張鵬燕,嚴(yán)振偉,鐘曉松,金月梅,晏茂軍,于繼凱,辛 宇*,劉 濤**

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滸苔生長-衰亡過程中氮形態(tài)的遷移轉(zhuǎn)化過程

張鵬燕1,2,嚴(yán)振偉1,鐘曉松1,金月梅2,晏茂軍1,于繼凱1,辛 宇1*,劉 濤2**

(1.中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266100；2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

針對滸苔氮吸收代謝機(jī)制,通過連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究滸苔生長-衰亡過程中不同形態(tài)氮在藻體和培養(yǎng)液中的分布和遷移.結(jié)果表明,滸苔在生長期吸收NO3--N(17.37μmol/(g·d))而衰亡期向胞外釋放NH4+-N(0.84μmol/(g·d));在生長期胞內(nèi)NO3--N占無機(jī)氮(DIN)73.75%~92.15%,在衰亡期NH4+-N占無機(jī)氮60.87%~92.13%;培養(yǎng)液中溶解有機(jī)氮(DON)濃度持續(xù)增加,其中<1kDa組分占64%~98%,> 1kDa組分占2%~36%.在培養(yǎng)期藻體細(xì)胞吸收DIN速率平均為8.96μmol/(g·d),釋放DON的平均遷移速率約為59.57μmol/(g·d).通過收支模型計(jì)算,滸苔將近60%DIN轉(zhuǎn)化為以<1kDa 組分占優(yōu)的DON并分泌到胞外.由此可以推測,近海滸苔爆發(fā)可以在月際尺度上對水體生源要素結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響.

滸苔；氮形態(tài)；切向超濾

我國自2007年初次爆發(fā)滸苔綠潮以來,2008~ 2018年已連續(xù)10a發(fā)生了覆蓋面積超過267km2的大規(guī)模綠潮,而2009年的綠潮災(zāi)害最為嚴(yán)重,實(shí)際覆蓋面積高達(dá)2100km2[1-2].滸苔在近海生長率可高達(dá)每天21.9%,5000t藻體在6周內(nèi)可生長為100萬t[3].由于滸苔生物量指數(shù)級快速增加,并且大量積聚、于海面形成斑塊,滸苔綠潮具有持續(xù)時(shí)間長、規(guī)模大的特點(diǎn)[4-7].氮是海洋中最重要的生源要素之一.已有研究表明,滸苔綠潮規(guī)模和持續(xù)時(shí)間與海水中氮的含量、形態(tài)構(gòu)成有著密切的關(guān)系[8-15].當(dāng)水體中無機(jī)氮源被耗盡時(shí),滸苔可以吸收利用有機(jī)態(tài)氮源[16-17].滸苔還具有營養(yǎng)鹽吸收速度快的特點(diǎn),在生長期快速吸收海水中N、P等營養(yǎng)鹽并轉(zhuǎn)化為自身所需的營養(yǎng)成分;在消亡期滸苔在水體中下沉、分解,并將所含營養(yǎng)物質(zhì)釋放到海水中[11-14].由此可以推測,滸苔綠潮的大規(guī)模爆發(fā)和消亡,將會(huì)在一定時(shí)空尺度上對海水氮磷等營養(yǎng)要素的化學(xué)形態(tài)、分布和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響.因此,研究滸苔生長-消亡全周期中氮在藻體胞內(nèi)/外的形態(tài)轉(zhuǎn)化和遷移過程,對于深入認(rèn)知滸苔對氮的吸收代謝機(jī)制,預(yù)測滸苔爆發(fā)-消亡后對近海生態(tài)環(huán)境的影響,具有非常重要的科學(xué)意義和參考價(jià)值.

本文針對滸苔生長和消亡過程中,胞內(nèi)外不同形態(tài)氮的分布和遷移轉(zhuǎn)化這一科學(xué)問題,通過實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng),研究滸苔在生長-衰亡周期對氮素的吸收和釋放過程;通過分析培養(yǎng)液和藻體胞內(nèi)不同形態(tài)氮(NO3--N、NO2--N、NH4+-N和DON)的含量,探討滸苔生長-衰亡過程培養(yǎng)液中和藻體胞內(nèi)的不同形態(tài)氮之間的轉(zhuǎn)化、遷移;通過切向超濾分析不同分子量范圍DON濃度,探討滸苔生長-衰亡過程中胞內(nèi)外DON組分的相對變化規(guī)律;最終通過建立簡單收支模型,量化滸苔爆發(fā)-衰亡對于水體氮庫結(jié)構(gòu)的影響.本文可為滸苔生長-衰亡過程與水體營養(yǎng)要素之間相互作用提供詳實(shí)的數(shù)據(jù)支撐,并為滸苔爆發(fā)生態(tài)效應(yīng)評估提供可靠的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藻體的選取和預(yù)處理

