周利明 房瑋

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，唐山 063210）

開花植物的有性繁殖需要雄性配子體營養(yǎng)細(xì)胞特定區(qū)域的極性生長，從而逐漸形成花粉管。通過花粉管頂端的極性擴(kuò)展，花粉管向胚珠輸送精子并完成雙受精［1］。由于花粉管具備典型極性生長的特性，且體外方便培養(yǎng)，目前已被廣泛作為研究植物細(xì)胞極性發(fā)育的理想模式系統(tǒng)［2］。發(fā)掘極性生長相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子，闡述細(xì)胞極性建成與極性生長的調(diào)控機(jī)理，是植物有性生殖方面的熱點(diǎn)領(lǐng)域，同時也為提高授粉效率這一增收策略提供一定的理論依據(jù)。

花粉管的生長過程是被嚴(yán)格調(diào)控的，并且依賴大量的信號組件，而鈣離子在其中起到極其重要的作用［3-5］。鈣離子在花粉管的伸長過程中形成一定的濃度梯度，花粉管的頂端鈣離子濃度最高，而從頂端到底部濃度逐步遞減［6］。已有研究成果發(fā)現(xiàn)打破頂端鈣離子梯度會嚴(yán)重影響花粉管的正常生長，而鈣離子梯度偏轉(zhuǎn)會引起生長軸的重新調(diào)整［7-8］。在許多物種中，頂端富集的鈣離子梯度可以表現(xiàn)出周期振蕩的特征，這種振蕩與花粉管增長率的周期變化相關(guān)［5］。鈣離子泵（ACA9）、環(huán)核苷酸門控通道（CNGC18）及類谷氨酸受體（GLR1.2和GLR 3.7）的功能研究顯示它們在調(diào)控花粉管增長率、花粉管形態(tài)和與雌配子體的互作等方面都具有重要作用［9-11］。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了鈣信號的形成及維持對花粉管極性生長的重要性。另一個重要的調(diào)控因子就是小G蛋白ROP1，其下游存在2個作用相反的效應(yīng)蛋白RIC3和RIC4，前者引起微絲的解聚，而后者促進(jìn)微絲的聚合。微絲動態(tài)（解聚與聚合）的正常維持才能造就花粉管的頂端生長，這一過程受到ROP1活性的嚴(yán)格調(diào)控［12］。

植物中鈣離子信號的傳遞是由一系列的鈣傳感器所介導(dǎo)的，鈣傳感器在與鈣離子結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)象變化并將信息傳遞給下游目標(biāo)，類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基（Calcineurin B-like protein，CBL）就是一類典型的鈣離子傳感器家族，擬南芥基因組編碼10個CBL成員，其下游效應(yīng)子是一組絲氨酸/蘇氨酸激酶，被命名為CBL互作蛋白激酶（CBL interacting protein kinase，CIPK）［13］。 不同的 CBL-CIPK復(fù)合體建立了復(fù)雜的鈣信號網(wǎng)絡(luò)，可以從胞內(nèi)和胞外鈣庫的不同部位感知鈣信號［14-15］。CBL參與調(diào)節(jié)包括離子平衡和脅迫應(yīng)對等過程在內(nèi)的多種細(xì)胞過程。CBL1或CBL9協(xié)同CIPK23激活K+通道AKT1，從而使植物在低K+條件下正常生長［16］。此外，鈣傳感器CBL4/SOS3與CIPK24/SOS2的復(fù)合體調(diào)節(jié)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1的活性，從而顯著提高植物的耐鹽性［17］。

