李志操，黃 波，向文碧，孫琮杰，吳西軍，周艷華， 何志旭，舒莉萍*

(1. 貴州醫(yī)科大學細胞工程生物醫(yī)藥技術國家地方聯合工程實驗室，組織工程與干細胞實驗中心，臨床醫(yī)學院兒科學教研室， 貴州省再生醫(yī)學重點實驗室，貴陽 550004；2. 中國醫(yī)學科學院成體干細胞轉化研究重點實驗室，貴陽 550004； 3. 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科學教研室，貴州 遵義 563003)

紅細胞數量減少是引起貧血的一個主要原因，目前最有效、最直接的治療手段是輸注紅細胞，但每次輸注的量大且存在血污染、酸中毒和過敏反應等風險[1-2]。紅細胞的生成除了需要造血原料外，調節(jié)因子的參與也是其中必要一環(huán)，而gata1(globin transcription factor 1)作為一個重要的紅系轉錄因子[3]，主要參與紅細胞的形成、增殖和成熟，對正常造血起著至關重要的作用，是紅細胞生成的重要調控因子且在一定程度上參與造血發(fā)育過程[4-5]。

目前主要利用小鼠進行造血發(fā)育的研究，但是發(fā)育慢、成本高、且不便于觀察，使其在研究過程中有一定的局限性。近年來，斑馬魚作為一個出色的探索造血發(fā)育疾病的模式生物越來越受廣大科研工作者的喜愛[6]，利用斑馬魚模型具有體型小、體外受精、繁殖力強、且胚胎發(fā)育早期透明易于觀察和操作、發(fā)育周期短、成本低、與人類基因組高度保守等特點[7-8]，使得斑馬魚在造血發(fā)育研究方面擁有其它實驗動物所不具備的天然優(yōu)勢。

cloche對斑馬魚成體成血管干細胞的產生和維持有很大的作用[9-10]，cloche-/-突變體斑馬魚的特征體是在血液和內皮細胞的發(fā)育都有缺陷[11]，心臟因為缺乏內皮細胞層而被擴大，并呈鐘形[12],故本實驗擬利用對先天性原始造血缺cloche-/-突變體斑馬魚進行心包腔內直接注射純化的gata1+紅系祖細胞，為進一步研究紅系祖細胞移植后的功能鑒定提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.2 主要試劑與儀器

斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(中國北京愛生科技發(fā)展有限公司)；體視顯微鏡(日本Nikon公司)；生化培養(yǎng)箱(中國科邁公司)；流式細胞分析儀(美國Beckman FC500)；顯微注射儀(美國Harvard公司)；拉針儀(日本Narishige公司);瓊脂糖(西班牙Biowest); 2-苯硫脲(美國Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 收集胚胎及觀察熒光

將雄魚和雌魚按1∶1或2∶1的比例放入交配缸內用隔板隔開，次日光照10 min后拔板，0.5 h后收集胚胎并清洗掉雜質，加入胚胎培養(yǎng)液放置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每8 h更換一次新的胚胎培養(yǎng)液，用體視熒光顯微鏡觀察各個時間點的熒光表達情況。

1.3.2 流式細胞術分選gata1+細胞

取500枚22 hpf的zTg(gata1:EGFP)胚胎，去卵膜后用手術刀片將尾部血島(posterior blood island，PBI)區(qū)切下置于EP管中，用1× PBS快洗三次，研磨棒攪碎，用PBS液沖入平皿，用胰酶消化30～40 min，消化成單個細胞懸液，再加1 mL FBS終止消化，離心后去一半上清，將剩余液體用尼龍濾網過濾，細胞懸液離心，棄上清，加PBS清洗細胞懸液，離心，棄上清，加PBS重懸沉淀上機分選。收集gata1+細胞；以相同的方法處理Tubingen野生型斑馬魚作為對照組。

