馬婕馨，蔡程山,2，高蘇，方曄晨，趙國柱*

1(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，北京，100015)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北蟲草、北冬蟲夏草等，是蟲草屬的模式種[1]，其食用與藥用保健功能已被廣泛關(guān)注。蛹蟲草具有抗菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等功效，富含蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、蟲草超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等成分[2-6]。研究表明蛹蟲草在某些活性成分上，甚至要高于冬蟲夏草[7-9]，并且已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)模化人工培育[10]而常被認為是野生冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)的主要替代品[11-12]。因此，人工培育蛹蟲草及發(fā)酵蟲草菌篩選藥用保健活性成分，成為蟲草研究的重要方向。

SOD是一種生物活性蛋白質(zhì)，可通過對細胞內(nèi)超氧化物自由基的清除，幫助人體延緩衰老、對抗炎癥、抵御疾病，防御由自由基過量造成的氧毒性[13]，在臨床[14-16]、食品[17-19]等領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的SOD多從動物血液里提取，需要飼養(yǎng)動物，技術(shù)和成本要求較高。另外，血液來源的SOD用在人體上存在著排他性、交叉感染等安全性風(fēng)險，在一定程度上限制了開發(fā)應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草可以產(chǎn)生高活性的SOD[20]，其菌絲體的SOD酶活力甚至高于子座的SOD酶活力[21-22]。目前市場上的蛹蟲草多以食用子實體(子座)為主要形式[23]，SOD的吸收、轉(zhuǎn)化效率及功能難以有效發(fā)揮，以工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)方式提取SOD將成為今后發(fā)展的重要方向，并且蛹蟲草液體培養(yǎng)還具有耗時短、易操作等優(yōu)點。本研究通過篩選蛹蟲草SOD高活力菌株，采用液體培養(yǎng)的方式優(yōu)化其培養(yǎng)條件，為蛹蟲草SOD發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

蛹蟲草菌株YCC-B為市場購買商品化蛹蟲草，經(jīng)分離純化獲得菌株；YCC-C為收集商品栽培菌株；YCC-W由中國科學(xué)院真菌學(xué)國家重點實驗室提供；YCC-Y為采自河北秦皇島的野生蛹蟲草分離菌株。

1.1.2 試劑與儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、蛋白胨、蔗糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、HCl、磷酸、無水乙醇、EDTA、牛血清白蛋白、VB1、考馬斯亮藍G-250、Tris-HCl、ddH2O、鄰苯三酚，上述試劑均為分析純：購自北京易秀博谷生物科技有限公司。

752型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TG16A-WS離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9626A鼓風(fēng)數(shù)顯干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HZC-250全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；OMEGA真菌DNA小量提取試劑盒(D3390-01)，北京華誠興達科技有限公司。

1.2 菌株鑒定復(fù)核

按照真菌DNA提取試劑盒的操作步驟，提取4種來源的蛹蟲草全基因組，進行ITSrDNA基因PCR擴增，通用引物：ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[24]；PCR條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物電泳檢測后，送生工生物工程股份有限公司(北京測序部)測序，所得序列校對后，在NCBI中進行BLAST比對分析。

1.3 菌株發(fā)酵

1.3.1 菌株活化

將存于4 ℃冰箱的4種蛹蟲草菌株分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基，于21 ℃生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)至菌絲布滿培養(yǎng)基。

1.3.2 種子液制備

用接種針從活化培養(yǎng)基中挑取約1cm2的菌塊，接種于種子液培養(yǎng)基(蔗糖2%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%)，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84h，條件為裝液量100 mL/250 mL三角瓶、26 ℃、130 r/min[25]。

1.3.3 液體培養(yǎng)

將種子液接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖2%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%、維生素B10.002%)，全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 SOD高活性菌株篩選

1.4.1 生物量測定

將液體發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)紗布過濾，蒸餾水沖洗數(shù)次后，將獲得的菌絲體于40 ℃烘干至恒重，測定菌絲體干重，以衡量其生物量大小。

1.4.2 粗酶液的提取

參考杜琳等[26]的方法，對菌絲體中的SOD進行粗提。稱取0.1 g菌絲體粉末，加入1 mL PBS緩沖液超聲提取10 min，4 500×g離心10 min，取上清液，在沉淀中加入1 mL PBS緩沖液再次離心，合并兩次上清液，添加固體硫酸銨至質(zhì)量濃度為340 g/L，9 000×g離心3 min留沉淀。加入2 mL PBS緩沖液溶液，獲得粗酶液。

