亢菊俠，楊 洋，孟琳欽

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者之間存在著明顯的互作關(guān)系，植物病毒的侵染會(huì)影響植物體內(nèi)多種生理活動(dòng)，涉及光合作用、植物防御反應(yīng)、能量傳遞等[1]；介體昆蟲取食植物韌皮部汁液時(shí)，盡管僅對(duì)植物表皮造成微小的創(chuàng)傷，然而所分泌的唾液卻可能破壞植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并且誘導(dǎo)植物激活復(fù)雜的防御反應(yīng)[2]。寄主植物的這些變化，影響著后期介體昆蟲的行為、生物學(xué)特征和體內(nèi)生理生化代謝，是介體昆蟲種群動(dòng)態(tài)變化和植物病毒病流行的主要決定因子[3]。相關(guān)研究得到了廣泛的關(guān)注。

對(duì)介體昆蟲來說，植物病毒是一種外來物質(zhì)，昆蟲取食攜帶植物病毒的植物后，會(huì)產(chǎn)生防御或者調(diào)節(jié)反應(yīng)。解毒酶和保護(hù)酶是昆蟲體內(nèi)兩類重要酶系，在對(duì)抗逆境及維持昆蟲正常的生理生化代謝方面具有重要作用，常被用來作為評(píng)價(jià)昆蟲生理適應(yīng)性的指標(biāo)[4]。Xu等[5]報(bào)道了褐飛虱在水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)病株上取食1代后，雌性成蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性分別比取食健康稻株褐飛虱提高了51. 84%和59. 29%，過氧化物酶(POD)也具有相同的變化趨勢(shì)。陳晨等[6]進(jìn)一步研究取食感染RBSDV水稻不同時(shí)間后，褐飛虱和白背飛虱體內(nèi)3種保護(hù)酶活性的變化，表明白背飛虱和褐飛虱成蟲及若蟲體內(nèi)SOD、CAT、POD的活性隨取食時(shí)間延長(zhǎng)而增加。曹增等[7]研究取食感染番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的番茄后，煙粉虱的生理防御反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)煙粉虱體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和羧酸酯酶(CarE)活性先顯著上升后顯著下降，取食72 h后，三大保護(hù)酶SOD、POD、CAT的活性顯著升高；取食30 d后，保護(hù)酶活性持續(xù)顯著高于取食72 h及對(duì)照。上述試驗(yàn)獲得感染植物病毒的植物時(shí)，都需要前期介體昆蟲進(jìn)行取食傳毒，由于未設(shè)置無毒介體昆蟲前期取食組試驗(yàn)，無法真正厘清是植物病毒的影響還是前期介體自身取食行為的影響，因此應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,簡(jiǎn)稱BYDV)，可以侵染100多種禾本作物，它引起的小麥黃矮病是一種世界性的病害，在全球各個(gè)國(guó)家均有發(fā)生。1960年，中國(guó)首次在陜西和甘肅發(fā)現(xiàn)小麥黃矮病，是中國(guó)北方麥區(qū)危害最重、發(fā)生最廣的病毒病之一，為目前流行最廣的四大病害之一，一般年份減產(chǎn)5%左右，流行年份減產(chǎn)30%以上[8]。大麥黃矮病毒按照蚜蟲的傳播特性、反映類型與寄主范圍等生物學(xué)特性可以劃分出不同的株系，周廣和等[8]已鑒定出GAV、PAV、GPV 和RMV 4 種株系，其中PAV由禾谷縊管蚜和麥長(zhǎng)管蚜傳播。近些年，通過田間調(diào)查，中國(guó)PAV株系逐漸增多。前人研究發(fā)現(xiàn)，介體蚜蟲取食感染大麥黃矮病小麥后，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖、取食行為及寄主選擇性均有積極的影響[9]，但這些影響的生理生化機(jī)制尚不明確。

為了厘清前期介體取食和植物病毒對(duì)后來蚜蟲體內(nèi)生理生化的影響，本研究以BYDV-PAV作為測(cè)試病毒，以其介體禾谷縊管蚜作為測(cè)試蚜蟲。以取食健康小麥作為對(duì)照組，以取食前期受到無毒蚜蟲危害的小麥作為蚜蟲誘導(dǎo)組，以取食前期受到有毒蚜蟲危害(通過RT-PCR鑒定，小麥成功感染BYDV-PAV病毒)作為蚜蟲和病毒誘導(dǎo)組，通過比較上述3種處理蚜蟲體內(nèi)保護(hù)酶與解毒酶的活性差異，從而揭示BYDV-PAV及前期介體取食誘導(dǎo)對(duì)禾谷縊管蚜影響的生化機(jī)制，從而完善病毒與昆蟲互作的內(nèi)在機(jī)制，并為BYDV與禾谷縊管蚜的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 小麥種植 小麥品種為‘矮抗58’，由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。播種前用清水浸泡小麥種子24 h，用一次性紙杯作為花盆，放入花盆體積2/3 的育苗基質(zhì)，撒入浸泡好的小麥種子，每盆種4～5 顆種子，待小麥長(zhǎng)出后只留3 株小麥，然后在其上再覆蓋1/3 的育苗基質(zhì)，用噴壺噴水至浸透育苗基質(zhì)，用頂端帶有紗網(wǎng)的透明塑料籠罩罩住，放入人工氣候箱(溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%，光周期16L∶8D，下同)培育，待小麥長(zhǎng)至一心一葉期備用。

