杜 然，郭律均，閆建斌

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物信息學(xué)教育部重點實驗室，合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京100084）

中國白酒是我國傳統(tǒng)文化的重要組成部分。窖池固態(tài)發(fā)酵和混合酒曲等制作工藝的采用使中國白酒含有豐富的微量成分[1-5]。研究顯示，白酒中的乙酸乙酯等酯類以及醇、酚、酸、縮醛、醛酮、萜類、硫化物等微量物質(zhì)的存在對白酒的風(fēng)味、滋味及健康功效都具有重要影響[4，6-8]。

夢之藍（手工班）是洋河酒廠股份有限公司生產(chǎn)的高端白酒之一。該酒采用了低溫入池、低溫發(fā)酵、低溫餾酒的“三低”生產(chǎn)工藝；該工藝可為微生物的生長代謝提供更適宜的條件，可增加白酒中的微量成分。

利用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，我們分析了夢之藍(手工班)中微量成分的種類。結(jié)果顯示，可檢測到1100個不同物質(zhì)的信號峰，基于數(shù)據(jù)庫可定性454種不同類物質(zhì)；200～350 Da的物質(zhì)含量占總檢出物質(zhì)含量的73.1%；其中，既包括酯、脂肪酸、醇和酮等白酒中常見呈味物質(zhì)，還包括吡嗪、萜、核苷、內(nèi)酯、吡唑等較少檢出的物質(zhì)。這些結(jié)果說明該酒含有豐富的微量成分，為深入研究綿柔型白酒的風(fēng)味成因及健康效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：洋河夢之藍(手工班)由江蘇洋河酒廠股份有限公司提供。

試劑：氯化鈉、二氯甲烷、甲酸、乙腈等購自西隴化工股份有限公司。DVB/CAR/PDMS萃取纖維及萃取裝置購自美國Supelco公司。

儀器設(shè)備：安捷倫7890B-5977B氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-WAX色譜柱 (30 m×0.25，0.25 μm)；島津QP2010/ultra全二維氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，一維色譜柱RTX-5（30 m×0.25，0.25 μm）、一維色譜柱RTX-WAX（30 m×0.25，0.25 μm）、二維 色 譜 柱BPX-50（2.5 m×0.25，0.1 μm）、二維色譜柱 BPX-1（2.5 m×0.25，0.1 μm）；美國 Thermo公 司 DSQ TRACE氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀；超高壓液相色譜（UPLC）和Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀，C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱。

1.2 試驗方法

1.2.1 易揮發(fā)物質(zhì)檢測方法

采用頂空固相微萃?。⊿PME）-氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）方法。取7 mL稀釋至15%vol酒精度的白酒樣品、2 g氯化鈉（馬弗爐烘烤）和一粒攪拌子置于15 mL頂空瓶中，以DVB/CAR/PDMS萃取纖維固相萃取后，于氣質(zhì)聯(lián)用儀解析測定。氣相色譜參數(shù)為：①島津色譜儀：進樣口溫度220℃；不分流進樣（加玻璃棉）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；程序升溫：35℃起始，保持3 min，再以5℃/min升到150℃保留2 min。最后以8℃/min升到220℃保持2 min。二維參數(shù)-調(diào)制解調(diào)周期6 s，液氮冷噴流量6 L/min、熱噴溫度350℃，持續(xù)時間350 ms。②DSQ美國Thermo公司色譜儀，進樣口溫度220℃；不分流進樣（不加玻璃棉）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；程序升溫：70℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到230℃保留2 min。質(zhì)譜參數(shù)為：①7890B-5977B氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，傳輸線溫度為250℃，EI源，溫度230℃。電子轟擊能量為70 eV，發(fā)射電流為34.6 μA，預(yù)四級桿電壓為-7.8 V，采用全掃描模式，掃描范圍35～500 m/z。②QP2010/ultra全二維氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，傳輸線溫度為250℃，EI源，溫度230℃。電子轟擊能量為70 eV，發(fā)射電流為60 μA，預(yù)四級桿電壓為-3.5 V，采用全掃描模式，掃描范圍50～520 m/z。③DSQ美國Thermo公司氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，傳輸線溫度為250℃，EI源，溫度230℃。電子轟擊能量為70 eV，發(fā)射電流為100 μA，預(yù)四級桿電壓為-7.8 V，采用全掃描模式，掃描范圍35～500 m/z。

