高霖，朱莉，楊澤林，詹曉北*，吳劍榮

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

唾液酸(sialic acid，SA)是一族神經(jīng)氨酸的衍生物，在自然界中廣泛分布，是許多糖蛋白、糖肽和糖脂的基本成分。聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是唾液酸單體以α-2,8或α-2,9鍵連接而成的直鏈同聚物[1]。研究表明PSA參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、神經(jīng)突觸生長(zhǎng)、神經(jīng)分叉、神經(jīng)元導(dǎo)向、突觸形成等功能[2]。PSA水溶性優(yōu)良，黏度低，免疫原性低，生物相容性好，具有生物可降解性[3]。它可以用來作為神經(jīng)再生的生物材料以及一些組織結(jié)構(gòu)工程的支架材料[4]；PSA在降低重金屬離子對(duì)細(xì)胞毒害作用方面也有潛在的應(yīng)用[5]； PSA是目前發(fā)現(xiàn)最好的多肽與蛋白類藥物的可降解控釋劑[6]。PSA的各種生物學(xué)效應(yīng)使其擁有廣泛的生物醫(yī)學(xué)[7]和食品方面[8]的應(yīng)用。

PSA是一種線性聚陰離子結(jié)構(gòu)化合物，含有大量羧基，可以產(chǎn)生很大的水合作用，分子質(zhì)量越大的PSA其水合作用越強(qiáng)，分子排阻體積越大，抗黏附特性越強(qiáng)[9]。作為藥物包埋材料時(shí)，相較于低分子質(zhì)量材料，高分子質(zhì)量材料能包埋更多藥物，具有更長(zhǎng)的半衰期，更有利于藥物在生物體內(nèi)緩慢釋放[10-11]。目前已報(bào)道最高分子質(zhì)量PSA為260 kDa[12]，與已被用于藥物緩釋材料[13-14]或組織材料[15-16]的透明質(zhì)酸的分子質(zhì)量相差較多。獲得高分子質(zhì)量PSA是解決這些問題的基礎(chǔ)，而微生物發(fā)酵法是目前唯一的生產(chǎn)PSA的方法，因此深入挖掘探索產(chǎn)高分子質(zhì)量PSA菌株及其發(fā)酵條件是十分有必要的。本實(shí)驗(yàn)主要通過對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)PSA菌株大腸桿菌K235進(jìn)行ARTP誘變和DES復(fù)合誘變，篩選獲得產(chǎn)高分子質(zhì)量PSA菌株，并在7 L發(fā)酵罐水平上對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，為進(jìn)一步拓寬PSA應(yīng)用提供基礎(chǔ)(圖1)。

圖1 α-2,8鍵連接構(gòu)型聚唾液酸結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of α-2,8 linked polysialic acid

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

EscherichiacoliK235(中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCM208088)，保藏于江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，NaCl 5，酵母粉 3，牛肉膏 2，瓊脂 20，滅菌前pH 7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，NaCl 5，酵母粉 3，牛肉膏 2，滅菌前pH 7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇 40，(NH4)2SO44.94，K2HPO4·3H2O 26.2，胰蛋白胨1.5，MgSO40.9， 滅菌前pH 7.8。

上罐培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇 60，K2HPO4·3H2O 2.5，(NH4)2SO44.94，胰蛋白胨 1.5，MgSO40.9。

鑒別培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇 30，KH2PO41，胰蛋白胨 10，MgSO40.6，瓊脂 20，溴百里酚藍(lán)指示劑[17](20%溴百里酚藍(lán)乙醇溶液)體積分?jǐn)?shù)1%，滅菌前pH 7.8。

1.1.3 主要儀器

ARTP-Ⅱ誘變系統(tǒng)，北京思清源有限公司；3K15冷凍高速離心機(jī)，Sigma；LC-2010A液相色譜儀，島津公司；Enspire多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)(酶標(biāo)儀)，珀金埃爾默有限公司；U-3900型紫外/可見分光光度計(jì)，HITACHI公司；ST210 pH儀，奧豪斯儀器有限公司；Superose-12凝膠柱，美國GE公司；7 L BioFlo115型發(fā)酵罐，Eppendorf公司。

1.1.4 主要試劑

山梨醇：醫(yī)藥級(jí)，阿拉丁試劑有限公司；Dextran右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品(APSC)公司；其他試劑均為分析純，購自上海國藥集團(tuán)。