1.4.3 SOD清除超氧陰離子能力(清除率)和酶活力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[27]測定SOD總酶活力，在試管中依次加入緩沖液和雙蒸水，與25 ℃預(yù)熱的鄰苯三酚(對照組用10 mmol/L HCl代替)混合，搖勻后迅速加入比色皿中，在波長420 nm處每0.5 min測定1次吸光度A0，共測4 min，計算自氧化組溶液吸光度值隨時間的變化率ΔA0。樣品測定：加入1 mL 樣品液，相應(yīng)減少同體積雙蒸水，其余試劑添加同自氧化組，測定加入樣品后的自氧化速率ΔA1。SOD酶活性單位定義為每分鐘每毫升反應(yīng)液鄰苯三酚自氧化被抑制50%所需酶量為1個活力單位。按照公式(1)、(2)，計算清除率和酶活力:

(1)

(2)

式中，ΔA0-對照管吸光度(自氧化速率)；ΔA1-測定管吸光度(加入酶后的氧化速率)；n-稀釋倍數(shù)；V0-定義體積，1 mL；Va-反應(yīng)總體積；Ve-加入酶體積。

1.4.4 SOD粗酶液蛋白含量及比活力測定

采用考馬斯亮藍法[28]繪制蛋白標準曲線并測定樣品蛋白含量。編號的標準蛋白試管后加入試劑，搖勻后放置2 min，在595 nm測定吸光度，以牛血清蛋白含量(μg)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。另取1支試管，準確加入0.1 mL樣品提取液，再加入0.9 mL蒸餾水。與5 mL考馬斯亮藍G-250試劑混勻后，放置2 min，以標準曲線0號試管作空白對照。在595 nm測定吸光度，并在標準曲線上查得相應(yīng)蛋白含量。根據(jù)公式(3)，計算出樣品對應(yīng)的比活力值。

(3)

式中,酶活力，U/mL；蛋白含量，mg/mL。

1.5 液體培養(yǎng)條件正交實驗設(shè)計

1.5.1 單因素優(yōu)化

以接種量、裝液量、培養(yǎng)基pH、溫度和培養(yǎng)天數(shù)為單因素，按照表1依次進行優(yōu)化，每個因素5個水平，每個水平重復(fù)3次，以生物量、SOD活性為測定指標，并采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，不同處理組間比較采用One-way ANOVA檢驗，確定最佳單因素水平。

1.5.2 正交實驗設(shè)計

借助“正交實驗設(shè)計助手Ⅱ”軟件，以接種量、裝液量和培養(yǎng)基pH為因變量，展開3因素3水平的正交實驗，分別以生物量、SOD活性為測定指標，確定最佳培養(yǎng)條件組合。

表1 液體培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化實驗設(shè)計Table 1 Single factor optimization experiment design for liquid culture conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)生物公司測序后，所得序列于NCBI中BLAST序列比對后，復(fù)核4株菌株均為蛹蟲草。

2.2 蛋白含量標準曲線

根據(jù)1.4.4方法，經(jīng)計算得標準方程為y=0.005 2x+0.026 8，其中x為牛血清白蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL)，y為595 nm處的吸光度值，R2=0.991 7，回歸性較好，具有可信度。

2.3 SOD高產(chǎn)菌株篩選結(jié)果

按照1.4的方法，得到Y(jié)CC-B、YCC-C、YCC-W和YCC-Y 4個菌株的生物量、SOD活力數(shù)值如圖1。

圖1 不同菌株的SOD活力及生物量Fig.1 SOD activity and biomass of different strains

YCC-W菌株雖然生物量值較小，但其SOD活力(清除率、酶活力、比活力)較顯著優(yōu)于其他3個菌株(P<0.05)，因此YCC-W為SOD高活力菌株，以此展開后續(xù)研究。

2.4 菌株YCC-W單因素實驗結(jié)果

2.4.1 接種量組

分別以1%、3%、5%、7%、10%的接種量將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，其余條件(溫度26 ℃，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，pH自然，培養(yǎng)時間2 d，轉(zhuǎn)速150 r/min)均一致，并分別設(shè)置3組平行實驗。由圖2可以得出，生物量隨接種量增加而增加，當接種量為10%時生物量最大；接種量為3%時酶活力與比活力的值最佳，且差異顯著(P<0.05)。因?qū)嶒炛饕許OD活性為測定指標，所以后續(xù)單因素實驗選取的接種量為3%。

