王若瑋,許仕榮,羅志逢,彭宏熙,柳景青*,周曉燕,徐 軍,裘尚德,何曉芳

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環(huán)氧樹脂封面層對球墨鑄鐵管生物膜的影響

王若瑋1,許仕榮1,羅志逢2,彭宏熙2,柳景青2*,周曉燕3,徐 軍4,裘尚德3,何曉芳3

(1.湖南大學土木工程學院,湖南 長沙 410082；2.浙江大學建筑工程學院,浙江 杭州 310058；3.紹興水環(huán)境科學研究院有限公司,浙江 紹興 321000；4.紹興市制水有限公司,浙江 紹興 321035)

以實際全比例非循環(huán)管道中試平臺中水泥砂漿內襯球墨鑄鐵管為研究對象,通過分析生物膜的理化指標及微生物的群落結構來研究環(huán)氧樹脂封面層對管道生物膜的影響. 研究發(fā)現,相比于普通水泥砂漿內襯的球墨鑄鐵管,增加環(huán)氧樹脂封面層后的管道不易吸附、沉積各種物質,對生物膜細菌豐度及群落結構均有影響,其管壁生物膜細菌總數為4.01×104copies/cm2,可培養(yǎng)菌數量為1.40×10CFU/cm2,另外其物種豐度較高而多樣性較低. 因此增加環(huán)氧樹脂封面層的水泥內襯球墨鑄鐵管是一種更為優(yōu)良的管材.

供水管道；球墨鑄鐵管；封面層；生物膜；微生物群落

城市供水管網系統(tǒng)是給水系統(tǒng)中非常重要的一環(huán),經給水廠處理后達標的自來水需通過供水管網系統(tǒng)輸送給用戶.供水管網在滿足用戶對水壓、水量需求的同時,水質問題也尤為重要,故應重視管網中的二次污染問題[1].使用合適的管材與內襯,在確保水量及水壓滿足要求的同時,還可以保證水質的安全穩(wěn)定.球磨鑄鐵管因其化學性質穩(wěn)定、使用壽命較長、抗拉伸強度較大等優(yōu)點,是目前城市供水管網中最為廣泛使用的管材[2].但在使用過程中出現的腐蝕現象會對水質及管材自身造成一定的影響,為了提高其供水的安全可靠性,早在20世紀70年代,國內就采用水泥砂漿用于管道內襯[3].在國外,水泥砂漿的應用也最為廣泛[4].水泥砂漿內襯的使用主要是利用材料本身的堿性,在管道內壁形成鈍化膜,并在一定程度上阻止金屬管道內壁的腐蝕[5].但同樣由于其自身的性質,也會向管道中釋放堿性物質,在破壞水質的同時也降低了管道的使用壽命[6].英國首先提出解決方案,被輸送的水在管道中有較長滯留時間時,在水泥砂漿內襯的表面再覆蓋封面層,降低水泥砂漿自身的腐蝕及向水中釋放堿性物質的速率[7],目前常用的封面層主要有瀝青封面層、水性丙烯酸封面層、環(huán)氧涂料封面層,其中環(huán)氧涂料封面層由于其優(yōu)異的耐腐蝕性、強有力的附著力,且可以抑制堿性物質,并相比于另外兩種更為安全環(huán)保等優(yōu)點,現在應用更為廣泛[8].

管材對水質帶來的影響也受到了關注.有研究通過建立管網模擬裝置,來對比再生水在有無內襯的球磨鑄鐵管中的水質變化情況,結果表明兩種管材在不同流速及水力停留時間的條件下均對水質的物理化學指標有明顯影響[9].微生物指標也是評價水質好壞的重要部分.管道中5%的微生物以懸浮型的狀態(tài)存在,其他的95%則存在于生物膜中[10],大多數細菌的生長可能最終來自生物膜[11].生物膜的存在會加速管道的腐蝕,還會因水流剪切力和老化等原因脫落,造成水質的二次污染[10,12-13],故生物膜是很大的風險源[14-16].不同的管道內襯或封面層會對附著在其上的微生物生長及后續(xù)生物膜的形成產生較大的影響.研究表明,管道內壁粗糙程度不同,會導致生物膜中微生物的數量不同,內壁粗糙的管道內的微生物量明顯較高[17].還有研究指出,較好的管道內襯及封面層可以通過填補管材的毛細孔來降低管道內壁粗糙度,降低生物膜的生長速率[18].內襯及其完整性均會對微生物群落結構有顯著影響[19-20].