1.2 復(fù)合誘變

1.2.1 ARTP誘變

甘油管保存菌株劃取單菌落，挑選單菌落接至種子培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12h。將活化后單菌落菌液按4%轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)2～4 h。取一定量菌液4 ℃、10 000 r/min離心5 min， 用等體積無菌生理鹽水(9 g/L NaCl溶液)洗滌2次，制成菌懸液。取10 μL制備好的菌懸液均勻涂在無菌載片上，置于ARTP工作臺(tái)里誘變處理：距離2 mm、通氣量10 slm、功率100 W，分別處理0、15、30、45、60、75、90、120 s。將處理完的載片置于1 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩，稀釋105倍并涂布于含鑒別培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)處理樣分別做個(gè)平行，37 ℃ 下培養(yǎng)48 h，通過平板計(jì)數(shù)計(jì)算致死率。挑選各誘變梯度菌株按方法1.3.2進(jìn)行24孔板培養(yǎng)并測(cè)定分子質(zhì)量，計(jì)算正負(fù)突變率。致死率、正突變率、負(fù)突變率分別按公式(1)、(2)、(3)計(jì)算：

(1)

(2)

(3)

式中，A為未誘變處理平板上菌落數(shù)；L為誘變處理后平板上菌落數(shù)；P為分子質(zhì)量高于未誘變菌株分子質(zhì)量5%的菌落數(shù)；N為分子質(zhì)量低于未誘變菌株分子質(zhì)量5%的菌落數(shù)。

1.2.2 DES誘變

將ARTP誘變菌株制備成菌懸液。取5 mL菌懸液按體積比1%加入DES，37 ℃、150 r/min下分別處理0、10、20、30、40、50、60 min后，加入1 mL無菌250 g/L Na2S2O3溶液終止反應(yīng)。按方法1.2.1進(jìn)行培養(yǎng)并計(jì)算致死率、正負(fù)突變率。

1.3 菌株篩選

1.3.1 初篩

從鑒別培養(yǎng)基平板上挑取變色光圈大且菌落也大的菌株作為初篩菌株并接種至斜面培養(yǎng)基保存。

1.3.2 高通量篩選

將初篩得到的菌株接種于含種子培養(yǎng)基的24孔板(裝液量3 mL/10 mL)中，每株菌做3個(gè)平行，37 ℃、 150 r/min培養(yǎng)12 h。種子液按4%轉(zhuǎn)接到含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板(裝液量3 mL/10 mL)中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。測(cè)定各菌株P(guān)SA分子質(zhì)量。

1.3.3 搖瓶復(fù)篩

將高通量篩選得到的菌株按方法1.2.1培養(yǎng)成種子液。按4%轉(zhuǎn)接至含發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中(裝液量10 mL/50 mL),每株菌做4個(gè)平行，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。測(cè)定各菌株的PSA分子質(zhì)量，以出發(fā)菌株作為對(duì)照，篩選PSA分子質(zhì)量最高菌株。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定

1.4.1 菌體量測(cè)定

取一定量發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后測(cè)定OD600，OD600=1.0相當(dāng)于0.45 g/L菌體干重[12]。

1.4.2 PSA含量測(cè)定

采用間苯二酚-鹽酸法[18]。

1.4.3 PSA分子質(zhì)量測(cè)定

樣品處理：發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，取一定量上清加3倍體積95%乙醇，4 ℃下放置2 h。后在4 ℃、10 000 r/min下離心5 min，取沉淀加水復(fù)溶，4 ℃、12 000 r/min下離心5 min，取上清。

高通量篩選樣品分子質(zhì)量測(cè)定采用端基法[19]。

搖瓶、7 L式發(fā)酵罐發(fā)酵樣品分子質(zhì)量測(cè)定采用高效凝膠過濾色譜(HPGFC)法：色譜柱為Superose-12(1.0 cm×30 cm)凝膠柱，流動(dòng)相0.01 mol/L NaOH溶液，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL， RID檢測(cè)器。標(biāo)曲繪制：已知分子質(zhì)量Dextran作為標(biāo)準(zhǔn)品，以出峰時(shí)間t為橫坐標(biāo)，lgMw為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如公式(4)所示：

lgMW=-0.138 4t+7.703 3

(4)

1.5 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

對(duì)獲得的突變菌株進(jìn)行5次傳代，經(jīng)過搖瓶(裝液量50 mL/500 mL)37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)48 h，測(cè)定其各代的PSA產(chǎn)量、PSA分子質(zhì)量、生物量、發(fā)酵結(jié)束pH，驗(yàn)證菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.6 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化

