蔡萍瑤，王佳，陶曉奇*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué)，國(guó)家級(jí)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶，400715)

氨基糖苷類藥物(aminoglycosides, AGs)是指由氨基糖與氨基環(huán)醇經(jīng)糖苷鍵連接而成的苷類抗生素，可通過不可逆地結(jié)合核糖體誘導(dǎo)細(xì)菌合成錯(cuò)誤蛋白并阻礙其釋放，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷甚至細(xì)胞死亡，從而有效對(duì)抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌[1-2]。此外，AGs還可作為動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)劑[3]。因抗菌能力強(qiáng)、價(jià)格便宜，AGs成為使用最廣泛的抗生素[4]。

AGs具有耳毒性、腎毒性等副作用，常殘留于牛、豬、禽肌肉、牛奶、蜂蜜等動(dòng)物源性食品中[5-6]。若長(zhǎng)期食用AGs殘留超標(biāo)的動(dòng)物源性食品，易引發(fā)神經(jīng)肌肉阻滯、皮疹、發(fā)熱、血管性水腫、剝脫性皮炎，甚至過敏性休克等癥狀[7]。因此，歐盟委員會(huì)對(duì)牛奶和肌肉中的一些AGs設(shè)定了最大殘留限量(maximum residue limits, MRLs)：卡那霉素為100 μg/kg(牛、豬、禽肌肉)、150 μg/kg(牛奶)，鏈霉素為200 μg/kg(牛奶)，新霉素為1 500 μg/kg(牛奶)，慶大霉素為50 μg/kg(牛、豬肌肉)等[8]；我國(guó)農(nóng)業(yè)部也對(duì)部分AGs殘留進(jìn)行限量：鏈霉素為200 μg/kg(牛奶)，新霉素為500 μg/kg(牛奶，牛、羊、豬肌肉)，慶大霉素為100 μg/kg(牛、豬肌肉)等[9]。

傳統(tǒng)檢測(cè)AGs的方法雖各具優(yōu)勢(shì)，但仍有所欠缺：理化方法如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[10]、毛細(xì)管電泳串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等均需要較高的分析條件，前處理相對(duì)復(fù)雜，且成本高，不適合基層的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；免疫分析法影響因素多，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[12]；微生物法的靈敏度低，存在交叉反應(yīng)[13]。而新興的生物傳感器法兼具低成本、快速、靈敏、高特異性等優(yōu)勢(shì)，簡(jiǎn)化了分析過程，并且設(shè)備易微型化，便于攜帶，利于實(shí)時(shí)檢測(cè)。本文梳理了近幾年基于生物傳感器檢測(cè)AGs殘留的研究，旨在為完善獸藥殘留檢測(cè)體系提供有益參考。

1 生物分子識(shí)別元件

生物傳感器主要由生物分子識(shí)別元件與信號(hào)轉(zhuǎn)換器兩部分組成。生物分子識(shí)別元件，是具有分子識(shí)別能力的生物活性物質(zhì)，決定了生物傳感器的選擇性。根據(jù)生物分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、?xì)胞傳感器、免疫傳感器、適體傳感器、分子印跡聚合物傳感器等。近五年檢測(cè)AGs的研究主要集中在免疫傳感器、適體傳感器和分子印跡聚合物傳感器，它們的生物受體分別為固定化抗體、核酸適配體、分子印跡聚合物，三者的優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

1.1 抗體

抗體(antibody, Ab)是目前最常用的識(shí)別元件，其技術(shù)領(lǐng)域大致可分為多克隆抗體、單克隆抗體及基因工程抗體3個(gè)階段[22]。

表1 生物分子識(shí)別元件的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of biomolecular recognition components