滸苔()實(shí)驗(yàn)組樣品取自于2018年7月綠潮發(fā)生時(shí)漂浮于青島近岸的滸苔,選擇藻體無“白化”,顏色為翠綠色的藻體,用海水沖洗,去除雜物,饑餓培養(yǎng)3d.預(yù)處理:實(shí)驗(yàn)前將洗凈的藻體放入0.2% KI-I 溶液中浸泡1min,再用過濾滅菌的人工海水漂洗3~4次,以去除原生動(dòng)物和附生生物[18].

1.2 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用一次性培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)藻種于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中用10L 的玻璃瓶培養(yǎng),稱取滸苔20g,分別放入玻璃瓶中進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置 3組平行樣;溫度:20℃;光照:6000lx;光照周期:12h:12h[19].培養(yǎng)所用海水為人工海水,用MilliQ水配置f/2培養(yǎng)基[20].人工海水中添NO3--N為30.00μmol/L,PO43--P為1.00μmol/L,不添加其他氮源.

1.3 參數(shù)測定

根據(jù)研究目標(biāo),需對培養(yǎng)液、藻體細(xì)胞內(nèi)不同形態(tài)氮、以及培養(yǎng)液溶解有機(jī)氮不同分子量組分進(jìn)行測定.在每次取樣時(shí),取出1g滸苔用濾紙吸干表面水分后,用電子天平稱取藻體的濕重;同時(shí)取1L培養(yǎng)液,培養(yǎng)液用0.2μm的GTTP濾膜(Merck Millipore)過濾后用于營養(yǎng)鹽濃度測定和切向超濾分析.用QuAAtro營養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀(Seal Analytical, Germany)測定水體中的NO2--N、NO3--N和NH4+-N,檢出限分別是0.01,0.06,0.09mmol,精密度￡3%[21].溶解無機(jī)氮(DIN)為NO2--N、NO3--N和NH4+-N濃度之和;總?cè)芙獾?TN)采用堿性過硫酸鉀消化之后用化學(xué)發(fā)光法測定,該方法的檢測限為<0.01mmol/L[22]; DON由TN和DIN差減得到.滸苔體內(nèi)的NO2--N、NO3--N和NH4+-N的測定,取0.1g經(jīng)65℃烘干至恒重的滸苔粉末,加入50mL MilliQ水溶解[23],振蕩10min后用0.2μm的GTTP濾膜過濾后,將濾液用營養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀測定其NO2--N、NO3--N和NH4+-N濃度;胞內(nèi)TN的測定方法同培養(yǎng)液中TN的測定方法.

1.4 DON不同分子量組分測定

本文采用切向超濾來對培養(yǎng)液中DON不同分子量組分進(jìn)行準(zhǔn)確測定.自然海水中溶解有機(jī)物分子量￡1000的組分主要包括小肽、寡肽、寡糖、寡核苷酸和維生素等;分子量310000的組分,主要包括腐殖質(zhì)、多肽、結(jié)合態(tài)氨基酸和蛋白質(zhì)等[24].實(shí)驗(yàn)中采用的是Pall Filtron Corporation的Ultralab TM切向超濾系統(tǒng),Ultralab TM超濾膜的標(biāo)準(zhǔn)截留分子大小分別為1kDa(分子量約為1000)和10kDa(分子量約為10000).在切向超濾過程中,預(yù)濾液平行流過膜表面,比濾膜孔徑小的物質(zhì)不斷透過濾膜成為超濾液,粒徑大的物質(zhì)則隨著切向流重新回到樣品池中,如圖1所示.隨著超濾過程的進(jìn)行,截留物質(zhì)不斷被濃縮,最后溶液被分離為兩部分:一部分為超濾液(又稱滲透液);另一部分為濃縮液(亦稱截留液).例如:用1kDa的超濾膜包,則濃縮液含有> 1kDa溶解有機(jī)氮,而超濾液含有<1kDa溶解有機(jī)氮.

圖1 切向超濾裝置的工作流程

在樣品處理前,切向超濾系統(tǒng)先用0.1mol/L NaOH清洗30min,然后用Milli-Q水清洗,之后再用0.1mol/L HCl清洗20min,此清洗步驟重復(fù)3次.在兩個(gè)樣品中間,依次用Milli-Q水,0.1mol/L NaOH溶液,Milli-Q水,0.1mol/L HCl溶液,Milli-Q水各沖洗30min,最后用少量下一個(gè)樣品潤洗切向超濾系統(tǒng),然后開始切向超濾.超濾后所得超濾液和濃縮液,置于潔凈的125mL高密度聚乙烯瓶(Thermo Co., USA)中用于測定無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)氮.

