王 鶴 彭 瑞 段文元 王紅艷, 姚曉英

先天性心臟病(CHD)在新生兒中發(fā)病率約0.9%[1, 2]。Wnt信號通路是調(diào)控心臟發(fā)育的重要信號通路之一，主要包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路、非經(jīng)典的平面細胞極性(PCP)信號通路和Wnt/Ca2+信號通路。Dishevelled(DVL)蛋白在這3條Wnt信號通路中均發(fā)揮重要作用，是Wnt信號通路的一個中樞調(diào)節(jié)蛋白[3, 4]。Wnt信號通路的失調(diào)會導致早期心臟發(fā)育異?；駽HD[5-8]。

DACT1基因編碼的DACT1蛋白是Wnt信號通路的負調(diào)控因子。DACT1與DVL蛋白相互結(jié)合并在細胞內(nèi)共定位，且與Axin、GSK-3、CKI、β-catenin組成復(fù)合體[4]。DACT1主要通過拮抗DVL2的功能發(fā)揮作用。DACT1蛋白可促進VHL與DVL2互作，加速DVL2泛素化，從而介導因蛋白聚集引發(fā)的自噬，降解DVL2[9]。過表達非洲爪蟾XDpr(DACT1同源基因)會抑制Dvl介導的經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路，同時降低β-catenin應(yīng)答基因及JNK活性；反之，抑制內(nèi)源性XDpr基因表達，β-catenin和JNK信號通路都被激活[4]。在非洲爪蟾卵細胞中敲低XDpr后，亦有類似Wnt信號通路過度激活的表型，表現(xiàn)為脊索和頭部結(jié)構(gòu)缺失[4]；敲除小鼠Dact1基因，PCP信號通路失調(diào)，純合突變小鼠幾乎在出生后1 d內(nèi)全部死亡，泌尿生殖系統(tǒng)和消化道發(fā)育異常，部分新生小鼠還存在脊柱裂[10, 11]。人DACT1基因突變或表達失調(diào)可導致神經(jīng)管畸形(NTD)、結(jié)腸癌或肝細胞癌[12-14]。但DACT1基因在心臟發(fā)育或CHD中的作用還未見報道。本研究擬篩選與CHD相關(guān)的DACT1基因突變，并對突變的生物學功能進行初步研究。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究方案和外周靜脈血的收集均經(jīng)復(fù)旦大學生命科學學院倫理委員會批準[倫研批第(216)號]。受試者或其父母/監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 病例組來源 2008年8月至2011年1月收集的來自中國山東地區(qū)漢族人群的散發(fā)CHD的連續(xù)就診患兒，均通過超聲心動圖或手術(shù)明確診斷。排除：①綜合征型；②有CHD家族遺傳病史。

1.3 對照組來源 與病例組同時期同醫(yī)院的體檢健康兒童(山東地區(qū)的漢族人群)，經(jīng)過聽診和影像學檢查排除了患有CHD的兒童，同時排除有CHD家族史的兒童。

1.4DACT1基因測序和生物信息學分析 提取外周靜脈血基因組DNA(德國Qiagen公司血液基因組DNA提取試劑盒)。靶向DACT1基因編碼區(qū)進行測序，由江蘇基譜生物科技發(fā)展有限公司完成(美國illumina公司Hiseq 2000測序儀)。以hg19/GRCh37(NM_016651)為參考序列，使用SNP nexus工具對單核苷酸變異(SNV)進行注釋[15]。將獲得的所有突變與數(shù)據(jù)庫dbSNP(version137)和千人基因組進行比對，排除已有研究報道的“已知(known)”位點，得到無報道的“新發(fā)現(xiàn)(novel)”位點，或未見病例研究的稀有突變位點，并將病例組與對照組SNV進行比對，得到病例特異性的新發(fā)現(xiàn)或稀有DACT1錯義突變位點，進一步進行Sanger法驗證，引物見表1。用SIFT和PolyPhen-2軟件分析錯義突變位點的有害性，并用GEPR和在線分析軟件Clustal Omega進行保守性分析[16, 17]。