因此,多數對供水管網中管道的研究著重利用小型的管道模擬裝置來分析管道腐蝕及水質物化指標的影響趨勢,而封面層對管道內壁生物膜中微生物的豐度及群落結構的影響研究較少,且沒有大型的實際管網模擬平臺.本研究利用全比例非循環(huán)管道中試平臺中水泥砂漿內襯的球墨鑄鐵管作為研究對象,研究在真實管網條件下,增加環(huán)氧樹脂封面層對管道內壁生物膜中微生物的豐度及微生物群落結構的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及運行條件

本實驗在位于中國東部S市自來水廠內的全比例非循環(huán)管道中試平臺上進行,如圖1所示,由2種實驗管線和聯(lián)通管組成.實驗管線分別為傳統(tǒng)的水泥砂漿內襯球墨鑄鐵管(DCIP.CM)、新型的水泥砂漿內襯環(huán)氧樹脂封面層球墨鑄鐵管(DCIP.EP).50cm的長管線作為主體實驗管段,進水直接來自于水廠清水池,進水壓力見圖1,出水排入水廠回收池,且采用非循環(huán)運行,從而更好模擬管網的真實工況.進水水質監(jiān)測數據如表1所示.平臺運行過程中定期監(jiān)測運行條件,以保證其正常運行.

待裝置運行4個月后,卸下實驗管段進行生物膜采樣,采樣管段背景數據及運行條件如表2所示.

圖1 水廠非循環(huán)管道中試平臺平面圖

表2 采樣管段背景數據

注:為培養(yǎng)時間,為管徑,為流速,為管段長度,為管段壓力.

表1 管網中試平臺進水水質狀況

注:為溫度,為濁度,cl為余氯濃度,DO為溶解氧濃度,TOC為有機碳濃度,AOC為可同化有機碳濃度,HPC為可培養(yǎng)細菌數.

1.2 生物膜采樣方法

將從平臺內拆卸下來的管段放置于平鋪了潔凈無菌牛皮紙的地面上,進行拍照.在無菌水配合沖洗的情況下,用已滅菌的試管刷刷洗管道內壁,用無菌托盤盛接,反復用無菌水沖刷直至流出的水不再混濁,將托盤內的樣品全部轉移至無菌玻璃瓶中,存于低溫采樣箱中并盡快轉移至實驗室.在實驗室中,用無菌水對采集的樣品進行定容,定容后將樣品平均分成2份,一份用于生物膜理化指標和生物量測定,儲存于4℃冰箱;另一份用于后續(xù)分子生物學測定,儲存于-20℃冰箱.

1.3 水樣理化指標測定

溶解氧(DO)利用HACH-HQ30d型單路輸入多參數數字化分析儀測定.濁度利用HACH 2100Q便攜式濁度儀測定.pH值利用水質分析比色器(江蘇省無錫市峰磊機械廠)測定.余氯利用HACH PCII型單參數水質分析儀測定.總有機碳(TOC)利用島津 5000TOC儀測定.可同化有機碳(AOC)利用Check Light AOC檢測試劑盒測定.

1.4 總固體、揮發(fā)性固體測定

取混合均勻的生物膜懸濁液20mL于潔凈坩堝,在105℃下烘干至恒重,剩余總殘渣質量為即為總固體(TS);將總殘渣在550℃馬弗爐中繼續(xù)烘烤至恒重,相比總殘渣質量的減少量即為揮發(fā)性固體(VS)[21].

1.5 可培養(yǎng)菌測定

用R2A瓊脂培養(yǎng)基對生物膜懸濁液培養(yǎng)進行異養(yǎng)菌平板計數.具體步驟:配制R2A培養(yǎng)基,滅菌,倒平板,冷卻;將樣品稀釋至合適的梯度,取50μL菌液平板涂布,每份稀釋液涂布3次;涂好后用封口膜封口,倒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后計數[22].