1.2.2 半揮發(fā)物質(zhì)檢測方法

取全揮發(fā)物質(zhì)測定過程中萃取的酒樣，在80℃恒溫條件下平衡5 min以后，用100 μM PDMS萃取纖維攪拌萃取40 min，攪拌轉(zhuǎn)速為1500 r/min。之后，迅速將萃取纖維插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進樣口中，以220℃解吸3 min測定。氣相色譜儀和質(zhì)譜參數(shù)與1.2.1節(jié)相同。

1.2.3 難揮發(fā)物質(zhì)檢測方法

取50 mL酒樣用15 mL二氯甲烷溶液萃取2次。收集萃取液，氮吹至1.5 mL，溶液轉(zhuǎn)移至棕色樣品瓶待測。氣相色譜儀和質(zhì)譜參數(shù)與1.2.1節(jié)相同。超高壓液相色譜參數(shù)為：流動相為0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈；采用梯度洗脫（表1）；流速0.3 mL/min；進樣盤溫度4 ℃；進樣量5 μL；柱溫40℃。質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓為2.5(-)/3.5(+)，溫度300℃，掃描范圍100～1050 m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 微量成分揮發(fā)性及分子量的分布特征

利用頂空固相微萃?。⊿PME）結(jié)合色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，我們檢測了夢之藍(手工班)中的微量成分，共發(fā)現(xiàn)1100個不同物質(zhì)的信號峰，基于數(shù)據(jù)庫定性出454種不同類物質(zhì)，顯示了該酒中含有豐富的微量成分。其中，易揮發(fā)物質(zhì)共檢出342種成分，占比60.6%；半揮發(fā)物質(zhì)共檢出約58種成分，占比10.3%；不揮發(fā)物質(zhì)共檢出164種成分，占比29.1%（圖1）。

圖1 洋河夢之藍(手工班)微量成分的揮發(fā)性分布

按照分子量分布范圍進行統(tǒng)計的結(jié)果顯示（圖2），該酒中可檢出的物質(zhì)主要集中于分子量小于200 Da的范圍，占總檢出物質(zhì)的69.4%。大分子量的物質(zhì)總量相對較低，分子量超過400 Da的僅檢出12種，可能由于其獨特的生產(chǎn)工藝，限制了大分子量微量成分的存在。按照色譜峰面積對檢出物質(zhì)的含量分布分析顯示，與不同分子量范圍的物質(zhì)種類數(shù)量分布規(guī)律不同，其中，200～350 Da的物質(zhì)含量占總檢出物質(zhì)含量的73.1%。

圖2 夢之藍(手工班)檢出組分的分子量與含量分布

2.2 微量物質(zhì)種類分析

按照化合物種類對檢出物質(zhì)進行分類，發(fā)現(xiàn)該酒的組分種類極為豐富，不僅含有大量的酯、脂肪酸、醇和酮等白酒中常見呈味物質(zhì)，而且含有吡嗪、萜、核苷、內(nèi)酯、吡唑等較少檢出的物質(zhì)。具體各類物質(zhì)的種類見圖3。