1.5 突變相關(guān)的生物學功能分析

1.5.1 質(zhì)粒構(gòu)建 提取HEK293T細胞(中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)的總RNA [天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒]，反轉(zhuǎn)錄[天根生化科技(北京)有限公司FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒]后PCR擴增得到人DACT1基因的cDNA。通過酶切、連接反應(yīng)，將人DACT1編碼區(qū)序列連接到pcDNA3.1(-)B-myc/his載體(美國Invitrogen公司)上，獲得野生型DACT1的表達質(zhì)粒。在該表達質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，設(shè)計引物，利用KOD-plus酶(日本Toyobo公司)進行單點突變，從而得到與DACT1錯義突變位點一致的點突變質(zhì)粒。利用同樣的方法，將人DVL2基因編碼區(qū)克隆至載體pCMV6-HA (美國Origene公司)。所有質(zhì)粒都經(jīng)過測序驗證。PCR反應(yīng)的引物利用在線引物設(shè)計軟件Primer3(http://primer3.ut.ee)設(shè)計，引物序列見表1。

表1 引物序列

注 測序引物1和2：突變位點驗證的測序引物；DACT1和DVL2：構(gòu)建DACT1和DVL2表達質(zhì)粒的引物；C1486T、C1598A、G1659C和T1891A為DACT1定點突變引物

1.5.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 將HEK293T細胞均勻鋪于6孔板，待細胞密度達70%左右時用Lipofectamine 2000[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]轉(zhuǎn)染。為檢測DACT1突變型的蛋白表達水平，將野生型和突變型DACT1表達質(zhì)粒分別與pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒(美國Origene公司)共轉(zhuǎn)，GFP作為內(nèi)參。為檢測DACT1突變型蛋白的功能，將野生型和突變型DACT1表達質(zhì)粒分別與DVL2表達質(zhì)粒和pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染24 h后，收取細胞，裂解后提取蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，用ECL顯影液(上海天能科技有限公司)及化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)進行顯影和圖像紀錄。實驗中所用抗體包括His標簽抗體(美國Proteintech公司，1∶3 000稀釋)、HA標簽抗體(美國Proteintech公司，1∶3 000稀釋)、GFP抗體(美國Origene公司，1∶10 000稀釋)、羊抗鼠二抗[艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司，1∶10 000稀釋]。

1.5.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?經(jīng)典Wnt信號通路被活化時β-catenin入核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合形成復(fù)合物，促進下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒Topflash(上海吉滿生物科技公司)的熒光素酶報告基因的啟動子區(qū)包含多個TCF/LEF結(jié)合位點，因此Topflash質(zhì)粒的熒光素酶的強弱直接反應(yīng)了經(jīng)典Wnt信號活性。本研究將野生型和突變型DACT1表達質(zhì)粒分別與報告基因質(zhì)粒Topflash共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，檢測DACT1對經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控作用。

PCP信號通路被活化時，可以通過JNK激活下游靶蛋白c-Jun。檢測PCP信號通路活性時常用的報告基因體系[PathDetect in Vivo Signal Transduction Pathway trans-Reporting Systems (美國Agilent Technologies公司)]包含pFA2-cJun和pFR-luc 2個質(zhì)粒。表達質(zhì)粒pFA2-cJun表達的c-Jun被PCP 信號激活時啟動報告質(zhì)粒pFR-luc的熒光素酶報告基因的表達。本研究將野生型和突變型DACT1表達質(zhì)粒分別與pFA2-cJun、pFR-luc共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，觀察DACT1突變對PCP 信號通路的影響。

具體操作：將HEK293T細胞均勻地鋪在24孔板中，待細胞密度達70%左右時用 Lipofectamine 2000 [賽默飛世爾科技(中國)有限公司]轉(zhuǎn)染，編碼海蜃(renilla)熒光素酶的內(nèi)參報告質(zhì)粒pRL-TK(美國Promega公司)被共轉(zhuǎn)染用于校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24 h后，收取細胞，裂解、離心后，檢測上清液中的螢火蟲(firely)和renilla熒光素酶活性(美國Promega公司的雙熒光素酶報告實驗系統(tǒng))。