為了檢驗(yàn)切向超濾系統(tǒng)效率和樣品污染可能性,利用如下公式計(jì)算有機(jī)氮的質(zhì)量平衡[25]:

式中:為回收率,%;為濃縮因子(體積比);c、c和c分別為超濾液、預(yù)濾液和濃縮液中DON和DIN濃度.當(dāng)<100%時(shí),表明有機(jī)氮或無機(jī)氮營養(yǎng)鹽在切向超濾過程中有損失,如果>100%,則表明切向超濾過程中有可能有潛在的污染.

經(jīng)計(jì)算樣品的切向超濾結(jié)果(表1): DIN的回收率為83.05%~101.00%,平均值為92.99%;DON的回收率為88.06%~106.37%,平均值為96.40%.以上結(jié)果表明在切向超濾過程中沒有明顯的DIN和DON的污染或損失,可以通過切向超濾對不同分子量DON組分實(shí)現(xiàn)較為準(zhǔn)確的定量回收.

表1 切向超濾質(zhì)量平衡檢測

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 滸苔相對增長速率

圖2 滸苔藻體的相對增長速率

由圖2可見,滸苔在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,藻體的相對增長速率在第6h、12h之內(nèi)呈現(xiàn)增加的趨勢,第12h時(shí)滸苔的相對增長速率高達(dá)2.87%/d.從第24h開始,藻體重量開始下降,相對增長速率降低了2.76%.第72h后滸苔重量迅速下降,之后滸苔重量降低的速率趨于平穩(wěn).根據(jù)滸苔的相對增長速率界定滸苔的生長-衰亡期,相對生長速率為正值,則滸苔處于生長期;相對增長速率為負(fù)值,則滸苔處于衰亡期.

2.2 培養(yǎng)液中氮形態(tài)和濃度變化

滸苔培養(yǎng)液中的NO3--N濃度在培養(yǎng)初期迅速下降,之后維持在較低的水平(圖3).在第72h時(shí),水體中NO3--N濃度降到2.88μmol/L,之后水體中的NO3--N濃度變化趨于平穩(wěn)的趨勢,NO3--N濃度維持在<1μmol/L.NH4+-N濃度變化呈現(xiàn)初始時(shí)降低隨后略有上升的趨勢,最終藻液中NH4+-N濃度達(dá)到21.87μmol/L.在培養(yǎng)全過程中培養(yǎng)液中NO2--N濃度在0.20μmol/L附近波動(dòng),沒有顯著變化.

圖3 培養(yǎng)液中NO3--N、NO2--N和NH4+-N的濃度變化

圖4 培養(yǎng)液中DIN、DON和TN的濃度變化

滸苔培養(yǎng)液中DON和DIN的變化趨勢呈現(xiàn)相反的態(tài)勢(圖4).TN和DON呈現(xiàn)出升高-降低-升高的趨勢.在生長期滸苔培養(yǎng)液中DON的濃度達(dá)到86.67μmol/L.衰亡初期培養(yǎng)液中DON含量呈現(xiàn)增加的趨勢;衰亡后期滸苔培養(yǎng)液中DON的濃度達(dá)到179.66μmol/L.