1.3.3gata1+細胞移植及移植后細胞的存活、分布情況觀察

將100枚42 hpf的choche-/-突變體斑馬魚胚胎去卵膜后放置于含0.1 mg/mL三卡因(tricaine)麻醉劑的胚胎培養(yǎng)液中，在顯微鏡下按順序將胚胎固定在顯微注射板上，并用撥針撥動胚胎使心臟朝注射針方向上揚約45°，有利于注射針的推進和抽出并注意保持胚胎濕潤，以約200個/尾的細胞數量通過顯微注射入cloche-/-突變體斑馬魚心臟內。將注射后的斑馬魚胚胎移入不含麻醉劑的胚胎培養(yǎng)液中并放入生化培養(yǎng)箱中，于移植后0, 2, 4, 16 h觀察斑馬魚體內的綠色熒光細胞存活、分布情況。

2 結果

2.1 連續(xù)觀察轉基因斑馬魚系zTg(gata1:EGFP)的熒光表達情況

注：A～J：分別為各個不同時相胚胎的明場和熒光。藍色箭頭：ICM區(qū)；黃色箭頭：頭部。圖1 轉基因斑馬魚系zTg(gata1:EGFP)的熒光表達情況Note. A-J, the bright field and fluorescence photos of different phase embryos. Blue arrows indicate the ICM region; Yellow arrows indicate the head of zebrafish embryos.Figure 1 Fluorescence expression of transgene zebrafish zTg(gata1:EGFP)

通過圖1可以看到在12 hpf 攜帶綠色熒光蛋白的gata1+細胞在頭部(黃色箭頭所示)和中間細胞群(intermediate cell mass, ICM)(藍色箭頭所示)開始表達，隨后14～18 hpf在頭部和ICM區(qū)逐漸增多(如圖1ABCD所示)，在22 hpf時頭部和后部ICM區(qū)的gata1+細胞達到高峰(圖1E所示)，隨后在24～48 hpf頭部和ICM區(qū)的細胞逐漸減少(圖FGHIJ)所示，追蹤觀察結果如圖1所示。

2.2 gata1+細胞的流式分選結果

如上所述，根據zTg(gata1:EGFP)在斑馬魚中的熒光表達情況，顯示在22 hpf的時候gata1+細胞的表達是最強的，本課題采用了WT進行對照(圖2A、2B所示)，確定R2區(qū)域的細胞為gata1+細胞(圖2D所示)，結果如圖2所示。

2.3 移植gata1 +細胞到cloche-/-突變體斑馬魚心臟后的效果評估

如圖3所示，觀察到gata1+細胞在cloche-/-突變體心臟內增殖，圖A是一個胚胎注射的示意圖，綠色箭頭指的是注射時的進針角度，藍色箭頭指的是注射的部位，圖B左邊圖示指的是WT野生型斑馬魚，右圖指的是cloche-/-突變體的斑馬魚，通過右圖的黃色箭頭可以明顯的發(fā)現cloche-/-突變體的心臟是增大的，C、D、E、F分別是移植后通過顯微鏡追蹤觀察移植后紅系祖細胞在cloche-/-突變體心臟增殖的結果(紅色箭頭)。

注：A：顯微注射示意圖；B：42 hpf野生型斑馬魚和cloche-/-突變體斑馬魚；C：注射gata1+細胞0 hcloche-/-突變體斑馬魚(42 hpf)的明場及其熒光表達情況；D：注射gata1+細胞2 h后cloche-/-突變體斑馬魚(44 hpf)的明場及其熒光表達情況；E：注射gata1+細胞4 h后cloche-/-突變體斑馬魚(46 hpf)的明場及其熒光表達情況；F：注射gata1+細胞16 h后cloche-/-突變體斑馬魚(58 hpf)的明場及其熒光表達情況。藍色箭頭：顯微注射部位；綠色箭頭：顯微注射角度；黃色箭頭：cloche-/-突變體斑馬魚心包變化情況：紅色箭頭：紅系組細胞增殖情況。圖3 cloche-/-突變體中gata1 +細胞移植后表達情況Note. A, Schematic illustration of the microinjection. B, Wild-type zebrafish and cloche-/- mutant zebrafish at 42 hpf. C, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 0 hour of gata1+cells injection (42 hpf) under bright and fluorescent fields. D, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 2 hours of gata1+ cells injection (44 hpf) under bright and fluorescent fields. E, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 4 hours of gata1+ cells injection (46 hpf) under bright and fluorescent fields. F, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 16 hours of gata1+ cells injection (58 hpf) under bright and fluorescent fields. Blue arrow indicates the site of microinjection; Green arrow indicates the angle of microinjection; Yellow arrows indicate the change in pericardium of cloche-/- mutant zebrafish; Red arrows indicate the proliferation of erythroid progenitor cells.Figure 3 Expression of gata1+cells in cloche-/- mutants after transplantation