1.1.2 供試毒源 BYDV-PAV毒源來自楊凌農(nóng)場(chǎng)(34°17′48.5″N ，108°04′34.9″E)。采集到的顯癥小麥，利用RT-PCR 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行BYDV常見的3種株系鑒定[10-12](BYDV-PAV 引物為PAV-F:GTACAAGGCAAATGGCACGAC，PAV-R:GTTCTGCCTGTTTCCCAGCAT；BYDV-GAV引物為 GAV-F:ATGAATTCAGTAGGCCGTAGAAAT，GAV-R:CTATTTGGGAGTCATGTTGGCAAC;BYDV-GPV引物為 GPV-F：ATGAGTACGGTCGCCTTAGAA，GPV-R：TT- CGTCAAGCGTAACTGT；陽(yáng)性對(duì)照由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室吳云峰教授饋贈(zèng))，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，BALST比對(duì)后，確認(rèn)僅含PAV 株系。由實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)的無毒禾谷縊管蚜作為介體，蚜蟲獲毒后，轉(zhuǎn)移到盆栽小麥(‘矮抗58’)上，在人工氣候箱內(nèi)上長(zhǎng)期飼養(yǎng)。蚜蟲和小麥每隔2～3 代均進(jìn)行BYDV上述3種株系檢測(cè)，確保蚜蟲和小麥僅感染大麥黃矮病毒PAV 株系。

1.1.3 供試蚜蟲 供試禾谷縊管蚜單頭采自西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)麥田(34°17′18.8″N ， 108°04′06.0″E)，在室內(nèi)人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)10 代以上。形成單克隆系。并進(jìn)行RT-PCR 鑒定，其體內(nèi)不含BYDV 任何株系，確保為無毒禾谷縊管蚜 備用。

1.1.4 酶活測(cè)定試劑 過氧化物酶(POD)試劑盒，過氧化氫酶(CAT)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，酸性磷酸酶(ACP)測(cè)試盒，堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒，乙酰膽堿酯酶(AchE)測(cè)試盒，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.1.5 試驗(yàn)儀器 infiniteM200全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；BIC-300人工氣候箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-98-II A電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用直徑9 cm、高8 cm的花盆種植4～5粒小麥種子，用頂端帶有紗網(wǎng)的透明塑料籠罩罩住，放入人工氣候箱，待小麥長(zhǎng)到一心一葉期，保留3株。接入15頭(每株5頭)攜帶PAV株系禾谷縊管蚜3齡若蚜作為病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組；接入15頭無毒禾谷縊管蚜3齡若蚜作為蚜蟲誘導(dǎo)組，不接蚜蟲的小麥作為對(duì)照組。每個(gè)處理重復(fù)3次。72 h后，剔除前期所接蚜蟲，接入30頭24 h內(nèi)初生的無毒禾谷縊管蚜若蚜，待長(zhǎng)至成蚜后，將30頭成蚜收集在無菌1.5 mL離心管內(nèi)，速凍于液氮后，放入-80 ℃冰箱保存。同時(shí)收集病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組花盆中的3株小麥葉片，進(jìn)行RT-PCR鑒定， 確保3株小麥均感染BYDV-PAV病毒，收集到的蚜蟲才能進(jìn)行下一步酶活測(cè)定。蚜蟲誘導(dǎo)組和對(duì)照組中的植物亦進(jìn)行同樣操作，確保小麥體內(nèi)不感染病毒。

1.2.2 酶原液制備及酶活測(cè)定 將待測(cè)蚜蟲從-80 ℃冰箱取出稱量，按質(zhì)量∶體積=1∶9的比例加入無菌9 g/L的生理鹽水冰浴研磨，研磨成勻漿液后于4 ℃、2 500 r/min離心10 min,取上清即為酶原液。所有酶活性測(cè)定均按照南京建成酶活試劑盒的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用 S-N-K 法進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)。采用SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚜蟲及大麥黃矮病毒誘導(dǎo)對(duì)禾谷縊管蚜保護(hù)酶活性的影響