圖2 菌株YCC-W在不同接種量下的SOD活性Fig.2 SOD activity of strain YCC-W in different inoculation levels

2.4.2 裝液量組

以60、80、100、120、140 mL的不同裝液量將液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，其他條件(接種量3%，溫度26 ℃，pH自然，培養(yǎng)時間2 d，轉(zhuǎn)速150 r/min)均一致，并設(shè)置3組平行實驗。由圖3得，裝液量為120 mL時生物量高于其他幾組，而裝液量為100 mL時酶活力與比活力的值最佳，且差異顯著(P<0.05)，后續(xù)單因素實驗選取的裝液量為100 mL/250 mL三角瓶。

圖3 菌株YCC-W在不同裝液量下的SOD活性Fig.3 SOD activity of strain YCC-W in different liquid medium

2.4.3 pH值組

分別將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值調(diào)成4、5、6、7、8，其余條件(接種量3%，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，溫度26 ℃，培養(yǎng)時間2 d，轉(zhuǎn)速150 r/min)均一致，分別設(shè)置3組平行實驗。由圖4可以看出，pH為8時生物量最大，pH為5時酶活力與比活力值最佳，且差異顯著(P<0.05)，后續(xù)單因素實驗選取的發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為5。

圖4 菌株YCC-W在不同pH下SOD活性Fig.4 SOD activity of strain YCC-W in different pH

2.4.4 培養(yǎng)天數(shù)組

以1、2、3、4、5 d不同時間進行培養(yǎng)，其余條件(接種量3%，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，pH 5，溫度26 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min)均一致，并分別設(shè)置3組平行實驗。由圖5可以看出，培養(yǎng)時間為4 d時生物量最大，培養(yǎng)時間為2 d時酶活力與比活力的值最佳(P<0.05)。但在培養(yǎng)至4 d時，菌絲體出現(xiàn)裂解，致使發(fā)酵液渾濁，因此后續(xù)單因素實驗選取的培養(yǎng)時間為2 d。

圖5 菌株YCC-W在不同培養(yǎng)時間SOD活性Fig.5 SOD activity of strain YCC-W in different culture days

2.4.5 培養(yǎng)溫度組

以22、24、26、28、30℃不同溫度進行培養(yǎng)，其他條件(接種量3%，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，pH 5，培養(yǎng)時間2 d，轉(zhuǎn)速150 r/min)均一致，分別設(shè)置3組平行實驗。由圖6可知，溫度為24 ℃ 時酶活力與比活力的值最佳，且差異顯著(P<0.05)，而26 ℃時生物量最大。因此24 ℃較適合作為維持SOD高活性的培養(yǎng)溫度。

圖6 菌株YCC-W在不同溫度下SOD活性Fig.6 SOD activity of strain YCC-W in different temperatures

2.5 菌株YCC-W的3因素3水平正交實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析

經(jīng)過對單因素實驗數(shù)據(jù)的總結(jié)與分析，選取pH(因素A)、裝液量(因素B)、接種量(因素C)這3個因素，以L9(34)正交表進行3因素3水平的正交實驗設(shè)計，利用“正交設(shè)計助手Ⅱ”軟件分別以SOD清除超氧陰離子能力(清除率)、酶活力、比活力和生物量為自變量進行分析，得到直觀分析表(表2)和方差分析表(表3)。

表2 菌株YCC-W的3因素3水平正交實驗及直觀分析Table 2 Orthogonal experimental visual analysis table of YCC-W

表3 菌株YCC-W的SOD清除率方差分析Table 3 SOD clearance rate analysis of YCC-W

注：α=0.05時顯著差異水平，*表示有顯著差異。

從表2、表3可以看出，3個因素對SOD的清除率影響從大到小為pH>裝液量>接種量，其中pH的改變對清除率有顯著影響，pH為5.5時清除超氧陰離子效果最好；裝液量的改變對清除率也有顯著的影響，100 mL和110 mL三角瓶(250 mL)裝液量的均值相等，考慮到經(jīng)濟成本，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶時最佳；接種量的改變則對清除率無顯著影響，4%的接種量最佳。3個因素對比活力的影響從大到小為裝液量> pH >接種量，但它們的改變對比活力均無顯著影響。3個因素對生物量的影響從大到小為接種量> pH >裝液量，而它們的改變對生物量同樣均無顯著影響。綜合以上數(shù)據(jù)，得出蛹蟲草菌絲體高SOD活性的培養(yǎng)條件為pH 5.5、裝液量100 mL/250 mL三角瓶和接種量4%。SOD清除率最高可提高41.17%，可達到54.84%；SOD酶活力可提高42.04%，達到19.74 U/mL；比活力可提高44.23%，可達到為56.34 U/mg。