7 L發(fā)酵罐在7 L發(fā)酵罐上對(duì)獲得的誘變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化最佳產(chǎn)高分子質(zhì)量PSA攪拌轉(zhuǎn)速條件。培養(yǎng)條件為：four-pitched blade impeller型攪拌槳(直徑11.80 cm)，裝液量為4 L，接種量為8%，溫度恒定37 ℃，通氣量為1.2 vvm，采用兩階段pH控制分批補(bǔ)料策略[12]：0～16 h時(shí)pH控制在6.4,16 h后pH控制在7.4，以硫酸銨和山梨醇作為補(bǔ)料流加。測(cè)定發(fā)酵過程中菌體量、PSA產(chǎn)量、PSA分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變結(jié)果

2.1.1 ARTP誘變結(jié)果

E.coliK235 ARTP誘變致死曲線如圖2所示。

圖2 E.coli K235的ARTP誘變致死曲線Fig.2 ARTP lethal rate curve of E.coli K235

由圖2可以看出，在0～30 s時(shí)，照射時(shí)間增加，致死率急劇增加；30～60 s時(shí)，照射時(shí)間增加，致死率緩慢增加；照射60 s后，致死率趨于平緩。當(dāng)照射時(shí)間為45 s時(shí)，致死率達(dá)到77.55%；照射時(shí)間120 s時(shí)，致死率達(dá)到了98%。選取ARTP處理致死率在70%～90%的菌落進(jìn)行培養(yǎng)。正負(fù)突變率結(jié)果如表1。

表1 不同ARTP誘變時(shí)間效果比較Table 1 Evaluation of ARTP mutation

從表1可以看出，ARTP處理60 s時(shí)負(fù)突變率相比于處理45 s時(shí)大幅增加，處理 45 s菌株正突變率更高，所以ARTP誘變時(shí)間選擇45 s。

ARTP誘變處理后，從初篩平板上挑取了360株光圈、菌落較大的菌株進(jìn)行高通量篩選，從中選取了具有較高分子質(zhì)量20株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。ARTP誘變復(fù)篩結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，經(jīng)過搖瓶復(fù)篩，16株菌株發(fā)酵產(chǎn)PSA的分子質(zhì)量提高10%以上，2株菌株(3B21、4B31)PSA分子質(zhì)量提高30%以上。其中，編號(hào)為4B31的菌株發(fā)酵產(chǎn)PSA分子質(zhì)量最高，其PSA分子質(zhì)量為21.2 kDa，較出發(fā)菌株E.coliK235提高了36.84%，其PSA產(chǎn)量為1.71 g/L，較出發(fā)菌株也提高了45.83%。將其命名為E.coliK235 4B31。

圖3 ARTP誘變搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.3 ARTP mutagenesis screening results

2.1.2 DES誘變結(jié)果

以E.coliK235 4B31為出發(fā)菌株，進(jìn)行第二輪DES誘變，致死曲線如圖4。

圖4 E.coli K235 4B31的DES誘變致死曲線Fig.4 DES lethal rate curve of E.coli K235 4B31

從圖4可以看出，DES誘變處理在0～10 min時(shí)，致死率緩慢增加；DES誘變處理10～30 min時(shí)，隨著處理時(shí)間增加致死率急劇增加，處理30 min時(shí)致死率達(dá)到75.82%；DES誘變處理60 min時(shí)致死率達(dá)到了99.2%。

選取致死率在70%～90%的DES處理時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各自的正負(fù)突變率如表2。從表2可以看出，DES處理30 min相較于處理40 min具有更高的正突變率，因此選取30 min為DES誘變的處理時(shí)間。

表2 不同DES誘變時(shí)間效果比較Table 2 Evaluation of DES mutation

DES誘變處理后，從初篩平板上挑取了210株光圈、菌落較大的菌株進(jìn)行高通量篩選，得到10株產(chǎn)PSA分子質(zhì)量較高菌株。對(duì)這10株高通量篩選菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，DES處理后，篩選得到8株發(fā)酵產(chǎn)PSA分子質(zhì)量提高了10%以上菌株，3株菌株(5A23、6E61、6F41)PSA分子質(zhì)量提高了20%。其中，編號(hào)為6E61的誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)物PSA分子質(zhì)量為27.6 kDa，較出發(fā)菌株E.coliK235 4B31提高了30.19%，較初始菌株E.coliK235提高了78.18%；產(chǎn)物PSA含量為1.89 g/L，較初始菌株E.coliK235提高了61.53%。將其命名為E.coliK235 6E61。