以往的CBL相關(guān)研究主要集中于植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)機(jī)制領(lǐng)域，較少涉及花粉管的極性生長領(lǐng)域。本研究利用基因槍瞬時表達(dá)體系，分析了CBL9及其N末端保守位點(diǎn)的點(diǎn)突變體CBL9G2A的亞細(xì)胞定位與過量表達(dá)表型情況，旨在揭示CBL9在花粉管極性生長中的功能及其調(diào)控機(jī)制，為提高授粉效率這一增收策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草（Nicotiana tabacum）培養(yǎng)于溫室內(nèi)，28℃恒溫，光周期為12 h/12 h?；驑屴D(zhuǎn)化前，收集新鮮的煙草花粉（每次轉(zhuǎn)化需8朵花的花粉）。擬南芥（Arabidopsis thalianaL.，col-0）生長條件為 22℃、光周期16 h/8 h?；驑寣Ｓ媒鸱邸~網(wǎng)、微載體、易裂膜等購自Bio-Rad公司（Bio-Rad，U.S.A.）。限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA Polymerase、dNTP及T4 DNA ligase購自六合通經(jīng)貿(mào)有限公司（代理Takara的產(chǎn)品）。凝膠回收試劑盒以及Taq DNA Polymerase購自天根生化科技公司。Plasmid Mini Kits試劑盒的品牌為QIAGEN。T4 DNA ligase及AMV Reverse Transcriptase購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 選取6周齡的擬南芥花朵提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增獲得CBL9全長序列?；趏verlap-PCR技術(shù)，將CBL9的N末端中第二位甘氨酸（Gly）定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋla），獲得CBL9G2A點(diǎn)突變體，序列檢測正確的目的片段分別構(gòu)建到瞬時表達(dá)載體pBLAT：YFP（目的片段連接到黃色熒光蛋白YFP的N末端）。

1.2.2 基因槍轉(zhuǎn)化試驗 采用Plasmid Mini Kits（QIAGEN，Germany）提取用于基因槍瞬時轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，0.8 μg質(zhì)粒包裹在0.5 mg金粉上，通過基因槍瞬時轉(zhuǎn)化體系將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草花粉中。各項射擊參數(shù)為：易裂膜與微彈載體之間距離為2cm；微彈載體飛行距離為10 mm；微彈飛行距離為7 cm；易裂膜破裂壓力為1 100 psi；真空度為27 mm Hg。轉(zhuǎn)化完成的花粉在28℃，避光培養(yǎng)3-4 h后，分別通過熒光顯微鏡及共焦掃描顯微鏡對各自過表達(dá)表型及亞細(xì)胞定位進(jìn)行觀察與測量。

1.2.3 熒光顯微鏡分析花粉管表型 將轉(zhuǎn)化獲得的花粉管放在OLYMPUS熒光倒置顯微鏡（MODE BX51）下觀察，顯微鏡配備的CCD攝像機(jī)（MODE DP70，OLYMPUS）用于拍攝轉(zhuǎn)化成功的花粉管。3次獨(dú)立的轉(zhuǎn)化試驗所獲得的照片通過Zeiss LSM圖像瀏覽器（3.2版）進(jìn)行測量分析（80根左右花粉管的長度及頂端最寬處的直徑）。

1.2.4 共焦激光掃描顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位 通過共焦激光掃描顯微鏡（Model LSM 510 META，Zeiss）進(jìn)行花粉管中CBL9-YFP或CBL9G2A-YFP的亞細(xì)胞定位分析，顯微鏡激發(fā)光波段為488 nm，接受光波段為505-530 nm，通過Zeiss LSM圖像瀏覽器（3.2版）進(jìn)行相應(yīng)的圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 CBL9在成熟花粉中高量表達(dá)分析

目前，擬南芥鈣傳感器主要有4個基因家族：鈣調(diào)素（CaM）、類鈣調(diào)素（CML）、類鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基（CBL）以及鈣離子依賴蛋白激酶（CPK）。CBL家族包含10個成員?；诰W(wǎng)上公布的基因芯片數(shù)據(jù)（https：//www.genevestigator.ethz.ch/），生成CBL全家族成員的表達(dá)熱圖（Expression heatmap），通過顏色的深淺反映不同的CBL在各組織細(xì)胞中的表達(dá)情況（圖1）。CBL1主要在葉（保衛(wèi)細(xì)胞及葉肉細(xì)胞）與根（根冠及中柱）組織中表達(dá)，CBL2、CBL3、CBL8及CBL9在成熟花粉中相對表達(dá)較高，而在其他組織中表達(dá)較少，或者不表達(dá)。CBL4與CBL10分別主要在花柄離區(qū)和莖尖中表達(dá)。CBL5-CBL7依次主要在下胚軸、柱頭及根冠中表達(dá)。CBL9作為花粉高量表達(dá)的典型代表，被選為進(jìn)一步研究的對象。