1.6 統(tǒng)計學方法 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果利用ImageJ軟件進行灰度分析，灰度分析結(jié)果以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果都采用雙尾非配對t檢驗分析顯著性，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 病例組404例，年齡(2.9±2.7)歲；對照組213名，年齡(7.1±3.7)歲；病例組和對照組的男女比例分別為1.2∶1和1∶1。病例組包括圓錐動脈干畸形138例(33.5%)、隔膜缺損138例(33.5%)、右室流出道梗阻44例(10.7 %)、房室間隔缺損21例(5.1%)、動脈導管未閉17例(4.1%)、左室流出道梗阻17例(4.1%)、肺靜脈回流異常12例(2.9%)，復(fù)合型心臟異常10例(2.4%)、心臟異位3例(0.7%)、其他4例(1.0%)。

2.2DACT1基因測序結(jié)果分析 通過對兩組進行DACT1基因的編碼區(qū)、5’UTR和3’UTR區(qū)域的靶向深度測序分析,在3例CHD中篩選到4個DACT1基因編碼區(qū)的新發(fā)現(xiàn)或稀有的錯義突變，為c.1486C>T (p.S441L)、 c.1598C>A (p.S478R)、c.1659G>C (p.E499Q)和c.1891T>A (p.M576K)，分別簡稱為DACT1S441L、DACT1S478R、DACT1E499Q和DACT1M576K。其中DACT1S441L和DACT1S478R來自于同一患兒，分別位于2條不同染色體。DACT1S441L和DACT1E499Q2個錯義突變在ExAC數(shù)據(jù)庫中沒有報道，為本研究發(fā)現(xiàn)的CHD病例特有的新突變；DACT1S478R和DACT1M576K在ExAC數(shù)據(jù)庫有報道，其最小等位基因頻率(MAF)分別是8.4×10-6和8.9×10-6，為稀有錯義突變 (表2)。對攜帶這4個突變的CHD病例的DNA樣品進行了Sanger測序驗證，均為雜合突變(圖1A)。

2.3DACT1錯義突變氨基酸位點的生物信息學分析 圖1B顯示，用GERP和Clusstal Omega分析軟件對4個突變的氨基酸位點進行保守性分析，DACT1S478R和DACT1E499Q在人、黑猩猩、牛、大鼠、小鼠和羊6個物種中保守性很高，位點DACT1S441L和DACT1M576K無很強保守性。表2顯示，用SIFT和PolyPhen-2對突變位點的有害性進行評估，DACT1S441L被SIFT評價為有害突變(0.01)；DACT1E499Q被PolyPhen-2評價為可能有害(0.978)，DACT1S478R和DACT1M576K被SIFT和PolyPhen-2預(yù)測為無有害性。

2.4DACT1突變對DACT1蛋白表達和功能的影響 通過對DACT1WT進行單點突變，分別獲得與4個體內(nèi)突變位點一致的點突變質(zhì)粒DACT1S441L、DACT1S478R、DACT1E499Q和DACT1M576K。

2.4.1 突變對DACT1蛋白表達水平的影響 在HEK293T細胞中分別表達野生型和突變型DACT1基因并共轉(zhuǎn)pCMV6-AC-GFP作為內(nèi)參，圖2A蛋白質(zhì)免疫印跡實驗顯示，4種突變型對DACT1蛋白的表達水平均無明顯影響。

表2 DACT1突變位點信息和生物信息學分析結(jié)果

圖1DACT1基因CHD病例中特有的4個錯義突變位點的保守性分析

注 A: c.1486 C>T(p.S441L)，c.1659G>C(p.E499Q)，c.1598C>A(p.S478R)和c.1891T>A(p.M576K)突變的Sanger測序結(jié)果圖，黑色箭頭位置為發(fā)生突變的位置。 B: 6種脊椎動物中DACT1蛋白部分氨基酸順序排列，黑框顯示突變氨基酸的位置