2.3 滸苔藻體細(xì)胞胞內(nèi)氮形態(tài)和濃度變化

圖5 藻細(xì)胞內(nèi)NO3--N、NO2--N和NH4+-N的濃度變化

圖6 藻細(xì)胞內(nèi)DIN、DON和TN的濃度變化

滸苔藻體細(xì)胞胞內(nèi)NO3--N、NO2--N和NH4+-N的濃度變化如圖5所示.在培養(yǎng)24h之內(nèi)滸苔藻細(xì)胞內(nèi)NO3--N呈現(xiàn)增加的趨勢,最高達(dá)到7.36μmol/g濕重,到第72h時(shí),滸苔藻細(xì)胞內(nèi)的NO3--N濃度迅速下降,降低到0.25μmol/g.培養(yǎng)后期,藻細(xì)胞內(nèi)的NO3--N濃度略有升高,但一直維持在 1.00μmol/g以下.在生長期胞內(nèi)NO3--N占DIN的73.75%~92.15%在整個(gè)培養(yǎng)階段,滸苔藻細(xì)胞內(nèi)的NO2--N濃度變化不大,維持在0.45umol/g左右.NH4+-N與NO3--N的變化趨勢相反,在培養(yǎng)前期(0~72h),滸苔藻細(xì)胞內(nèi)NH4+-N的濃度一直維持在較低的水平(1.00umol/g以下),隨著滸苔的衰亡降解,滸苔藻細(xì)胞內(nèi)NH4+-N濃度迅速上升,到培養(yǎng)結(jié)束時(shí),滸苔藻細(xì)胞內(nèi)的NH4+-N濃度最高時(shí)達(dá)到3.65μmol/g.在衰亡期NH4+-N占DIN的60.87%~92.13%.圖6為滸苔藻體內(nèi)DIN、TN和DON的濃度變化情況.在培養(yǎng)前期(0~72h),藻體內(nèi)DON濃度降低,DIN濃度呈現(xiàn)增加的趨勢.培養(yǎng)后期(72~720h),隨著滸苔的衰亡,滸苔藻體內(nèi)的DON含量先上升后降低,最終至65.47μmol/g.

2.4 培養(yǎng)液和藻體內(nèi)N/P變化情況

在滸苔的生長-衰亡過程中,培養(yǎng)液中N/P的變化范圍為23.03~1358.61,而滸苔胞內(nèi)N/P的變化范圍為0.66~22.79,如圖7所示.培養(yǎng)液和藻細(xì)胞內(nèi)N/P的變化趨勢大體一致,在生長初期培養(yǎng)液和胞內(nèi)的N/P升高,在72h時(shí)呈現(xiàn)降低的趨勢,在衰亡后期時(shí),培養(yǎng)液和藻細(xì)胞內(nèi)的N/P一直呈現(xiàn)增高的趨勢.

圖7 培養(yǎng)液和藻細(xì)胞內(nèi)N/P的變化

2.5 培養(yǎng)液中DON不同分子量組分分析

本文采用切向超濾對藻液中不同分子量范圍的DON進(jìn)行分離,研究培養(yǎng)過程中藻液DON不同組分的相對比例變化.在整個(gè)培養(yǎng)階段選取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第72,168,336,504,720h),對藻液DON進(jìn)行切向超濾分離,分為3個(gè)組分:0.2μm~10kDa(標(biāo)注為>10kDa),1~10kDa和<1kDa.綜合5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)可知<1kDa組分占DON比重最大,在60%以上.0.2μm~10kDa和1~10kDa組分DON含量相對較小,在40%以下(圖8、9).

滸苔隨著藻體的生長衰亡,<1kDa的組分所占比例呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,其所占比例最大高達(dá)98%,后期降低至64%左右(圖9).而>10kDa和1~10kDa的DON所占比例呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢.在培養(yǎng)階段初期,>10kDa組分所占比例為5.0%,在培養(yǎng)終止時(shí)升高到14.1%;而1~10kDa的組分所占比例從開始的4.0%升高到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的22.2%.

圖8 各組分中DON的濃度變化

圖9 各組分占DON百分比的變化

3 討論

滸苔作為一種大型藻類,能夠從海水中吸收大量氮磷營養(yǎng)鹽,利用這些無機(jī)形態(tài)的生源要素轉(zhuǎn)化為自身需要的有機(jī)/無機(jī)物質(zhì),最終隨著其死亡分解再將這些有機(jī)/無機(jī)物質(zhì)釋放到水體中[26-27].一次滸苔爆發(fā)-消減歷時(shí)1~2個(gè)月[28-29].可以推測,一次短暫的滸苔爆發(fā)很有可能在月的時(shí)間尺度上對當(dāng)?shù)厮w生源要素結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響.因此,本文針對滸苔生長和消亡過程中胞內(nèi)外不同形態(tài)氮的分布和遷移轉(zhuǎn)化這一科學(xué)問題,結(jié)合連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),分為以下3個(gè)部分進(jìn)行探討:1)滸苔胞內(nèi)、外之間無機(jī)氮的遷移轉(zhuǎn)化過程;2)滸苔胞內(nèi)、外之間有機(jī)氮的遷移轉(zhuǎn)化過程;3)通過滸苔細(xì)胞氮收支模型,量化滸苔爆發(fā)-衰亡對于水體氮庫結(jié)構(gòu)的影響.

3.1 滸苔胞內(nèi)、外之間無機(jī)氮的遷移轉(zhuǎn)化過程

本文采用米氏(Mihcaelsi-Menton)方程來描述穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下藻類對營養(yǎng)鹽的吸收速率與環(huán)境中營養(yǎng)鹽濃度的關(guān)系.方程的形式為:

式中:是營養(yǎng)鹽的吸收速率,μmol/(g·d);max是營養(yǎng)鹽的最大吸收速率;是介質(zhì)中限制性營養(yǎng)鹽的濃度;K為半飽和常數(shù).