圖1 CBL家族成員在各組織中的表達(dá)熱圖

2.2 花粉高量表達(dá)CBL9的亞細(xì)胞定位及過表達(dá)表型分析

利用基因槍技術(shù)將CBL9在煙草花粉中進(jìn)行瞬時表達(dá)，經(jīng)過3-4 h的花粉培養(yǎng)，在共焦掃描顯微鏡下，單獨(dú)表達(dá)YFP的花粉管熒光呈彌散分布。而YFP標(biāo)記的CBL9則在花粉管質(zhì)膜上有清晰的表達(dá)（圖2-A）。CBL9-YFP定位于胞內(nèi)隨著胞質(zhì)環(huán)流運(yùn)動的顆粒狀細(xì)胞器上（圖2-A）。通過生物學(xué)統(tǒng)計分析，大約80根花粉管的長度以及花粉管頂端的最寬處直徑被測量統(tǒng)計（圖2-B），與對照相比，過表達(dá)CBL9的花粉管長度顯著縮短，且寬度顯著增加。

圖2 CBL9在花粉管中的定位（A）與過表達(dá)表型統(tǒng)計（B）

2.3 CBL9的質(zhì)膜定位

CBL9的N末端存在一個保守的氨基酸位點(diǎn)（圖3-A），即第二位的甘氨酸位點(diǎn)，此位點(diǎn)對于CBL1的花粉管質(zhì)膜定位至關(guān)重要［18］。CBL9與CBL1的序列相似度超過89%，為了驗證該位點(diǎn)的作用同樣適用于CBL9，將CBL9的第二位甘氨酸（G）定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔ˋ），從而構(gòu)建CBL9的點(diǎn)突變體（CBL9G2A）。

花粉管亞細(xì)胞定位的觀察結(jié)果（圖3-B）顯示，CBL9-YFP有明顯的質(zhì)膜定位，然而CBL9G2A-YFP呈現(xiàn)出與YFP對照相一致的胞質(zhì)彌散分布。

表型量化結(jié)果（圖3-C-D）顯示，過量表達(dá)CBL9G2A并沒有顯著影響花粉管的極性生長，即花粉管的長度及寬度與對照沒有顯著差異。表明CBL9在花粉管中的功能發(fā)揮與其質(zhì)膜定位密切相關(guān)。

圖3 CBL9點(diǎn)突變體在花粉管中的定位與表型分析

3 討論

鈣離子是花粉管極性生長中至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子［4，19］。然而，對于花粉管中鈣離子信號如何被感知和傳遞并觸發(fā)下游反應(yīng)的認(rèn)識卻十分有限，迄今為止，只有少數(shù)信號組分已確定影響花粉管的萌發(fā)或生長。本研究通過基因槍技術(shù)，在煙草花粉中瞬時過量表達(dá)CBL9會使花粉管的頂端生長形態(tài)發(fā)生改變，即花粉管長度縮短，頂端腫脹。這一結(jié)果與Mahs等［18］所得出的結(jié)論相一致，進(jìn)一步印證了CBL9在花粉管頂端生長中發(fā)揮重要的作用。另外，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CBL9主要定位于花粉管的質(zhì)膜及顆粒狀細(xì)胞器，相似的定位同樣體現(xiàn)在CBL9的同源基因CBL1（氨基酸相似度為89%）上。在前人的研究中［18］，CBL1可以和標(biāo)記囊泡的染料FM4-64共定位，由此推測CBL9所定位的顆粒狀細(xì)胞器也可能為胞內(nèi)囊泡系統(tǒng)?；ǚ酃艿馁|(zhì)膜是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)與物質(zhì)交換的屏障，胞外的鈣離子通過位于質(zhì)膜上的離子通道，內(nèi)流到花粉管中，從而參與形成花粉管頂端的鈣離子梯度。維持正常的頂端鈣離子梯度對于花粉管生長的速率與導(dǎo)向至關(guān)重要［1］。目前，多個離子通道參與該調(diào)控過程，其中包括環(huán)核苷酸門控通道（Cyclic nucleotide gated channel，CNGC）及類谷氨酸受體（Glutamate receptor-like，GLR）等。質(zhì)膜定位的CNGC18過量表達(dá)導(dǎo)致花粉管的異常生長，并伴隨著胞內(nèi)鈣離子在頂端的過量聚集［10，20］。另外，GLR1.2和GLR3.7是一類配體門控的離子通道，促進(jìn)鈣離子通過質(zhì)膜流入胞內(nèi)，在生成鈣信號和濃度梯度等方面發(fā)揮關(guān)鍵功能［9］。由此可以推測質(zhì)膜定位的CBL9可能通過作用于某一或某些離子通道，參與調(diào)控胞內(nèi)的鈣離子梯度的正常建立與維持。