圖3 夢之藍(手工班)主要組分分布

2.2.1 酯類

酯類物質(zhì)是白酒的重要的呈味物質(zhì)之一[2，4]，洋河夢之藍（手工班）中共檢測出155種，是種類最多的化合物，主要包括直鏈酯、支鏈酯、不飽和酯、羥基酯、羰基酯等。其中，直鏈酯中檢出的己酸乙酯和乙酸乙酯分別是濃香型和清香型白酒的主體香氣成分[9-10]；不飽和酯中檢出的亞油酸乙酯，具有降低血液中膽固醇和血脂的作用，多用于防治動脈粥樣硬化癥等代謝疾病[11]；羥基酯中檢出的2，3-二羥基-(9Z，12Z，15Z)-十八碳三烯酸酯，是中藥復(fù)方夏枯草中重要的活性物質(zhì)，具有重要的降血壓的作用[12]。

此外，在白酒中較少存在的長鏈酯，在洋河夢之藍（手工班）中也有檢出，這類物質(zhì)可能是綿柔型白酒風(fēng)味的重要來源之一[2]。我們還檢出多種羰基酯物質(zhì)，這些物質(zhì)雖然不是主要的白酒風(fēng)味物質(zhì)，但卻是多種風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[2]，在洋河酒的呈味過程中可能發(fā)揮作用。

2.2.2 脂肪酸類

脂肪酸類物質(zhì)也是中國傳統(tǒng)白酒中重要的呈味物質(zhì)之一，該酒中檢測出脂肪酸類物質(zhì)70種，分為直鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸。其中，已有研究顯示，不飽和脂肪酸還與白酒降度后引起渾濁有著密切的關(guān)聯(lián)[2，8]。在該酒中，共檢出了丁烯酸、己烯酸、庚烯酸、辛烯酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等多種不飽和脂肪酸。

2.2.3 醇類

醇類是白酒風(fēng)味物質(zhì)的來源之一，除乙醇外，共檢測出醇類物質(zhì)42種，主要包括直鏈脂肪醇、支鏈脂肪醇、不飽和醇、環(huán)狀支鏈醇和多元醇等。直鏈和支鏈脂肪醇中檢出的主要為C1—C18的多種脂肪醇，是蒸餾白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)[1-2，4，13-15]。此外，該酒中檢出了多種不飽和醇，不飽和醇是葡萄酒中常見的呈味組分，在白酒中較少檢出[16-17]。多元醇中檢出了丙二醇衍生物、己二醇衍生物、庚二醇及其衍生物和壬二醇，這些多元醇目前僅在我國綿柔型白酒中檢出[2，18]。

2.2.4 酮類

酮類物質(zhì)也是白酒重要的呈味物質(zhì)，共檢測出25種，主要包括飽和脂肪酮、羥基/羰基酮、連二酮和環(huán)酮等。其中羥基/羰基酮類物質(zhì)在中國白酒中較少檢出[2，15，18]，其在夢之藍（手工班）中的作用尚待進一步的深入研究。

2.2.5 吡嗪類

吡嗪類物質(zhì)主要由芽孢桿菌產(chǎn)生，是白酒的主要風(fēng)味物質(zhì)之一，同時具有重要的生物活性功能[2]。研究顯示，吡嗪類物質(zhì)多具有抗氧化、抗腫瘤和增強人體免疫力等作用[19]。該類物質(zhì)檢測出12種，主要包括去乙酰華蟾毒精和2，3-二甲基-5-乙基吡嗪，但其對洋河酒風(fēng)味和健康功效的作用有待深入研究。

2.2.6 萜類

萜類化合物是重要的生物活性物質(zhì)，具有抗炎、衰老和抗癌等多種作用[6，20]。該類化合物多見于添加中草藥發(fā)酵或浸泡的藥酒中[21]，但在白酒中很少檢出，目前僅在清香型白酒汾酒和二鍋頭白酒中檢出β-DMST和β-CARY等萜類物質(zhì)[22-23]。洋河酒中檢出萜類物質(zhì)10種，主要包括半萜、一萜、倍半萜、二萜及多萜等，這些物質(zhì)可能有獨特的作用，有待深入研究。