3 討論

貧血是臨床上比較常見的一種疾病，由外周血紅細胞容量低于正常下限所導致，主要表現為頭暈、心跳加快和面色蒼白等癥狀，其病因主要包括紅細胞生成減少、破壞過多以及大量失血[13-14]。輸血是目前最有效地治療方法之一，但輸血存在諸多不利于患者的并發(fā)癥且輸血治療是個長期過程對紅細胞的需求量大[15]。因此本課題從此角度出發(fā)，設想通過移植紅系祖細胞的方式來促進自身紅細胞的生成以減少外源性紅細胞的輸注和并發(fā)癥的風險。gata1是具有兩個鋅指結構域的關鍵紅系轉錄因子，通過與多種轉錄因子結合協(xié)同發(fā)揮作用，是紅細胞發(fā)育過程中的必不可少調控因子[16-18]，它的缺失可引起嚴重貧血，胚胎干細胞也只能發(fā)育至原始紅細胞階段均不能發(fā)育成熟且發(fā)生凋亡，當gata1功能恢復后貧血情況可以得到改善且造血發(fā)育系統(tǒng)也得以恢復正常[19-21]。

斑馬魚中與紅系造血相關的轉基因系zTg(gata1:EGFP)斑馬魚系已經建立，由gata1驅動綠色熒光蛋白，表達于在5體節(jié)期后部側板中胚層(posterior paraxial mesoderm，PLM)區(qū)，到12體節(jié)期gata1+細胞向內側遷移，隨后細胞逐漸增多，形成ICM區(qū)。

近年來，斑馬魚逐漸成為造血發(fā)育研究實驗動物模型中的新寵，在其體內的移植研究也成為各研究領域的熱點，如原腎注射，腹側緣注射，但這些移植方法很難準確定位且易導致大量出血和胚胎存活率低。研究顯示cloche基因在斑馬魚早期血細胞的形成和血管內皮分化的過程當中是很重要的一個調控轉錄因子，當發(fā)生cloche-/-突變的時候，cloche-/-突變體斑馬魚可以表現為先天性原始造血的缺陷，由于內皮細胞的分化受影響所以心臟內膜缺損導致心房增大，24 hpf可以看到心臟搏動,但是體內未見血液循環(huán)。由于cloche-/-突變體斑馬魚心臟明顯增大且能在無血液循環(huán)的條件下存活，是一個很好的造血移植研究模型。故本實驗將純化后的gata1+細胞通過顯微注射的方法移植入cloche-/-突變體斑馬魚的心腔中，看是否能重建造血。cloche-/-突變體由于先天性原始造血缺陷，在圖3A中可以看到cloche-/-突變體斑馬魚其體內沒有血液循環(huán)，心內膜的缺損可以看到心房異常擴大。通過移植后20 min使用熒光顯微鏡觀察并間隔拍攝，在心臟處可以看到gata1+細胞表達(圖3C所示)，隨后每隔兩小時觀察一次，圖3D、3E可看到心臟處的gata1+細胞逐漸增多并且逐漸在心臟內循環(huán)(如圖3E所示)，在注射16 h后可能由于細胞遷移導致解聚以致視野中觀察到綠色熒光減弱(如圖3F所示)，但是仍然可以看到心臟內增殖的gata1+細胞，對紅系祖細胞移植后功能的進一步研究具有重大意義。

在斑馬魚體內細胞移植實驗的建立，由于斑馬魚體外受精、胚體發(fā)育早期透明易于觀察，發(fā)育迅速等特點能夠在顯微鏡下觀察并了解所涉及的生物學機制，為細胞移植后疾病的研究提供可能解決這些問題的實驗基礎。