1.6 DNA提取與熒光定量PCR

1.6.1 DNA提取將樣品過濾后,用Power Soil DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) 試劑盒提取DNA,并存于-20℃的冰箱內.

1.6.2 實時熒光定量(PCR) 采用SYBR? GREEN分析法對16S rRNA基因V3區(qū)進行定量擴增,以檢測細菌總數.擴增引物使用16S rRNA 基因V3區(qū)通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGG- CAGC-3￠)和518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG- 3￠)[23-24].擴增采用的標準DNA模板是通過提取純大腸桿菌的DNA,用338F-518R引物進行過的擴增得到的,模板為180bp.將標準DNA模板按照pClone 007Vector說明書連接至Tsingke pClone 007Vector(T載體)得到標準質粒.選用BIO-Rad CFX96TM實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad, Hercules, CA)進行測定,反應體系總體積25μL,其中包括12.5μL SYBR?、1μL PCR正向引物、1μL PCR反向引物、9.5μL ddH2O與1μL DNA模板.擴增反應條件如下:96℃預變性3min;96℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,40個循環(huán);72℃延伸5min[25].對陰性對照DNA(無菌ddH2O代替模板DNA)和10倍稀釋梯度的已知含量的陽性對照DNA(標準質粒)與樣品均進行3個平行測試,取平均值用于分析.實驗獲得標準曲線如圖2所示.

圖2 實時熒光定量PCR檢測細菌總數的標準曲線

1.7 種群多樣性分析

DNA樣品由派森諾生物公司采用Roche 454GSFLX+測序儀進行高通量測序.獲得原始數據后,首先對原始數據進行質量控制(序列長度200~ 1000bp,連續(xù)相同堿基<6;模糊堿基<1,Q25)獲得最終用于分析的序列;然后應用QIIME,根據序列的相似度將序列歸為多個操作分類單元(OTU);最后用軟件Mothur進行統(tǒng)計分析[26].

2 結果與分析

2.1 生物膜形態(tài)及理化參數的差異

裝置運行4個月后,拆卸后的管道內壁形態(tài)如圖3所示,2種管道內壁均長有生物膜,且無明顯腐蝕.但DCIP.CM管內壁的生物膜厚且均勻,約為0.5~1.0mm.DCIP.EP管內壁零星地分布著一些泥沙,未形成明顯的層狀生物膜結構,生物膜極薄.

圖3 供水管道生物膜采樣前后管道內壁的形態(tài)

如表3所示,DCIP.CM管內壁生物膜的TS值和VS值均較大,分別是DCIP.EP管的2.5倍與51.49倍.管道生物膜TS的差異與管道內壁形態(tài)的差異相吻合.VS/TS值可用來表征生物膜中生物量所占的比例,可以看出DCIP.CM管內壁生物膜中生物量比例較高,與DCIP.EP相差20.27倍.這表明相對DCIP.EP而言,DCIP.CM管內壁更易沉積和吸附物質,且更利于生物膜形成與發(fā)展.

表3 供水管道生物膜相關理化指標

2.2 生物膜微生物豐度的差異

如圖4所示,DCIP.EP管內壁生物膜細菌總數比DCIP.CM管較大,為4.01×104copies/cm2;DCIP.CM管的細菌總數為1.55×104copies/cm2.而可培養(yǎng)細菌數的趨勢與細菌總數的趨勢存在明顯差異,DCIP.EP管的可培養(yǎng)數明顯低于DCIP.CM管,僅為1.40× 10CFU/cm2.

圖4 管道生物膜細菌總數和可培養(yǎng)菌數

2.3 生物膜細菌群落結構的差異

樣品的高通量測序克隆覆蓋率大97%,測序結果很好地代表了樣品的細菌群落組成.利用Mothur軟件計算生物膜細菌群落-多樣性指數,覆蓋率均大于97%,如表4所示.DCIP.CM管生物膜物種豐度較低但多樣性較高,而DCIP.EP管則恰好相反.

管道生物膜細菌群落在門水平上的物種按照相對豐度的從高到低選擇前7種作圖(圖5),其中S1、S2、S3表示每種管材的3個平行樣. DCIP.CM管內壁生物膜的細菌群落中沒有一種絕對占優(yōu)的門類,所占比例較大的門類依次為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門,總比例為81.63%~ 91.95%.同樣,DCIP.EP管內壁生物膜的細菌群落也沒有絕對占優(yōu)的門類,依舊是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門所占比例較大,總比例為80.78%~94.91%.但具體的相對豐度不同,DCIP.EP管的變形菌門、藍藻門相對豐度明顯大于DCIP. CM管,而酸桿菌門、綠彎菌門相對豐度則又明顯小于DCIP.CM管.