營養(yǎng)鹽吸收速率計(jì)算采用的公式為:

式中:是營養(yǎng)鹽的吸收速率,μmol/(g×d);C為取樣時(shí)培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽的濃度,μmol/L;0為培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽的濃度,μmol/L;為滸苔濕重,g;為培養(yǎng)時(shí)間,d.

培養(yǎng)介質(zhì)中NO3--N的濃度、滸苔對NO3--N的吸收速率與培養(yǎng)時(shí)間之間的變化均呈現(xiàn)出非線性關(guān)系,如圖10所示.

圖10 滸苔對NO3--N的吸收速率隨時(shí)間變化情況

由于培養(yǎng)后期培養(yǎng)液中NO3--N已被消耗低于2μmol/L,遠(yuǎn)低于半飽和常數(shù),因此選取前5個(gè)取樣時(shí)間分析得出,滸苔吸收NO3--N的動(dòng)力學(xué)過程可以用Michaelis-Menten方程(米氏方程)來描述,回歸方程為:

相關(guān)系數(shù)2=0.99(=5),滸苔的最大吸收速率為31.85μmol/(g·d),半飽和系數(shù)為6.46μmol/L.Li等[8]用40μmol/L的NO3--N培養(yǎng)的滸苔,其最大吸收速率為11.20μmol/(g(dw)·h),半飽和系數(shù)為5.00μmol/L,與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體一致.吳曉文等[9]和史華明[11]研究滸苔對硝酸氮的吸收速率均高于200μmol/(g·d),因?yàn)樗麄兣囵B(yǎng)滸苔的水體均是提高了水體的氮磷營養(yǎng)水平,其NO3--N濃度分別為160.0,111.1μmol/L,是本研究中添加NO3--N濃度的3~5倍.營養(yǎng)鹽越高越促進(jìn)滸苔生長.相對于其它種類營養(yǎng)鹽,充足的Ｎ源是滿足滸苔生長的重要基礎(chǔ).本研究中營養(yǎng)鹽濃度設(shè)定是參考我國黃海春夏季真光層硝酸鹽濃度(NO3--N最高濃度為15.00μmol/L, N/P=30:1)[30],為了培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)易于進(jìn)行和便于觀察,適當(dāng)增高NO3-N濃度為30μmol/L,這樣的培養(yǎng)結(jié)果更貼近實(shí)際近海海水中滸苔的生長狀況.

對于植物胞內(nèi)對氮素的同化途徑[31-32],一般認(rèn)為是:

Heimer和Filner最早提出硝酸根存在的兩個(gè)庫,即代謝庫與儲(chǔ)藏庫,代謝庫位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),儲(chǔ)藏庫位于液泡內(nèi).只有代謝庫內(nèi)的硝酸根離子才可誘導(dǎo)產(chǎn)生NR并參與還原.因?yàn)樘墙徒馐窃诩?xì)胞質(zhì)中進(jìn)行,它的產(chǎn)物就是氨反應(yīng)的底物,亞硝酸根離子生成的停止是由于代謝庫內(nèi)的硝酸根離子耗盡所致.代謝庫中的NO3--N只占細(xì)胞內(nèi)含量的一小部分,而大部分則存在于液泡,因?yàn)槌墒熘参锛?xì)胞中的液泡體積占總體積的90%.

在本研究中發(fā)現(xiàn),滸苔在培養(yǎng)初期迅速吸收NO3--N(17.37mmol/(g×d)),胞內(nèi)NO3--N的含量迅速上升,最大濃度達(dá)到7.36μmol/g(圖5),培養(yǎng)后期胞內(nèi)NO3--N濃度迅速降低,一直維持在較低的水平,其平均濃度為0.56μmol/g.

積累在液泡中的NO3--N有其重要的生理意義,在營養(yǎng)充足的情況下,細(xì)胞過量(超過還原能力)吸收NO3--N是為了保證介質(zhì)在NO3--N供應(yīng)下降時(shí),液泡中的NO3--N進(jìn)入細(xì)胞中,維持細(xì)胞的生長需要. NO3--N除了作為合成蛋白質(zhì)的氮源外,在液胞內(nèi)還是重要的滲透物質(zhì),尤其在弱光條件下,細(xì)胞內(nèi)碳水化合物合成減少,液胞內(nèi)有機(jī)物含量下降,NO3--N可以替代其滲透調(diào)節(jié)作用,而且需要的能量也低[33].這就決定了植物在生長過程中勢必要積累一定的NO3--N.