2.1.1 POD活性的變化 與取食健康小麥(對(duì)照組)相比，取食前期受無毒禾谷縊管蚜危害小麥(蚜蟲誘導(dǎo)組)和取食前期感染BYDV-PAV小麥(病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)POD 活性均顯著升高(P=0.000和P=0.046)，上升幅度分別達(dá)到206.9%和49.3%；而與蚜蟲誘導(dǎo)組相比，病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組禾谷縊管蚜體內(nèi)POD 活性顯著下降(P=0.000)，下降幅度達(dá)51.3%。說明前期蚜蟲的取食行為可誘導(dǎo)小麥抗性，使得后期蚜蟲體內(nèi)的POD活性顯著升高，但PAV病毒存在時(shí)，可顯著降低這種影響 (圖1-A)。

CK.對(duì)照組 Control group；WD.蚜蟲誘導(dǎo)組 Previous non-infection aphids induction group；YD.病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組 Previous BYDV-infection aphids induction group；數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤” The data was “mean±SE”；誤差棒上不同大寫字母表示用S-N-K法檢驗(yàn)P<0.05水平差異顯著性，下同 Different uppercase letters on the error bars indicate significant difference atP<0.05 level by S-N-K test，the same below

圖1 蚜蟲及大麥黃矮病毒誘導(dǎo)下禾谷縊管蚜體內(nèi)保護(hù)酶POD(A)、SOD(B)和CAT(C)的活性
Fig.1 Protective enzymes POD (A),SOD (B) and CAT(C) activities
ofRhopalosiphumpadiunder different treatments

2.1.2 SOD活性變化 與取食健康小麥(對(duì)照組)相比，取食前期受無毒禾谷縊管蚜危害小麥(蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)SOD活性顯著升高(P=0.000)，上升幅度達(dá)到161.7%，而取食前期感染BYDV-PAV小麥(病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)SOD活性顯著下降差異(P= 0.015)，下降幅度達(dá)27.8%；而與蚜蟲誘導(dǎo)組相比，病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組禾谷縊管蚜體內(nèi)SOD活性顯著下降(P=0.000)，下降幅度達(dá)72.4%。說明前期蚜蟲的取食行為可誘導(dǎo)小麥抗性，使得后期蚜蟲體內(nèi)的SOD活性顯著升高，且PAV病毒可顯著降后期蚜蟲體內(nèi)SOD的活性 (圖1-B) 。

2.1.3 CAT活性的變化 與取食健康小麥(對(duì)照組)相比，取食前期受無毒禾谷縊管蚜危害小麥(蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)CAT活性顯著升高(P=0.010)，上升幅度達(dá)到138.9%，而取食前期感染BYDV-PAV小麥(病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)CAT活性無顯著差異(P= 0.972)；而與蚜蟲誘導(dǎo)組相比，病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組禾谷縊管蚜體內(nèi)CAT活性顯著下降(P= 0.010)，下降幅度達(dá)57.5%。說明前期蚜蟲的取食行為可誘導(dǎo)小麥抗性，使得后期蚜蟲體內(nèi)的CAT活性顯著升高，但PAV病毒存在時(shí)，可顯著降低這種影響 (圖1-C)。

2.2 蚜蟲及大麥黃矮病毒誘導(dǎo)對(duì)禾谷縊管蚜解毒酶活性的影響

2.2.1 ACP活性的變化 與取食健康小麥(對(duì)照組)相比，取食前期受無毒禾谷縊管蚜危害小麥(蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)ACP活性顯著升高(P=0.000)，上升幅度達(dá)到190.8%，而取食前期感染BYDV-PAV小麥(病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)ACP活性顯著下降差異(P= 0.031)，下降幅度達(dá)34.3%；而與蚜蟲誘導(dǎo)組相比，病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組禾谷縊管蚜體內(nèi)ACP活性顯著下降(P=0.000)，下降幅度達(dá)77.4%。說明前期蚜蟲的取食行為可誘導(dǎo)小麥抗性，使得后期蚜蟲體內(nèi)的ACP活性顯著升高，且PAV病毒可顯著降后期蚜蟲體內(nèi)ACP的活性 (圖2-A) 。

2.2.2 AKP活性的變化 與取食健康小麥(對(duì)照組)相比，取食前期受無毒禾谷縊管蚜危害小麥(蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)AKP活性顯著升高(P=0.000)，上升幅度達(dá)到138.9%，而取食前期感染BYDV-PAV小麥(病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)AKP活性無顯著差異(P= 0.170)；而與蚜蟲誘導(dǎo)組相比，病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組禾谷縊管蚜體內(nèi)AKP活性顯著下降(P= 0.000)，下降幅度達(dá)78.5%。說明前期蚜蟲的取食行為可誘導(dǎo)小麥抗性，使得后期蚜蟲體內(nèi)的CAT活性顯著升高，但BYDV-PAV存在時(shí)，可顯著降低這種影響 (圖2-B)。