圖5 DES誘變搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.5 DES mutagenesis screening results

2.2 菌株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

為檢測(cè)突變菌株E.coliK235 6E61 產(chǎn)PSA的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)了5代，測(cè)定各代發(fā)酵參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 E.coli K235 6E61 的遺傳穩(wěn)定性測(cè)試Table 3 Genetic stability test of E.coli K235 6E61

從表3可以看出，各代菌株發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH值在6.1左右，菌體量在5.27 g/L左右，PSA產(chǎn)量在2.25 g/L左右，PSA分子質(zhì)量在41 kDa左右，各項(xiàng)指標(biāo)均較為穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化

PSA在E.coliK235中合成屬于高耗能過程，因此發(fā)酵產(chǎn)物PSA分子質(zhì)量大小很大程度上受到溶氧水平的影響，通氣量一定時(shí)，高溶氧水平通常由高攪拌速率實(shí)現(xiàn)。PSA為胞外莢膜多糖，由胞內(nèi)酶合成后，通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)(ATP-binding cassette)蛋白轉(zhuǎn)移至胞外，與胞外膜上脂質(zhì)受體結(jié)合[20-21]。攪拌速率過高，胞外莢膜因高剪切力作用加速脫落，不利于長(zhǎng)鏈PSA的形成，因此，合適的攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)高分子質(zhì)量PSA來說至關(guān)重要。

為進(jìn)一步提高誘變菌株E.coliK235 6E61發(fā)酵產(chǎn)物PSA，并探究攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)誘變菌株E.coliK235 6E61發(fā)酵產(chǎn)PSA的影響，在7 L發(fā)酵罐采用恒定單一攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)誘變菌株E.coliK235 6E61進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖6所示。

A-攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體量影響；B-攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PSA產(chǎn)量影響；C-攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PSA分子質(zhì)量影響；D-不同攪拌轉(zhuǎn)速下溶氧水平圖6 不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)誘變菌株E.coli K235 6E61 發(fā)酵生產(chǎn)PSA影響Fig.6 Effect of different agitation speed on PSA production by fermentation of E.coli K235 6E61

由圖6-A可知，攪拌轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵最大菌體量顯著降低，低攪拌轉(zhuǎn)速(250 r/min)時(shí)，菌體量最大為21.6 g/L。在發(fā)酵前期(0～12 h)時(shí)，高攪拌轉(zhuǎn)速伴隨著高剪切力和高溶氧，而高剪切力和高溶氧不利于菌體的生長(zhǎng)，所以低攪拌轉(zhuǎn)速下菌體量更高，與劉金龍等[22]報(bào)道相一致。由圖6-B和圖6-C可知，攪拌轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵產(chǎn)物PSA產(chǎn)量增加、分子質(zhì)量降低。在高攪拌轉(zhuǎn)速(450 r/min)時(shí)，PSA產(chǎn)量最大為5.75 g/L；低攪拌轉(zhuǎn)速(250 r/min)時(shí)，PSA分子質(zhì)量最大為390.4 kDa。發(fā)酵8 h開始檢測(cè)到低濃度SA，發(fā)酵12 h后才檢測(cè)到低分子質(zhì)量PSA。有研究[23-24]表明在大腸桿菌合成α-2,8結(jié)構(gòu)PSA時(shí)，唾液酸轉(zhuǎn)移酶不能從頭開始合成PSA，需要低聚唾液酸或內(nèi)源性受體，因而PSA合成具有滯后性。發(fā)酵中期(12～20 h)時(shí)，唾液酸含量較低，前體物質(zhì)大量積累。BORK等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)，增加底物濃度(活化后SA)后，唾液酸轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，而增加合成SA前體物質(zhì)N-乙酰甘露糖胺濃度后，在細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。由此推測(cè)，此時(shí)胞內(nèi)唾液酸轉(zhuǎn)移酶大量表達(dá)，而唾液酸轉(zhuǎn)移酶是合成PSA的唯一限速酶，因而其后PSA分子質(zhì)量顯著增加。PSA發(fā)酵為高密度發(fā)酵，在發(fā)酵中期(12 ～20 h)時(shí)，發(fā)酵液的密度和黏度均較大，高攪拌轉(zhuǎn)速帶來更高效的傳氣傳質(zhì)，更有利于發(fā)酵中間產(chǎn)物和能量物質(zhì)的積累，因而高攪拌轉(zhuǎn)速下PSA產(chǎn)量更高。在發(fā)酵后期(20 h后)，發(fā)酵產(chǎn)物PSA產(chǎn)量和分子質(zhì)量快速增加，此時(shí)高攪拌轉(zhuǎn)速下產(chǎn)生了過剩的溶氧，如圖6-D所示，過剩的溶氧在發(fā)酵液作用下產(chǎn)生一系列的對(duì)菌體具有毒害作用的超氧化物和羥基自由基[27-28]，加劇莢膜多糖的分泌，此外高剪切力加速了剝落細(xì)胞表面莢膜。所以在發(fā)酵后期，攪拌轉(zhuǎn)速增加，PSA分子質(zhì)量顯著降低。低攪拌轉(zhuǎn)速(250 r/min)時(shí)，PSA分子質(zhì)量最大為390.4 kDa。