NO3--N的還原作用是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的,形成的HNO2以分子態(tài)透過質(zhì)膜.NO2--N在葉綠體或前質(zhì)體內(nèi)被還原,并形成NH4+-N.由于這2種酶的連續(xù)作用,所以植物體內(nèi)沒有明顯的NO2--N積累[15].在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)滸苔藻體細(xì)胞內(nèi)NO2--N的濃度一直維持在較低水平(0.45μmol/g).

滸苔吸收水體中NO3--N后,一部分進(jìn)入液泡,另一部分在NR/NiR的催化下生成NH4+-N,之后NH4+-N進(jìn)行同化作用,轉(zhuǎn)化為DON,用于藻體的生長(圖11).水生植物的分解過程中,會(huì)有大量的營養(yǎng)物質(zhì)釋放到水體中[34-36].結(jié)合培養(yǎng)液和胞內(nèi)無機(jī)氮的變化(圖3、圖5)發(fā)現(xiàn),滸苔在營養(yǎng)充足的條件下,迅速吸收NO3--N儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi),并將一部分轉(zhuǎn)化為NH4+-N,使胞內(nèi)DIN濃度升高;隨后藻體衰亡過程中,滸苔藻體又向水體中釋放NH4+-N,導(dǎo)致培養(yǎng)液中的DIN濃度上升(21.87μmol/L).劉湘慶等[13]也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)滸苔向水體中大量釋放NH4+-N (27.24μmol/L),使得總無機(jī)氮濃度迅速升高.

圖11 細(xì)胞內(nèi)外氮素的遷移轉(zhuǎn)化

NR:硝酸還原酶;NiR:亞硝酸還原酶

整體來看,滸苔在營養(yǎng)充足的情況下會(huì)迅速吸收水體中的NO3--N,待水體處于營養(yǎng)不充足的條件下,滸苔開始逐漸進(jìn)入衰亡期,衰亡的滸苔會(huì)向培養(yǎng)液中釋放NH4+-N.滸苔在生長階段,吸收大量的NO3--N,最大吸收速率為25.39μmol/g/d,同時(shí)吸收NH4+-N,最大吸收速率為8.07μmol/g/d,衰亡期向培養(yǎng)液中釋放大量的NH4+-N(圖3),釋放速率0.84μmol/(g·d).在整個(gè)培養(yǎng)階段滸苔對培養(yǎng)液中NO3--N和NH4+-N的平均吸收速率為7.19μmol/(g·d)和1.76μmol/(g·d).滸苔胞內(nèi)NO3--N和NH4+-N的平均生成速率分別為6.84,2.16μmol/(g·d).根據(jù)胞內(nèi)NH4+-N的生長速率和培養(yǎng)液中NH4+-N的消耗速率估算滸苔藻細(xì)胞將NO3--N轉(zhuǎn)化為NH4+-N的速率為0.40μmol/(g·d).

3.2 滸苔胞內(nèi)、外之間有機(jī)氮的遷移、轉(zhuǎn)化過程

大型藻類在水體的氮循環(huán)過程中起著重要的作用,之前的研究都表明大型藻類在吸收DIN后,經(jīng)過同化作用轉(zhuǎn)化為NH4+-N和DON,釋放到水體中[37].Fong等[26]發(fā)現(xiàn)在吸收DIN的同時(shí)也向水體中釋放DON,而且DON的釋放受到吸收的DIN的影響.Tyler等[37]發(fā)現(xiàn)在在生長旺盛時(shí)期是水中DON的一個(gè)來源.大型海藻吸收DIN并轉(zhuǎn)化為DON有助于水體中氮的循環(huán),此外還可以為水體中的浮游生物提供營養(yǎng)物質(zhì).

浮游植物釋放到水體中的有機(jī)物是細(xì)胞膜滲漏和主動(dòng)滲出相互平衡的結(jié)果[38].正常生長的藻細(xì)胞也會(huì)向水體中釋放有機(jī)物[39-40].Veldhuis等[41]發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞的自催化死亡也是水體中有機(jī)物的一個(gè)重要來源,許多研究表明營養(yǎng)鹽限制會(huì)對細(xì)胞的質(zhì)膜受損和自催化死亡產(chǎn)生影響[42-44],從而引起水體中有機(jī)物的變化.生長期營養(yǎng)物質(zhì)充足,藻細(xì)胞繁殖,儲(chǔ)存的能量物質(zhì)較少,而在衰亡的過程中會(huì)向水體釋放大量的有機(jī)氮,但其體內(nèi)的大部分氮仍然保存在組織中,表現(xiàn)為有機(jī)氮組分的增加,而衰亡后期營養(yǎng)物質(zhì)嚴(yán)重缺乏,胞內(nèi)能源物質(zhì)被藻細(xì)胞消耗,DON濃度下降.