多克隆抗體由一系列免疫細(xì)胞產(chǎn)生，可在不同表位結(jié)合抗原，具有不同的結(jié)合親和力；單克隆抗體由單個(gè)親本細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)相同抗原的相同表位具有親和力。FERGUSON等[23]以多克隆抗體為生物分子識(shí)別元件，建立了檢測(cè)鏈霉素和二氫鏈霉素殘留的免疫生物傳感器，檢測(cè)限為：牛奶30 μg/kg，蜂蜜15 μg/kg，腎50 μg/kg和肌肉70 μg/kg。CHEN等[24]以單克隆抗體為生物分子識(shí)別元件，并基于磁弛豫開關(guān)測(cè)定和生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)，構(gòu)建了一種用于檢測(cè)牛奶中卡那霉素的免疫傳感器，檢測(cè)限為0.1 ng /mL，分析時(shí)間為45 min。

但動(dòng)物源性抗體存在動(dòng)物福利問題，且出于提高可靠性與減少批次間差異的考慮，111名學(xué)者和科學(xué)家呼吁國(guó)際轉(zhuǎn)向使用重組抗體[25]。LI等[26]制備了抗慶大霉素的重組抗體：利用噬菌體展示技術(shù)篩選出2種特異性的雞源單鏈抗體，并通過間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定證明該單鏈抗體具有高特異性的優(yōu)點(diǎn)。此外，與常規(guī)抗體相比，仿生生物受體具有在體外制備的優(yōu)點(diǎn)，避免了對(duì)動(dòng)物的作用，并且可以產(chǎn)生用于識(shí)別非免疫原性分子的工具[15]。

1.2 核酸適配體

核酸適配體(aptamer, Apt)是從體外通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)篩選出對(duì)目標(biāo)靶物質(zhì)有高度親和力的單鏈寡核苷酸序列，分子質(zhì)量約6～40 kDa，解離常數(shù)通常在納摩爾至皮摩爾范圍內(nèi)。XING等[27]驗(yàn)證了卡那霉素結(jié)合DNA適體(5′-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3′)自身可形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)；并基于G-四鏈體適體的熒光嵌入劑置換測(cè)定，以噻唑橙(thiazole orange，TO)作為熒光探針，建立了一種卡那霉素檢測(cè)方法，檢測(cè)限降低至34.37 μg/L，線性范圍為0.06～11.65 mg/L，牛奶樣品中的回收率達(dá)80.1%～98.0%。

HA等[28]篩選出新的卡那霉素結(jié)合適體，通過適體截短和分子對(duì)接研究將其結(jié)構(gòu)優(yōu)化至提供高結(jié)合親和力與特異性所需的最小序列KBA 3-1，并構(gòu)建了基于還原氧化石墨烯(reduction of graphene oxide, RGO)的熒光適體傳感器，檢測(cè)限低至11.65 ng/L。其傳感原理：以RGO為猝滅劑，以熒光染料5'FAM標(biāo)記的KBA 3-1通過π-π堆積相互作用吸附在RGO的表面上，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移，RGO有效地猝滅了FAM的熒光。樣品中的卡那霉素將優(yōu)先與KBA 3-1結(jié)合，形成絡(luò)合物，從而誘使KBA 3-1從RGO表面解吸，F(xiàn)AM標(biāo)記的KBA 3-1熒光增強(qiáng)。

1.3 分子印跡聚合物

分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)是指采用分子印跡技術(shù)合成的有機(jī)高分子聚合材料，擁有與模板分子空間結(jié)構(gòu)匹配的空腔和功能基團(tuán)互補(bǔ)的識(shí)別位點(diǎn)，其識(shí)別機(jī)制類似于抗原-抗體相互作用，對(duì)目標(biāo)分子具有選擇專一性。LIAN等[29]基于殼聚糖-銀納米粒子和石墨烯-多壁碳納米管復(fù)合材料裝飾金電極，開發(fā)了一種用于檢測(cè)牛奶和蜂蜜樣品中新霉素殘留的MIP傳感器。以新霉素為模板，以吡咯為單體，采用電聚合法合成具有高結(jié)合親和力和選擇性的MIP。優(yōu)化條件后，該傳感器檢測(cè)限為5.44 μg/L，線性范圍為5～6 μg/L，具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2 納米技術(shù)

