宋玉雙 隋娜

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟南 250014）

溫度對植物的生長發(fā)育和地理分布起著重要的作用，是極其重要的環(huán)境因子之一。低溫會降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［1］。

在低溫條件下，植物體內(nèi)的親水蛋白、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量增加，膜組成改變［2］。低溫脅迫首先傷害的是植物細(xì)胞的細(xì)胞膜，低溫脅迫下，細(xì)胞膜由液晶相逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相，膜流動性降低、離子滲漏和膜蛋白失活等現(xiàn)象［3］。生物膜是細(xì)胞與外界環(huán)境聯(lián)系的界面，生物膜的基本組成成分之一是多不飽和脂肪酸（PUFAs），PUFAs通常是指含有兩個或兩個以上雙鍵的長鏈脂肪酸，具有重要的生理功能［4］。植物體內(nèi)膜脂的PUFAs約占總脂肪酸的60%，為適應(yīng)低溫脅迫，植物往往會通過改變自身不飽和脂肪酸含量進(jìn)而來調(diào)整膜的流動性，從而維持適宜于蛋白發(fā)揮活性的環(huán)境［5］。而脂肪酸不飽和水平的變化主要通過調(diào)節(jié)脂肪酸去飽和酶的活性來實現(xiàn)［6-7］。

在植物中，脂肪酸去飽和酶可分為ω-3型（FAD2、FAD6）和 ω-6型（FAD3、FAD7、FAD8）兩大類，催化在脂肪酸鏈的特定位置形成雙鍵，從而產(chǎn)生特定的不飽和脂肪酸。ω-3脂肪酸去飽和酶是不飽和脂肪酸合成途徑中催化16∶2（7，10）或18∶2（9，12）轉(zhuǎn)化為 16∶3（7，1 0，13）或 18∶3（6，9，12）的關(guān)鍵酶，使脂肪酸形成第三個雙鍵。

近年來，已經(jīng)有許多植物的ω-3脂肪酸去飽和酶基因被克隆，如馬鈴薯［8］、黃瓜［9］、菊花［10］、紫蘇［11］和播娘蒿［12］等。研究也發(fā)現(xiàn)這些脂肪酸去飽和酶基因在改變植物膜脂脂肪酸的組成、葉綠體的發(fā)育以及葉片成熟過程中三烯脂肪酸含量的增加、抗冷性的增強、低溫光抑制后光合能力的恢復(fù)等方面具有重要作用。轉(zhuǎn)AtFAD8基因煙草的MDA含量明顯低于野生型植株，而抗氧化酶活性明顯高于野生型植株，表明AtFAD8基因通過增加轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化能力而提高煙草幼苗的耐冷性［13］。將煙草中ω-3脂肪酸去飽和酶的編碼基因沉默會導(dǎo)致突變植株的三烯脂肪酸比野生型植株明顯減少［14］。于超［15］發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)番茄內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-3脂肪酸去飽和酶基因FAD3能夠增強番茄植株的耐冷性，而抑制該基因表達(dá)可提高番茄植株的耐熱性。陳瑋國等［16］發(fā)現(xiàn)油葵FAD2-5可能參與了油葵對低溫脅迫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，并且其表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。曹英萍等［17］發(fā)現(xiàn)OsFAD7和OsFAD8的 mRNA 在低溫下上升，并且mRNA的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。

甜高粱是單子葉禾本科高粱屬C4植物，其莖稈含糖量極高，具“二代甘蔗”的美名［18］。甜高粱不僅生物量極高，還耐鹽堿、耐旱、耐澇、耐高溫、耐嚴(yán)寒［19］。甜高粱對土壤的適應(yīng)能力很強，pH值為5.0-8.5，均能很好生長。適應(yīng)栽培的區(qū)域廣泛，10℃以上積溫2 600-4 500℃的地區(qū)（從海南島至黑龍江），均可栽培。高粱籽?？墒秤?、飼用、釀酒；莖稈可做飼料、制糖等，稈渣還可飼用、制紙等［20］。因此，甜高粱具有較大的生物學(xué)優(yōu)勢以及經(jīng)濟學(xué)優(yōu)勢。而對甜高粱這些優(yōu)良的特性進(jìn)行研究有利于我們對其他作物進(jìn)行基因改造，獲得耐脅迫性的作物。