2.2.3 AchE活性變化 與取食健康小麥(對(duì)照組)相比，取食前期受無毒禾谷縊管蚜危害小麥(蚜蟲誘導(dǎo)組)和取食前期感染BYDV-PAV小麥(病毒和蚜蟲誘導(dǎo)組)禾谷縊管蚜體內(nèi)AchE活性均無顯著差異(P>0.05)。說明前期蚜蟲的取食行為和PAV均不影響后期蚜蟲體內(nèi)的AchE活性(圖2-C)。

圖2 蚜蟲及大麥黃矮病毒誘導(dǎo)下禾谷縊管蚜體內(nèi)解毒酶ACP(A)、AKP(B)和AchE(C)的活性Fig.2 Detoxifying enzymes ACP(A),AKP (B)and AchE(C) activities of Rhopalosiphum padi under different treatments

3 討 論

本研究結(jié)果表明，與取食健康植物相比，取食前期受到有毒蚜蟲危害的小麥后，禾谷縊管蚜體內(nèi)保護(hù)酶SOD顯著降低，反應(yīng)取食感染植物病毒的小麥導(dǎo)致禾谷縊管蚜體內(nèi)有害物質(zhì)H2O2減少釋放，說明其體內(nèi)抗氧化能力大于取食健康小麥的蚜蟲，因此其適合度高于取食健康小麥的蚜蟲[17]。Luan等[20]發(fā)現(xiàn)B型煙粉虱在感染番茄黃化曲葉病毒的煙草上取食后，體內(nèi)解毒酶活性顯著降低，認(rèn)為昆蟲能夠通過降低解毒酶活性來減少能量消耗，由此增加其在帶毒寄主植物上的適合度。本研究也發(fā)現(xiàn)禾谷縊管蚜取食有毒小麥后，體內(nèi)解毒酶ACP也顯著降低，與上述報(bào)道一致。Hu等[9]研究結(jié)果顯示，取食BYDV感染的小麥對(duì)蚜蟲的生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖有促進(jìn)作用，本試驗(yàn)從一定程度上解釋了上述結(jié)果產(chǎn)生的原因。但本研究結(jié)果與前人在南方水稻黑條矮縮病與褐飛虱/白背飛虱、煙粉虱與黃化曲葉病毒互作研究結(jié)果具有一定差異[6-7]。這可能是由于不同類型植物病毒與介體昆蟲互作關(guān)系具有不同的生理生化機(jī)制造成的。

李軍等[21]研究了前期蚜蟲危害后，后期蚜蟲的發(fā)育歷期、體質(zhì)量差和相對(duì)日均體質(zhì)量增長(zhǎng)量的變化，發(fā)現(xiàn)對(duì)后期蚜蟲生長(zhǎng)發(fā)育有顯著的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，與取食健康植物相比，取食前期受到無毒蚜蟲危害的小麥后，禾谷縊管蚜體內(nèi)保護(hù)酶SOD、POD、CAT及解毒酶ACP、AKP活性均顯著升高，說明前期蚜蟲取食誘導(dǎo)了小麥的抗性，導(dǎo)致后期禾谷縊管蚜體內(nèi)抗氧化能力小于取食健康小麥的蚜蟲，并且通過升高解毒酶活性來誘導(dǎo)對(duì)植物的抗性，因此降低了其在前期蚜蟲危害后的寄主植物上的適合度。本試驗(yàn)從一個(gè)側(cè)面解釋了李軍等[21]結(jié)果產(chǎn)生的原因。同時(shí)，與取食前期受到無毒蚜蟲危害的小麥相比，取食前期受到有毒蚜蟲危害的小麥后，禾谷縊管蚜體內(nèi)保護(hù)酶SOD、POD、CAT及解毒酶ACP、AKP活性均顯著降低，說明小麥感染植物病毒可以克服蚜蟲危害造成的酶活性上升，使之更好地在帶毒植物上生存。

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物病毒—介體昆蟲—寄主植物三者間形成了復(fù)雜的互作關(guān)系，本試驗(yàn)僅從實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶和解毒酶活性進(jìn)行了研究。在大田中，由于還受到溫度、濕度等物理?xiàng)l件，以及其他生物的影響，因此要進(jìn)行室外試驗(yàn)，增加試驗(yàn)的可信度。另外非常有必要在此基礎(chǔ)上對(duì)保護(hù)酶和解毒酶的基因表達(dá)量進(jìn)行分析，并進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行研究，從而明確介體昆蟲對(duì)植物病毒和前期昆蟲取食更深層的基因適應(yīng)機(jī)制。