表4 供水管道生物膜細菌種群多樣性指數

管道生物膜細菌群落在綱水平上的物種按照相對豐度的從高到低選擇前9種作圖,如圖6所示.在綱水平上,兩種管道內壁生物膜內仍沒有絕對優(yōu)勢菌.對比兩者的細菌群落結構不難發(fā)現,DCIP.EP管中-變形菌綱與顫藻亞綱相對豐度分別為9.12%~39.90%、0.51%~4.97%,明顯大于DCIP.CM管的3.06%~5.50%、0~0.24%;相反地,芽孢桿菌綱、-變形菌綱在DCIP.EP管中的相對豐度分別為0.85%~4.19%、0.56%~2.08%,明顯小于DCIP. CM管的2.55%~17.20%、3%~3.53%.

圖5 管道生物膜樣品細菌群落門水平相對豐度

管道生物膜細菌群落在屬水平上的物種按照相對豐度從高到低選擇前8種作圖,如圖7所示.從圖中可以看出2種管道內壁的生物膜占優(yōu)菌屬種類相似,但不同內襯的管道之間同一屬種的相對豐度差異較大.擬桿菌屬和鹽單胞菌屬在2種不同的管道中相對豐度都較大,表明了這兩種菌屬在飲用水管道內壁滋生的現象較為普遍.

圖6 管道生物膜樣品細菌群落綱水平相對豐度

圖7 管道生物膜樣品在細菌群落屬水平相對豐度

3 討論

圖4中管道微生物數量測定的實驗結果均小于之前的研究結果[22,27-28],這可能與本實驗進水的水質狀況、實驗生物膜培養(yǎng)時間及有無環(huán)氧封面層等因素有關.由表2可以看出,進水的TOC(0.9~ 1.2mg/L)和AOC(68~140μg/L)均屬于較低水平,低TOC和低AOC會限制生物膜的生長與發(fā)展[29-30].且本次實驗中生物膜的培養(yǎng)時間僅4個月,遠小于實際供水管道,生物膜可能還未達到成熟[31-32].傳統(tǒng)灰口鑄鐵管中生物膜細菌數量較高是因為其易腐蝕且粗糙度較大,更利于微生物的附著[22].管壁附著微生物會發(fā)生生物電化學反應,加快了管壁的腐蝕[33].腐蝕現象的惡性循環(huán)會導致細菌數量更多[34].管道內襯及封面層的存在不僅可以降低管道的腐蝕速度,還可抑制生物膜生長.由圖4可知,DCIP.EP管內壁生物膜的可培養(yǎng)細菌數遠小于DCIP.CM管.這與環(huán)氧樹脂封面層表面光滑和材料本身的惰性有關.一方面,管道內壁的粗糙度較小會減慢生物膜的形成與發(fā)展[35,28].另一方面,環(huán)氧樹脂屬于惰性材料,會降低微生物的附著率并抑制其生長[36].可培養(yǎng)細菌數占細菌總數的比例,DCIP.EP管的比例極低,僅有0.03%.表明DCIP. EP管對可培養(yǎng)細菌的生長有明顯的抑制作用.綜合上述,可以推斷DCIP.EP管不但不易沉積、吸附物質且對微生物的初期生長有明顯的抑制作用,可倡導在實際管網中使用.

從門、綱和屬3種水平中均可看出,2種管道在群落結構間均存在明顯差異.在門水平時,群落結構差異較小,而在屬水平時差異有變大.在圖6中可看出2種管道中-變形菌相對豐度差異明顯,其在DCIP.EP管中的相對豐度大于其在 DCIP.CM管中的相對豐度.相反,-變形菌在DCIP.CM管的平均相對豐度大于其在DCIP.EP管中的相對豐度.究其原因,DCIP.CM管在使用過程中,水泥砂漿內襯會造成水質堿化并釋放Ca(OH)2及部分水化物等堿性物質[37-39],可與管道中的余氯發(fā)生反應,導致管壁表面余氯濃度降低;相反DCIP.EP管的水泥砂漿內襯表面由于覆蓋著一層環(huán)氧樹脂封面層,會降低Ca(OH)2等堿性物質的釋放,管壁表面余氯濃度相較于DCIP.CM管略高.不同的細菌種群對氯的敏感性有明顯差異,其中-變形菌對氯有較強的耐受性[40].在較高的余氯條件下,-變形菌仍可以較好的存活[23].而-變形菌對較高的余氯濃度會比較敏感,故在余氯濃度下,-變形菌的濃度會有所降低[41-43].