本研究將從甜高粱分離并克隆得到的ω-3脂肪酸去飽和酶基因FAD7在野生型擬南芥中過量表達(dá)，測定了在低溫處理條件下野生型和過表達(dá)植株的Fo、Fv/Fm、電導(dǎo)率、MDA、超氧陰離子自由基和過氧化氫含量等指標(biāo)，闡明SbFAD7在植物抗冷中的作用，旨為探索植物抗冷的機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甜高粱自交系M-81E種子，擬南芥野生型種子，大腸桿菌菌株（DH5α），農(nóng)桿菌菌株（GV3101）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自華越洋，植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒膠回收試劑盒等均購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1SbFAD7基因的克隆及生物信息學(xué)分析 將沙培的長至三葉一心期的甜高粱取材，提取其RNA進(jìn)行PCR擴增，然后將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶以獲取基因的全長。所用引物為FAD-F、FAD-R，序列見表1。利用NCBI數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)軟件對SbFAD7的蛋白結(jié)構(gòu)、同源性和進(jìn)化進(jìn)行分析。

1.2.2 甜高粱FAD7基因的表達(dá)分析 將長至三葉一心時期的甜高粱一部分用0、50、100、150和200mmol/L NaCl溶液處理48 h，一部分用100 mmol/L NaCl溶液處理0、12、24、36、48 h，一部分用4℃處理0、4、8、12、24 h后取材提RNA，用Beacon Designer 7軟件設(shè)計RT-PCR引物，引物為FAD-S和FAD-A。選用甜高粱的β-actin基因作為內(nèi)參，引物為Sbactin-S和Sbactin-A。引物序列如表1。

1.2.3 擬南芥過表達(dá)植株中SbFAD7基因的表達(dá)量分析 以野生型，過表達(dá)植株的RNA為模板，用設(shè)計的qPCR特異性引物進(jìn)行基因的定量分析。利用擬南芥Actin2基因的引物作為內(nèi)參，引物分別為AtActin2-S和AtActin2-A，序列如表1。

表1 PCR和RT-PCR所用的引物序列

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥中脂肪酸含量的測定 采用毛細(xì)管氣相色譜法測定野生型和過表達(dá)植株中脂肪酸的含量。將葉片在研缽中研磨后放入105℃的恒溫干燥箱烘至恒重。在10 mL比色管中加入樣品0.5 g，再加入2 mL提取液（苯∶石油醚=1∶1），靜置 30 min 以上。然后加入1 mL 0.4 N 的 KOH/CH3OH溶液，靜置10 min以上。加入超純水定容，待上層液澄清后，將0.25 mL的上清液移入安培瓶中，在N2下吹干，再加入50 μL正己烷，最后取0.5 μL進(jìn)樣分析。每個處理均做3個重復(fù)。

1.2.5 Fo和Fv/Fm的測定 葉片暗適應(yīng)20-30 min后，以英國Hansatech公司生產(chǎn)的FMS2便攜調(diào)制式熒光儀測定Fo、Fm等熒光參數(shù)。暗適應(yīng)下可變熒光可根據(jù)公式計算：

式中，F(xiàn)o：初始熒光，即PSII反應(yīng)中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量；Fm：最大熒光產(chǎn)量，即PSII反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時的熒光產(chǎn)量；Fv：暗適應(yīng)下的可變熒光，反應(yīng)QA的氧化還原狀態(tài)；Fv/Fm：暗適應(yīng)下PSII的最大光化學(xué)效率。

1.2.6 電導(dǎo)率的測定 將長勢差不多的葉片放入具塞試管中，先用去離子水洗3次，然后加15 mL去離子水置于真空泵中抽氣30 min，振蕩器上振蕩2 h，靜置搖勻，測定初電導(dǎo)。然后沸水煮30 min，冷卻至室溫10 min，測定終電導(dǎo)。根據(jù)公式計算：

相對電導(dǎo)率（%）=（初電導(dǎo)-空白）×100/（終電導(dǎo)-空白）。

1.2.7 MDA的測定 取擬南芥的葉片，稱重，剪碎，放入研缽中，加入少量石英砂和2 mL 0.1%的三氯乙酸（TCA），充分研磨，將勻漿移入試管中，用1.5mL 0.1%的三氯乙酸分別沖洗研缽兩次，將沖洗液都倒入試管中，再加入2.5 mL 0.5%的硫代巴比妥酸，搖勻，沸水浴10 min后，立即取出放入冷水中，冷卻后，3 000 r/min離心10 min，取上清液量其體積，以0.5%的硫代巴比妥酸溶液為空白對照，用分光光度計分別測量532 nm和600 nm的吸光度。根據(jù)公式計算MDA的含量：

式中：ΔA：A532和A600之差，N：上清液總體積，155為1 mmol反應(yīng)產(chǎn)物在532 nm處的吸收系數(shù)，W：稱取植物材料的鮮重（g）。