3 結(jié)論與討論

對4種來源的蛹蟲草菌株進行復(fù)核，經(jīng)初步篩選，得出YCC-W菌株為高活性SOD菌株。單因素優(yōu)化YCC-W菌株菌絲體SOD活性表明，當以生物量為測定指標時，接種量10%、裝液量120 mL/250 mL三角瓶、pH 8、培養(yǎng)時間4 d、溫度24 ℃為最佳，組間差異顯著(P<0.05)；而以SOD活性為測定指標時，接種量3%、裝液量100 mL/250 mL三角瓶、pH 5、培養(yǎng)時間2 d、溫度24 ℃為最佳，組間差異顯著(P<0.05)。在單因素實驗基礎(chǔ)上，以液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH、裝液量和接種量為因素，展開3因素3水平正交實驗，確定了蛹蟲草菌絲體高SOD活性的培養(yǎng)條件為pH 5.5、裝液量100 mL/250 mL三角瓶和接種量4%。

本研究中，當分別以菌絲體干重和活性成分SOD為測定指標時，5個單因素的最佳數(shù)值存在一定差異，說明在培養(yǎng)過程中菌體生物量與SOD的活性并不完全同步，在實際發(fā)酵生產(chǎn)中，不能只注重培養(yǎng)物的產(chǎn)量，更要重點關(guān)注特定活性成分的產(chǎn)生及其功效和品質(zhì)。研究同時發(fā)現(xiàn)，SOD活性并不隨生物量的改變而改變，二者似乎不具有線性關(guān)系。正交實驗及方差分析，發(fā)現(xiàn)pH的改變對SOD活力的變化影響較大，說明蛹蟲草菌絲體中的SOD對pH較敏感，高于或低于最適pH時，其活性基團的解離狀態(tài)可能會發(fā)生改變，影響了酶和底物的結(jié)合力，造成SOD活力下降。

目前關(guān)于蛹蟲草的優(yōu)化培養(yǎng)研究，多注重對培養(yǎng)基成分的改變而忽視了培養(yǎng)條件(接種量、裝液量、pH、培養(yǎng)時間、溫度等)的影響。蛹蟲草在培養(yǎng)發(fā)酵過程中，由于菌株、實驗條件、培養(yǎng)方式、測定方法差異，其產(chǎn)生的活性化學(xué)成分種類、含量及藥理作用可能會不同[29]。XIONG等[30]研究表明，用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體時，以及用不同基質(zhì)培養(yǎng)子實體時，其轉(zhuǎn)錄表達譜都存在差異。賀佳[13]通過實驗測得蛹蟲草子實體中SOD粗酶液比活力為39.0 U/mg；李萬芳等[20]測定北蟲草中SOD粗酶液酶活力為 823.57 U/g，平均比活為 36.22 U/mg；劉曉紅等[31]比較鮮蛹蟲草與干蛹蟲草抗氧化活性和活性物質(zhì)差異發(fā)現(xiàn)，鮮蛹蟲草子實體的SOD粗酶液比活力為50.3 U/mg，干蛹蟲草為37.6 U/mg。本研究通過優(yōu)化，得到的蛹蟲草菌絲體SOD粗酶液比活力可達56.34 U/mg，與其他研究中子實體SOD粗酶液比活力相近甚至要高，與王奇等[21]和梁迪思等[22]的研究一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)2 d時SOD活性最高，這與子實體培養(yǎng)相比(一般需要50～60 d)大大縮短了收獲SOD的時間。因此，在進一步蛹蟲草規(guī)模化SOD發(fā)酵生產(chǎn)之前，對培養(yǎng)條件的摸索和優(yōu)化是十分必要的。本研究在實驗條件下完成，取得了較好的結(jié)果，進一步將結(jié)合SOD純化實驗和發(fā)酵罐擴大實驗，完善規(guī)?；a(chǎn)蛹蟲草SOD的各種條件，為今后蛹蟲草SOD的進一步研究和規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。