ）、Rb1（批號1609320）、Rb2（批號 151026 ）、Rb3（批號151127）、Rd（批號161007）、Rc（批號151102）、Ro（批號150929）對照品均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。磷酸為色譜純（美國 Tedia 公司）；乙腈、甲醇為色譜純（德國 Merck 公司）；去離子水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)過濾得到。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd對照品適量，置于量瓶中，50% 甲醇制成每 1 mL 分別含 Rg10.095 4 mg、Re 0.102 6 mg、Rf 0.036 0 mg、Rb10.182 4 mg、Rc 0.082 5 mg、Ro 0.098 0 mg、Rb20.109 8 mg、Rb30.030 2 mg、Rd 0.090 8 mg 的貯備液，精密量取適量，50%甲醇稀釋，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密移取注射液1 mL 于2 mL量瓶中，甲醇定容至 2 mL，混勻，即得。

2.2 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.05%磷酸）（B），梯度洗脫（0 min，18%A；35 min，20%A；40 min，21% A；42 min，26% A；70 min，26%A；85 min，30%A；100 min，34%A；101 min，100% A；110 min，100% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫 26 ℃；檢測波長 203 nm；進(jìn)樣量 20 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 精密吸取對照品、供試品溶液各20 μL，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，可知待測成分與雜質(zhì)峰之間可達(dá)到基線分離。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 取 “2.1.1”項下對照品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積（Y）對溶液質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 將對照品溶液在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定 6 次，測得人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 峰 面 積RSD 分別為 1.6%、0.7%、1.8%、0.8%、0.7%、0.5%、0.9%、1.0%、0.8%，表明儀器精密度良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重復(fù)性試驗 同一操作人員在同一時間內(nèi)按 “2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 含有量 RSD 分 別 為 1.5%、2.3%、2.5%、1.0%、1.4% 、2.2% 、1.4% 、3.6% 、1.8% 。然后，同一操作人員在不同時間內(nèi)按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得 9種人參皂苷含有量 RSD 分別為 2.5%、3.8% 、3.4% 、2.6% 、2.7% 、4.4% 、2.5% 、3.7%、3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置 0、4、8、12、16、20、24 h 后在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得人參 皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 峰面積 RSD 分別為2.1% 、2.1% 、0.7% 、2.8% 、3.7% 、2.9% 、3.2% 、2.4% 、3.3% ，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取含有量已知的注射液適量，按照9種人參皂苷含有量約75%、100%、125%的水平精密加入對照品溶液，每個水平平行3 份，按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié) 果，人 參 皂 苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 平 均 加 樣 回 收 率 分 別 為99.1% 、97.6% 、96.7% 、98.6% 、102.2% 、100.3%、98.8%、102.3%、97.4%，RSD 分別為3.1% 、4.3% 、4.3% 、3.3% 、2.3% 、2.9% 、3.6% 、4.4% 、3.7% 。

2.4 樣品含有量測定 按 “2.1.2”項下方法平行制備3 份供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 討論

3.1 流動相選擇 本實驗比較了乙腈-0.05% 甲酸、乙腈-水、乙腈-水（含 0.05% 磷酸）［22］，發(fā)現(xiàn)加入甲酸后基線漂移嚴(yán)重，其原因可能為甲酸在203 nm 波長處存在末端吸收；乙腈-水加入0.05%磷酸后人參皂苷 Rg1、Re 分離效果較好，故選擇乙腈-水（含0.05%磷酸）作為流動相。

3.2 柱溫選擇 本實驗比較了26、28、30 ℃時的色譜圖，發(fā)現(xiàn)26 ℃時人參皂苷Rc 與雜質(zhì)峰分離較好，故選擇其作為柱溫。

3.3 洗脫梯度選擇 本實驗在文獻(xiàn)［22］的基礎(chǔ)上，對洗脫梯度進(jìn)行了優(yōu)化。人參皂苷 Rg1、Re極性相近，分離困難，故采用18% 乙腈作為起始比例，再緩慢上升至20%，能較好地分離兩者；人參皂苷Rc、Ro 之間存在雜質(zhì)峰，故增加一段等度洗脫（42～70 min，26%乙腈），發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰與2種人參皂苷的分離度理想。

4 結(jié)論

本實驗首次建立HPLC 法同時測定參麥注射液中人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd 的含有量，發(fā)現(xiàn)各成分分離良好，而且方法簡便準(zhǔn)確，對該制劑質(zhì)量控制有著積極意義。