研究顯示CBL1的N末端存在肉豆蔻?；妥貦磅；揎椢稽c(diǎn)，這兩類脂質(zhì)修飾一方面可以影響CBL1蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的途徑，另一方面也可以妨礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)由囊泡體系到頂端質(zhì)膜的過程［21］。對CBL1的N末端保守位點(diǎn)進(jìn)行修改，能夠有效阻斷這兩種脂質(zhì)修飾，以此獲得CBL1的點(diǎn)突變體（CBL1G2A，第二位的甘氨酸定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔?。CBL1G2A無法正常定位到質(zhì)膜上，呈現(xiàn)彌散分布［18］。CBL9與CBL1的序列相似度超過89%，本研究采取了CBL9相似研究策略，并取得了相同的結(jié)果，即CBL9的N端保守位點(diǎn)的改變直接影響其正常的花粉管質(zhì)膜定位和功能發(fā)揮。CBL9定位異常的原因可能是由于其N-末端無法有效肉豆蔻酰化和棕櫚?；?，從而影響了CBL9借助囊泡體系定位到花粉管質(zhì)膜的過程。

除了花粉管極性生長方面，序列高度相似的CBL1與CBL9的相關(guān)進(jìn)展主要體現(xiàn)在植物脅迫條件下的應(yīng)激反應(yīng)。例如低鉀條件下，CBL1與CBL9共同激活下游互作靶蛋白CIPK23，具備蛋白激酶活性的CIPK23再進(jìn)一步激活質(zhì)膜定位的鉀離子通道AKT1，從而提高了植株根系吸收鉀離子的能力。另外CBL1/9-CIPK23體系還可以通過磷酸化作用，激活硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)載體CHL1以應(yīng)對低氮脅迫［13］。盡管CBL1與CBL9在很多方面都體現(xiàn)出相似的生物學(xué)功能，但兩者的組織定位表現(xiàn)出明顯的差異。CBL1主要在葉及根中表達(dá)，而CBL9則相對集中于花粉中（圖1）。由此推測CBL1可能主要在脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮作用，而CBL9可能主要調(diào)控花粉管的極性發(fā)育。

本研究中CBL9作為鈣離子感受器的一種類型，在花粉管的質(zhì)膜上呈現(xiàn)均勻分布狀態(tài)，說明CBL9功能并不局限于一個特定的質(zhì)膜區(qū)域，而是可以在整個花粉管發(fā)揮它的功能。處于生長狀態(tài)的花粉管中存在一個從頂端向下延展的鈣離子濃度梯度（2-10 μmol/L），鈣離子感受器CBL9作為分子開關(guān)的活性高低，可能取決于鈣離子在花粉管中不同質(zhì)膜區(qū)域的濃度。CBL下游存在一類蛋白激酶（CIPK），逆境脅迫研究揭示了一個錯綜復(fù)雜的CBL-CIPK互作的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)：不同脅迫條件（鹽害、低溫等）誘導(dǎo)的鈣信號被不同的CBLs所感知，然后作用于不同的CIPKs，最終將逆境誘導(dǎo)產(chǎn)生的鈣信號按照不同方式傳遞下去，以完成植物不同的生理活動需要。另外，一個CBL蛋白與不同CIPKs相互作用時可以顯示不同鈣離子濃度的依賴性［3，13，22］?；ǚ酃軜O性生長過程中可能存在類似的調(diào)控體系：花粉管不同區(qū)域內(nèi)的不同鈣離子濃度被CBL9感應(yīng)，進(jìn)而分別作用于下游不同的CIPKs，最終實(shí)現(xiàn)對花粉管頂端生長的多方面調(diào)控功能。花粉管頂端生長中的CBL-CIPK調(diào)控體系的建立，還有待CBL下游互作因子的進(jìn)一步發(fā)掘。

4 結(jié)論

CBL9主要定位于花粉管的質(zhì)膜，其過量表達(dá)造成花粉管的去極化生長，而N末端點(diǎn)突變體CBL9G2A無法定位到質(zhì)膜，并呈現(xiàn)正常的花粉管頂端生長表型。CBL9的N末端在其亞細(xì)胞定位及功能發(fā)揮方面發(fā)揮一定的作用。