2.4.2DACT1突變對DVL2蛋白表達的影響 在HEK293T細胞中，將野生型和突變DACT1分別與DVL2共表達，同時共轉(zhuǎn)GFP作為內(nèi)參，用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測外源DVL2蛋白水平，并利用灰度分析進行計算。圖2B顯示，與空載的對照組相比，野生型DACT1可以顯著下調(diào)共表達的DVL2蛋白水平(P<0.05)。與野生型DACT1相比較，DACT1E499Q對DVL2蛋白的下調(diào)作用顯著減弱(P<0.05)，其他3個突變型的DACT1蛋白與野生型相比對DVL2蛋白的作用差異無統(tǒng)計學意義。

2.5DACT1突變對經(jīng)典Wnt信號通路及PCP信號通路的影響 圖2C顯示，與對照比較，野生型DACT1顯著下調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路(P<0.001)和PCP信號通路(P<0.001)的活性；與野生型DACT1相比，DACT1E499Q顯著降低了對經(jīng)典Wnt信號通路(P<0.01)和PCP信號通路(P<0.01)的抑制作用，其他3種突變型DACT1與野生型DACT1相比對2種信號通路的作用差異無統(tǒng)計學意義。

圖2DACT1點突變對DACT1、DVL2蛋白表達以及對經(jīng)典Wnt信號通路和PCP信號通路的影響

注 實驗采用HEK293T細胞。A: DACT1蛋白表達；B：DVL2蛋白表達；C：對經(jīng)典Wnt信號通路的影響；D：對PCP信號通路的影響。1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001，ns：差異無統(tǒng)計學意義

3 討論

Wnt信號通路在胚胎發(fā)育中起重要作用。既往已有多項研究探討了Wnt信號通路在哺乳動物心臟形成和心肌細胞分化中的作用，Wnt信號通路的精確調(diào)控對于哺乳動物的心臟發(fā)育過程有重要意義[18]。DVL2在Wnt信號通路的調(diào)節(jié)中處于中樞位置，在β-catenin依賴的經(jīng)典Wnt信號通路和β-catenin不依賴的非經(jīng)典Wnt信號通路中都發(fā)揮重要作用[3]。Dvl2敲除的小鼠實驗結(jié)果顯示Dvl2為心臟錐體動脈發(fā)育中的關(guān)鍵介質(zhì)[6]。DACT1可通過與DVL2互作，加速其降解，以此調(diào)節(jié)Wnt信號通路。雖然DACT1對Wnt信號通路的調(diào)節(jié)作用已有研究，但對DACT1在CHD發(fā)生的過程中是否有貢獻作用，尚無相關(guān)報道。

本研究中通過對404例散發(fā)CHD病例和213名健康對照的DACT1基因進行靶向測序，篩選出2個病例特有的新雜合錯義突變DACT1S441L和DACT1E499Q，以及2個病例特有的稀有雜合錯義突變DACT1S478R和DACT1M576K。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥慕Y(jié)果表明，突變型DACT1E499Q對DVL2蛋白的下調(diào)水平減弱，并顯示出對經(jīng)典Wnt信號通路和PCP信號通路的抑制作用的部分喪失。表明DACT1E499Q突變可能是散發(fā)CHD的風險因素。

散發(fā)的CHD是性狀復(fù)雜的疾病，通常是許多基因或者1個基因的多個等位基因和環(huán)境共同作用導致最終的疾病表型。通常有兩種假說用于解釋CHD，分別為常見疾病/常見突變和常見疾病/稀有突變。前者認為，少數(shù)基因座位上的常見等位基因相互作用會導致疾病發(fā)生，而后者認為許多基因座上的罕見等位基因可以單獨引起疾病[19]。已有研究表明，這兩種假設(shè)都是正確的，主要取決于研究的疾病和基因的不同[20]。 因此，本研究在病例中鑒定出的錯義突變位點DACT1S441L、DACT1S478R和DACT1M576K，未觀察到對DVL2蛋白水平和功能的影響，原因之一可能為，在病例體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境中，這些突變位點與其他基因的突變協(xié)同作用而共同促進CHD的發(fā)生。為了驗證本文結(jié)論，可擴大測序樣本量，并用合適的動物模型行體內(nèi)實驗。

致謝

本研究工作得到了復(fù)旦大學現(xiàn)代人類學教育部重點實驗室和復(fù)旦大學遺傳工程國家重點實驗室的技術(shù)支持。