分析本研究胞內(nèi)、胞外(即培養(yǎng)液)DON含量變化可知,滸苔在整個(gè)培養(yǎng)過程中,向培養(yǎng)液中釋放大量的DON(圖4),最大釋放速率分別為104.39μmol/(g·d).在整個(gè)培養(yǎng)階段滸苔向培養(yǎng)液中釋放DON的平均速率分別為59.57μmol/(g·d).滸苔胞內(nèi)DON的生成速率為74.86μmol/(g·d).在滸苔的生長階段,培養(yǎng)液中DON的濃度呈現(xiàn)上升的趨勢,這主要是由于其自身代謝產(chǎn)生的一部分DON被釋放到水體中[39-40];在受到無機(jī)氮限制的條件下, DON的濃度上升速度依然緩慢,這可能是由于營養(yǎng)鹽限制造成藻細(xì)胞的自催化死亡,造成培養(yǎng)液中DON濃度的升高[42-44];進(jìn)入衰亡后期 DON 濃度上升速度明顯加快.Zhang等[27]也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的過程中滸苔會(huì)釋放出大量的有機(jī)物,這個(gè)快速釋放有機(jī)物的過程主要是由滸苔藻細(xì)胞的水解和分解過程產(chǎn)生的.

在整個(gè)培養(yǎng)過程中DON各組分所占百分比會(huì)有所變化,小分子有機(jī)物所占的比重在減小,大分子的物質(zhì)所占的比重增加.之前許多研究表明鹽沼植物有機(jī)物的浸出和分解分為3個(gè)過程[45-48]:第一個(gè)過程是可溶性有機(jī)物的浸出;第二個(gè)過程是微生物降解過程釋放出的生物高分子和可溶性有機(jī)物;第三個(gè)過程通常耗費(fèi)很長的時(shí)間(年),纖維素、木質(zhì)素和其他難降解的有機(jī)物的儲(chǔ)存過程.由于滸苔是一種大型海藻,不含木質(zhì)素,因此實(shí)驗(yàn)過程中DON的釋放主要是由前兩個(gè)過程引起的[27],第一個(gè)過程釋放小分子物質(zhì),第二個(gè)過程釋放高分子物質(zhì),因而造成在滸苔衰亡后期大分子物質(zhì)所占比例升高.Lee等[49]發(fā)現(xiàn)藻的死細(xì)胞會(huì)釋放更多的高分子量有機(jī)物(>1kDa),而活細(xì)胞釋放較多的低分子量有機(jī)物(<1kDa).

在本研究整個(gè)培養(yǎng)周期中,<1kDa組分由開始所占DON比例的86%先升高至93%后降低至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的80%,>1kDa組分由開始所占DON比例的14%先降低至2%后降低至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的20%.衰亡期的滸苔培養(yǎng)液中小分子有機(jī)物所占的比重在減小,大分子的物質(zhì)所占的比重增加.本研究切向超濾結(jié)果證實(shí)了滸苔在生長周期的不同階段分泌的DON不同分子量組分比重顯著不同,在培養(yǎng)初期(活細(xì)胞)浸出小分子可溶有機(jī)物多(<1kDa),而衰亡期細(xì)胞釋放出更多的高分子(>1kDa)有機(jī)物.

3.3 滸苔細(xì)胞氮收支模型

我國黃海海域發(fā)生綠潮時(shí),滸苔的規(guī)模達(dá)到百萬t以上[50-52].本研究在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,模擬了滸苔在爆發(fā)衰亡過程中,對海水中氮素的吸收、轉(zhuǎn)化和釋放的過程,最后對氮素的吸收總量、轉(zhuǎn)化量以及釋放量進(jìn)行估算.根據(jù)滸苔生長期水體中的DIN消耗量和DON的生成量估算滸苔對無機(jī)氮的轉(zhuǎn)化效率,滸苔在生長期總消耗DIN量為342.12μmol,DON的生成量為322.70μmol,估算滸苔將無機(jī)態(tài)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)氮的轉(zhuǎn)化效率為94.32%.