1.2.8 超氧陰離子自由基含量的測定 稱取植物材料 0.3 g，加 5 mL 預(yù)冷的 50 mmol/L PBS（pH 7.8）在冰上研磨。勻漿液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，12 000 r/min離心20 min，冰上保存，此時上清液為的待測液。反應(yīng)體系：1 mL待測液+0.8 mL 50 mmol/L PBS（pH 7.8）+0.2 mL 10 mmol/L 鹽酸羥胺，振蕩混勻，25℃溫浴1 h，再分別向各管中加1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸，1 mL 7 mmol/L α-萘胺，振蕩混勻，25℃溫浴20 min，以標(biāo)曲中的1號管作對照，測定530 nm處的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算O2-.的產(chǎn)生速率。

1.2.9 過氧化氫含量的測定 稱取植物材料0.2 g，加5 mL 4℃預(yù)冷的丙酮研磨提取。勻漿液轉(zhuǎn)入5mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，上清液即為H2O2待測液。反應(yīng)體系為：1 mL待測液+0.1 mL 20% TiCl4+0.2 mL濃氨水，待沉淀形成后3 000 r/min離心10 min，棄上清，用適量丙酮（5 mL）洗滌3到5次，最后用5 mL 2 mol/L H2SO4溶解沉淀后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，以標(biāo)曲中的1號管作對照，測定415 nm處的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算H2O2的含量。

2 結(jié)果

2.1 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

SbFAD7基因的編碼區(qū)序列長度為1 356 bp，編碼452個氨基酸。從圖1可以看出，玉米的ω-3脂肪酸去飽和酶基因與甜高粱SbFAD7基因親緣關(guān)系最近。

2.2 甜高粱SbFAD7基因在不同處理下的表達(dá)分析

如圖2所示，SbFAD7基因的表達(dá)受到鹽和低溫的誘導(dǎo)，隨著鹽濃度的增加，SbFAD7基因的表達(dá)量逐漸升高，在200 mmol/L NaCl處理下，SbFAD7基因的表達(dá)量最高（圖2-A）；隨著鹽和低溫處理時間的增加，SbFAD7基因的表達(dá)量也隨之增加，分別在鹽溶液處理48 h、低溫處理24 h時，SbFAD7基因的表達(dá)量達(dá)到最高（圖2-B和2-C）。

2.3 擬南芥過表達(dá)植株中SbFAD7的表達(dá)分析

擬南芥過表達(dá)植株的不同株系中，SbFAD7的轉(zhuǎn)錄水平和野生型相比都顯著提高，表明SbFAD7基因已成功轉(zhuǎn)入到擬南芥植株中（圖3）。其次，過表達(dá)植株OE1、OE13和OE17中SbFAD7的轉(zhuǎn)錄水平相對于其他株系來說比較高，因此我們選擇OE1、OE13和OE17進(jìn)行后期生理指標(biāo)的驗證。

圖1 甜高粱FAD7基因的生物信息學(xué)分析

圖2 甜高粱FAD7基因在非生物脅迫下的表達(dá)量分析

圖3 過表達(dá)擬南芥植株中SbFAD7的表達(dá)量分析

2.4 擬南芥過表達(dá)植株葉片的脂肪酸含量分析

如表2所示，相對于野生型植株，過表達(dá)植株的18∶2含量明顯降低，18∶1含量稍微降低，而18∶3含量明顯升高。從圖4也可看出，低溫處理后過表達(dá)植株的抗冷性明顯比野生型植株的抗冷性強。說明SbFAD7基因過量表達(dá)后，促進(jìn)了18∶2向18∶3的轉(zhuǎn)化，提高了擬南芥植株的抗冷性。

表2 擬南芥植株中脂肪酸含量

2.5 低溫處理對野生型和過表達(dá)植株Fo和Fv/Fm的影響

從圖5可看出，低溫脅迫下，野生型和過表達(dá)擬南芥的Fo均有所升高，而最大光化學(xué)效率降低，但相對于野生型來說，過表達(dá)植株OE1，OE13，OE17的Fo增加的少，而Fv/Fm的下降幅度較野生型要低，表明SbFAD7在擬南芥中的過量表達(dá)，能夠提高擬南芥的光化學(xué)效率，減輕低溫光抑制，提高擬南芥抵抗低溫的能力。

圖4 冷處理后野生型植株和過表達(dá)植株的生長情況

2.6 低溫處理對野生型和過表達(dá)植株電導(dǎo)率和MDA的影響

如圖6所示，低溫處理24 h條件下，野生型和過表達(dá)擬南芥的電導(dǎo)率和MDA含量都增加，但過表達(dá)植株的增加幅度明顯比對照低，這說明SbFAD7的過量表達(dá)能夠減輕低溫脅迫下膜脂過氧化水平，從而降低植物細(xì)胞遭受逆境傷害的程度。