從圖7中可以看出,鞘脂單胞菌屬和甲基桿菌屬在DCIP.EP管內的相對豐度要高于DCIP.CM管,在DCIP.CM管中該2種菌屬的相對豐度極小.其中的鞘脂單胞菌屬以氧氣為最終電子受體,是一種化能異養(yǎng)、需氧的菌屬,在低營養(yǎng)環(huán)境下具有高親和吸收系統(tǒng)、新陳代謝旺盛[44].且鞘脂單胞菌屬中的很多種菌種對余氯、氯胺等消毒劑具有很強的耐受性[45].另外的甲基桿菌屬以氧氣為最終電子受體,是一種化能異養(yǎng)、兼性甲基營養(yǎng)菌和罕有兼性甲烷營養(yǎng)、嚴格好氧菌屬.再加上前文對不同管材及內襯內壁表面余氯濃度水平的分析(DCIP.EP管> DCIP.CM管),即可解釋鞘脂單胞菌屬和甲基桿菌屬在各管道中相對豐度的差異.

從圖5可以發(fā)現,DCIP.CM管和DCIP.EP管的個別平行樣中存在相對豐度很高的黃桿菌綱(分別為27.54%、35.38%),但在其它平行樣中相對豐度卻極小.在圖6中,金黃桿菌屬也有同樣的情況(分別為46.45%、42.58%).表明該菌屬在管道特定區(qū)域極容易滋生.金黃桿菌屬為嚴格好氧菌,含有常見條件致病菌,可能會引發(fā)肺炎、腦膜炎及敗血癥等多種疾病.且其對氯等消毒劑有一定的抵抗作用,這也證實了其在含有余氯的管網中存活的現象.檢測出的金黃桿菌屬反映出管道內壁生物膜內可能存在潛在致病菌,故控制生物膜生長和規(guī)避其異常大規(guī)模脫落也是保證飲用水安全的重要措施.

4 結論

4.1 環(huán)氧樹脂封面層對管道內壁生物膜的理化性質及微生物的豐度有影響.經4個月的平臺運行及微生物指標的檢測可以看出,相比于DCIP.CM管道而言,DCIP.EP管不但不易吸附與沉積物質,還對生物膜的生長有抑制作用,是一種極為優(yōu)良的管材.

4.2 環(huán)氧樹脂封面層對管道內壁生物膜細菌的群落結構也有顯著影響.DCIP.CM管內壁生物膜物種豐度較低而多樣性較高,而DCIP.EP管恰好與之相反.從門、綱和屬3種水平中均可看出2種管道間均存在明顯差異.在門水平時,其群落結構差異較小,而在屬水平時差異有逐漸變大.

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Influence of the epoxy resin coating on the biofilm on ductile cast iron pipes.

WANG Ruo-wei1, XU Shi-rong1, LUO Zhi-feng2, PENG Hong-xi2, LIU Jing-qing2*, ZHOU Xiaoyan3, XU Jun4, QIU Shang-de3, HE Xiao-fang3

(1.College of Civil Engineering,Hunan University, Changsha 410082, China；2.College of Civil Engineering and Architecture, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China；3.Shaoxing Water Environmental Science Institute Co. Ltd, Shaoxing 321000, China；4.Shaoxing Municipal Water Co., Ltd, Shaoxing 321035, China)., 2019,39(5)：2014~2020

The research was carried out in an actual full-scale, non-circulated experimental platform. The effect of Epoxy Resin coating on biofilm on ductile cast iron pipes was studied by analyzing the physicochemical characteristics and microbial community composition of biofilms. The results revealed that the additional epoxy resin coating, compared with cement-mortar lined ductile cast iron pipes, can reduce the attachment of solids and had a positive impact on the microbial abundance and negative impacts on the community composition of biofilms. The total bacteria were 4.01×104copies/cm2and heterotrophic bacteria were 1.40×10CFU/cm2in the biofilms. Therefore, Cement-mortar lined ductile cast iron pipes with epoxy resin coating were better in practical applications.

drinking water distribution pipe；ductile cast iron pipes；coating；biofilm；microbial community

X17,TU991.36

A

1000-6923(2019)05-2014-07

王若瑋(1995-),女,山西長治人,湖南大學碩士研究生,主要從事供水管網水質安全研究.

2018-10-22

國家自然科學基金資助項目(51678520);水體污染控制與治理國家科技重大專項資助項目(2017X07201004)

*責任作者, 教授, liujingqing@zju.edu.cn