2.2.7 核苷類似物

核苷類似物具有重要的抗病毒和提高免疫力的藥用價值，廣泛用于肝炎、艾滋病等嚴重威脅人體生命安全疾病的臨床治療[24-27]。洋河酒中檢測出9種核苷類似物，包括2'-脫氧肌苷，5-尿苷一磷酸，2’，3’，5’-三-O-乙酰水粉蕈素，5，6-二氫尿嘧啶，6-氮雜胸腺嘧啶，5，6-二氨基-1-甲基尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶鹽酸鹽，2’-脫氧胞嘧啶核苷和尿苷酸。這些核苷類似物在洋河酒中的健康功效，需要進一步研究。

2.2.8 其他物質(zhì)

除了以上常見種類的物質(zhì)外，在本次研究中還檢出了包括醛類、含硫類、內(nèi)酯類等多種對白酒的風(fēng)味和滋味具有較大貢獻的物質(zhì)。

除了以上物質(zhì)，洋河夢之藍（手工班）還含有醛類、含硫類和內(nèi)酯類等對酒品的風(fēng)味和滋味具有貢獻的物質(zhì)。其中，醛類物質(zhì)反式-2，4-癸二烯醛，已發(fā)現(xiàn)在啤酒老化的過程中對風(fēng)味變化有重要作用[2，18]；含硫類物質(zhì)甲硫氨酸和胱氨酸等物質(zhì)可能在洋河酒中起到了重要的呈味作用[2，27]；在葡萄酒風(fēng)味中扮演重要作用的內(nèi)酯類物質(zhì)[2，19-20]，如丁位十一內(nèi)酯等也在洋河夢之藍（手工班）中存在；此外，還發(fā)現(xiàn)了乙酰谷酰胺、呋喃它酮、叔丁基對苯二酚、紫草氰苷、蟾蜍二烯內(nèi)酯和妥布霉素等具有生物活性功能的物質(zhì)。其中，乙酰谷酰胺屬于胺類物質(zhì)，研究顯示，其具有改善神經(jīng)細胞代謝，維持神經(jīng)應(yīng)激能力及降低血氨的作用，多用于腦外傷昏迷、智力減退、神經(jīng)性頭痛及腰痛等的臨床治療[28-29，21-24]。呋喃它酮屬于酮類物質(zhì)，是重要的廣譜抗菌藥物，廣泛用于多種革蘭氏陽性菌、陰性菌感染的臨床治療[30]。叔丁基對苯二酚（簡寫TBHQ）屬于酚類物質(zhì)，已有的研究顯示，其在動物和植物油脂中抗氧化能力顯著高于其他物質(zhì)[31-32]，不僅對其他的抗氧化劑和螯合劑有增效作用，而且在其他酚類都不起作用的油脂中依然有效[32]，是非常優(yōu)良的抗氧化劑。紫草氰苷屬于糖苷類物質(zhì)，其具有抗炎活性，臨床上常用于解熱解毒等[33]。蟾蜍二烯內(nèi)酯屬于內(nèi)酯，現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的抗癌活性[34]。妥布霉素屬于吡喃類物質(zhì)，是臨床常用的重要抗生素[35]。

3 結(jié)論

本研究利用二維氣質(zhì)和超分辨液相質(zhì)譜對洋河夢之藍（手工班）的微量成分進行了分析，定性檢出454種不同成分，包含酯、脂肪酸、醇、萜、醛、酮等多種的風(fēng)味與滋味物質(zhì)，還檢出諸如亞油酸乙酯、叔丁基對苯二酚、乙酰谷酰胺、紫草氰苷、萜類物質(zhì)、核苷類似物和吡嗪類物質(zhì)等具有潛在健康功效的成分。這些結(jié)果為進一步研究夢之藍（手工班）所含的微量成分對該酒的風(fēng)味、滋味及健康效應(yīng)的影響機制奠定了理論基礎(chǔ)，也為利用微量成分的含量調(diào)控，定向改善洋河白酒的品質(zhì)和健康功效提供了重要指導(dǎo)。