根據(jù)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)水體中DIN和DON分別占初始添加NO3---N的7.29%(NH4+-N占DIN的94.71%)和59.96%,其中DON中各分子量范圍<1kDa、10kDa~1kD和>10kDa的組分所占比例為38.22%、13.28%和8.46%,剩余32.75%的氮留存在藻體細(xì)胞內(nèi),如圖12所示.滸苔衰亡到第30d時(shí)水體中DIN和DON的含量為36.5,285.21μmol/kg,其中<1kDa、10kDa~1kD和>10kDa的組分含量分別為181.98, 63.23,40.31μmol/kg.若一次滸苔綠潮按100萬t濕重藻體計(jì)算,在滸苔衰亡過程中,在第30d時(shí)就會(huì)向水體中釋放DIN和DON含量分別為511t,3993t,其中向水體中釋放的<1kDa、10kDa~1kD和>10kDa的組分含量2547.77t,885.18t,564.28t.劉湘慶等[13]估算在第12d時(shí),滸苔向水體中釋放DIN的量為387.18t,其結(jié)果與本文中的數(shù)值相差不大.丁月旻[50]根據(jù)滸苔體內(nèi)的氮素百分含量2.9%(干重),估算滸苔體內(nèi)固定的氮素含量結(jié)果顯示:綠潮爆發(fā)過程中每100萬t的滸苔就會(huì)吸收約5625t的氮,與本研究數(shù)值上的差異可能是由于滸苔并未完全降解并且藻體中的氮含量沒有計(jì)算在內(nèi).隨著綠潮的消亡和滸苔的分解,滸苔自身的有機(jī)形態(tài)的生源物質(zhì)在海水中被轉(zhuǎn)化為無機(jī)形態(tài)再次被吸收利用.

圖12 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液中各形態(tài)氮占總添加NO3--N百分比

整個(gè)餅型框架為總添加的NO3--N

4 結(jié)論

4.1 滸苔生長-衰亡過程中,胞內(nèi)無機(jī)氮在生長期以NO3--N為主(73.75%~92.15%),衰亡期由NH4+-N主導(dǎo)(60.87%~92.13%);無機(jī)氮在培養(yǎng)期向胞內(nèi)遷移速率為8.96μmol/(g·d),衰亡期時(shí)向培養(yǎng)液釋放NH4+-N速率為0.84μmol/(g·d).

4.2 在整個(gè)生長周期中,培養(yǎng)液中溶解有機(jī)氮(DON)呈上升趨勢,其中<1kDa組分占64%~98%, >1kDa組分占2%~36%.胞內(nèi)向胞外DON平均遷移速率約為23.21μmol/(g·d).

4.3 近海滸苔爆發(fā)-衰亡可以在月際尺度上以較高效率將近海DIN轉(zhuǎn)化為以<1kDa組分占優(yōu)的DON并向水體中釋放,轉(zhuǎn)化比例達(dá)60%,其中可以將吸收無機(jī)氮的38%轉(zhuǎn)化為<1kDa組分,可對近海生源要素結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響.

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Transformation and migration of nitrogen forms during the growth-decay of.

ZHAGN Peng-yan1,2, YAN Zhen-wei1, ZHONG Xiao-song1, JIN Yue-mei2, YAN Mao-jun1, YU Ji-kai1, XIN Yu1*, LIU Tao2**

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；2.College of Marine Life Sciences, Ocean University of China,Qingdao 266005, China)., 2019,39(5)：1967~1976

To investigate the mechanism of nitrogen uptake and metabolism in, the distribution and migration of different forms of nitrogen in culture media and algea cells during the growth-decay process was studied with continuous culture experiments.absorbed NO3--N (17.37μmol/(g·d)) into the cell during the growth phase while released NH4+-N (0.84μmol/(g·d)) to the extracellular during the decay phase. In algae cell, up to 73.75%~92.15% of dissolved inorganic nitrogen (DIN) was NO3--N during the growth phase, while 60.87%~92.13% was NH4+-N during the decay period. The concentration of dissolved organic nitrogen (DON) in the culture media increased continually during the culture period, with < 1kDa component accounting for 64%~98% and > 1kDa component accounting for 2%~36%. The average migration rate of DIN was about 8.96μmol/(g·d), and the average release rate of DON was about 59.57μmol/(g·d). Nearly 60% DIN was converted into DON and secreted extracellularly, most of which was < 1kDa component. It can be speculated that the outburst ofimpacts the structure of biological elements significantly on the monthly scale.

；nitrogen forms；tangential flow ultrafiltration

X142

A

1000-6923(2019)05-1967-10

張鵬燕(1989-),女,山東青島人,中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院博士,主要從事浮游植物氮循環(huán)的研究.發(fā)表論文2篇.

2018-10-08

國家自然科學(xué)基金資助面上項(xiàng)目(41576082);青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室“鰲山人才”計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASTP-OS08);國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1402101);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(201762032)

*責(zé)任作者, 講師, xinyu312@ouc.edu.cn;**教授, liutao@ouc.edu.cn