同時(shí)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量和高分子質(zhì)量是PSA發(fā)酵的目標(biāo)，由上述結(jié)果可知，在不同發(fā)酵階段選擇不同的攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌株發(fā)酵十分重要。因此，提出了三階段攪拌轉(zhuǎn)速分批發(fā)酵：如圖7-A所示，發(fā)酵前期(0～12 h)攪拌轉(zhuǎn)速恒定為250 r/min，為防止轉(zhuǎn)速變化幅度太大影響菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵中期(12～20 h)將攪拌轉(zhuǎn)速穩(wěn)定在400 r/min，發(fā)酵后期(20 h后)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)回250 r/min，結(jié)果如圖7-B所示。發(fā)酵結(jié)束后，誘變菌株E.coliK235 6E61最大菌體量為19.4 g/L，發(fā)酵產(chǎn)物PSA產(chǎn)量為5.82 g/L，PSA分子質(zhì)量為430.5 kDa，PSA分子質(zhì)量較恒定單一攪拌轉(zhuǎn)速的最大分子質(zhì)量提高了10.27%。

A-發(fā)酵過程參數(shù)；B-發(fā)酵結(jié)果圖7 三階段攪拌轉(zhuǎn)速控制誘變菌株E.coli K235 6E61發(fā)酵過程曲線Fig.7 Time curve of PSA fermentation with E.coli K235 6E61 with three-stage agitation speed controlling strategy

3 結(jié)論

通過ARTP-DES復(fù)合誘變，獲得產(chǎn)高分子質(zhì)量PSA誘變菌株E.coliK235 6E61，其在50 mL搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)物PSA分子質(zhì)量為27.6 kDa，較初始菌株E.coliK235提高了78.18%，PSA產(chǎn)量為1.89 g/L，較初始菌株提高了61.53%。誘變菌株E.coliK235 6E61通過了遺傳穩(wěn)定性測(cè)試，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。在7 L發(fā)酵罐對(duì)誘變菌株E.coliK235 6E61進(jìn)行攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)化，采用三階段攪拌轉(zhuǎn)速分批發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物PSA產(chǎn)量為5.82 g/L，最大分子質(zhì)量為430.5 kDa，為目前微生物發(fā)酵產(chǎn)PSA的最高分子質(zhì)量。

4 討論

目前，通過誘變方式獲得產(chǎn)高分子質(zhì)量多糖研究相對(duì)較少，主要集中在高分子質(zhì)量透明質(zhì)酸研究上。湯棟等[29]通過H2O2脅迫、紫外輻射和DES對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變獲得了透明質(zhì)酸酶缺失菌株，使得透明質(zhì)酸分子質(zhì)量提高了57.8%。陳奕涵等[30]通過亞硝基甲基脲和氮離子注入對(duì)菌株復(fù)合誘變使得透明質(zhì)酸分子質(zhì)量提高了137.3%。本研究主要采用新型的ARTP誘變與DES誘變兩種方式，這也是這兩種誘變方法首次應(yīng)用于產(chǎn)PSA菌株E.coliK235的篩選，得到一株產(chǎn)高分子質(zhì)量PSA目的菌株，其PSA產(chǎn)量也有較大的提高，同時(shí)也證明了通過誘變方式獲得產(chǎn)高分子質(zhì)量多糖菌株具有可行性。