2.7 低溫處理對野生型和過表達(dá)植株H2O2含量和O2-.含量的影響

由圖7中可以看出，在低溫處理24 h條件下，野生型和過表達(dá)擬南芥葉片的H2O2含量和O2-.產(chǎn)生速率均有所增加，而且過表達(dá)植株增加的量都比野生型增加的少，說明SbFAD7的過量表達(dá)能夠降低細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生。

圖5 冷處理后對擬南芥葉綠素?zé)晒獾挠绊?/p>

圖6 冷處理后擬南芥葉片中電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化

3 討論

低溫脅迫是對植物尤其是農(nóng)作物的生長發(fā)育威脅較大的一類非生物脅迫因子［21］，因此研究農(nóng)作物的耐冷基因一方面可以揭示農(nóng)作物的耐冷機理，另一方面還可以提高農(nóng)作物的耐冷性。

本研究發(fā)現(xiàn)SbFAD7基因的表達(dá)量與鹽濃度、鹽處理時間以及低溫處理時間成正相關(guān)，隨著鹽濃度的增大，基因的表達(dá)量也隨之增大，并在200 mmol/L下達(dá)到最大。分別隨著鹽和低溫處理時間的增加，SbFAD7基因的表達(dá)量也隨之增加。表明SbFAD7基因是組成型表達(dá)，其表達(dá)受高鹽和低溫誘導(dǎo)。

ω-3脂肪酸去飽和酶是催化18∶2轉(zhuǎn)化為18∶3的關(guān)鍵酶，研究表明，低溫處理下膜脂的三烯脂肪酸含量增加是對低溫脅迫的適應(yīng)［22］。本試驗發(fā)現(xiàn)SbFAD7基因過表達(dá)之后促進(jìn)了18∶2向18∶3的轉(zhuǎn)化。

圖7 冷處理對擬南芥中H2O2和O2-.的影響

在葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，F(xiàn)v/Fm是暗適應(yīng)下PSII最大光化學(xué)效率，代表PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率，是光抑制的重要指標(biāo)［23］。本研究發(fā)現(xiàn)低溫處理24 h條件下，SbFAD7基因過表達(dá)植株的Fv/Fm較野生型要高，表明在低溫脅迫條件下，SbFAD7基因過表達(dá)能夠增強膜的穩(wěn)定性，減輕PSII的光抑制。

膜脂脂肪酸含量的不飽和程度會影響膜的流動性［24］，通過測定電導(dǎo)率來研究低溫處理對膜的傷害程度。低溫處理下，SbFAD7基因過表達(dá)植株的電導(dǎo)率比野生型的電導(dǎo)率低。由此說明，相對于野生型，轉(zhuǎn)基因植株的膜系統(tǒng)的傷害程度比較輕。

植物的防御系統(tǒng)在低溫等逆境條件下遭到破壞后，活性氧（H2O2和O2-.）會大量積累，引發(fā)膜脂過氧化作用，進(jìn)而引發(fā)一系列的生理代謝紊亂［25］。MDA作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量代表膜脂過氧化的水平，反映植物細(xì)胞遭受逆境傷害的程度［26］。本研究發(fā)現(xiàn)在低溫處理24 h下，轉(zhuǎn)基因植株的MDA、H2O2含量以及O2-.產(chǎn)生速率均比野生型的低，這就說明SbFAD7基因能夠通過減少植物體內(nèi)的活性氧的積累，降低膜脂過氧化的程度，進(jìn)而保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，提高植物細(xì)胞的抗低溫能力。

本研究通過對甜高粱SbFAD7基因的研究發(fā)現(xiàn)該基因受低溫脅迫誘導(dǎo)，將該基因過表達(dá)擬南芥之后會促進(jìn)亞油酸向亞麻酸的轉(zhuǎn)化，提高不飽和脂肪的含量，減輕低溫光抑制，減少了活性氧的積累，從而減輕膜脂過氧化程度，保持低溫脅迫下細(xì)胞膜的完整性，提高轉(zhuǎn)基因植株的抗低溫能力。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)甜高粱ω-3脂肪酸去飽和酶FAD7基因能夠通過促進(jìn)18∶2向18∶3的轉(zhuǎn)化，減輕PSII的光抑制，減少植物體內(nèi)活性氧的積累，降低膜脂過氧化的程度，增強膜的穩(wěn)定性來提高植物的抗冷性。