納米技術(shù)的發(fā)展奠定了生物傳感器微型化的基礎(chǔ)，使生物傳感器的多路復(fù)用和可移植性成為可能。它包括納米材料和微流體[30]。以納米材料為識(shí)別或示蹤探針構(gòu)建的生物傳感器，可有效提高生物分子識(shí)別能力、加速信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大；基于微流體控制系統(tǒng)的設(shè)備，可簡(jiǎn)單的自動(dòng)化處理，減少試樣消耗，縮短檢測(cè)時(shí)間，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.1 納米材料

納米材料通常指三維空間中至少有一維橫向尺寸達(dá)1～100 nm的單質(zhì)、化合物、混合物，具有小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、極高的反應(yīng)活性、非凡的電子轉(zhuǎn)移能力和高比表面積等物化特性，并表現(xiàn)出一系列獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、磁力學(xué)及催化性能，被廣泛用作識(shí)別元件的載體和放大檢測(cè)信號(hào)的探針[31-32]。表2歸納了常用納米材料的優(yōu)點(diǎn)。

表2 不同納米材料的優(yōu)點(diǎn)Table 2 Advantages of different nanomaterials

2.2 微流體

基于硅、玻璃或其他聚合物的微流體系統(tǒng)因小型化、集成化和自動(dòng)化而備受關(guān)注[36]。與傳統(tǒng)的體外分析設(shè)備相比，紙質(zhì)微流體設(shè)備簡(jiǎn)單、成本較低[37]。它不僅可以克服傳統(tǒng)方法諸如消耗大量試劑、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的局限性問題，且滿足實(shí)時(shí)檢測(cè)的需求[31]。便攜式側(cè)向流動(dòng)分析(portable lateral flow analysis, LFA)作為一種紙基傳感器被廣泛使用，但仍有半定量檢測(cè)和低靈敏度的不足之處。SHI等[38]將其與表面增強(qiáng)拉曼散射檢測(cè)巧妙結(jié)合，建立了一種同時(shí)檢測(cè)新霉素(neomycin, NEO)以及包括諾氟沙星(norfloxacin, NOR)在內(nèi)的8種喹諾酮類抗生素的多檢測(cè)體系，NEO和NOR的檢測(cè)限(limit of detection, LOD)分別為0.37、0.55 pg/mL，遠(yuǎn)低于單獨(dú)使用LFA的視覺LOD(10、200 ng/mL)。

3 生物傳感器法

盡管檢測(cè)AGs殘留的生物傳感器層出不窮，但最常用的換能器仍是電化學(xué)、光學(xué)和基于質(zhì)量的傳感器。根據(jù)是否利用標(biāo)記物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，可將生物傳感器進(jìn)一步分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩大類。由于標(biāo)記物需要長(zhǎng)時(shí)間且復(fù)雜的制備過程，以及存在標(biāo)記后影響生物識(shí)別元件選擇性的風(fēng)險(xiǎn)，非標(biāo)記型生物傳感器更受歡迎[36]。表3歸納了近五年檢測(cè)AGs殘留的生物傳感器法。

表3 動(dòng)物性食品中氨基糖苷類藥物的生物傳感器檢測(cè)方法Table 3 Biosensor detection method for aminoglycosides in edible animal foods

3.1 電化學(xué)生物傳感器

3.1.1 標(biāo)記型電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感器主要通過固定于電極表面的生物識(shí)別元件識(shí)別待測(cè)目標(biāo)物并與其作用，引起電極表面結(jié)構(gòu)的變化，從而改變電化學(xué)信號(hào)，如電流或電勢(shì)。近年來，電化學(xué)適配體傳感器逐步成為研究熱點(diǎn)。由于適配體本身不具備電活性，且親和性可能受電化學(xué)調(diào)制的影響，因此許多電化學(xué)適配體傳感器通過采用標(biāo)記功能性物質(zhì)的方式獲得定量檢測(cè)信號(hào)[32]。

LI等[39]以中孔碳-金納米顆粒和碳納米纖維修飾絲網(wǎng)印刷碳電極(screen printing carbon electrode, SPCE)，以CdS和PbS分別標(biāo)記卡那霉素(kanamycin, KAN)和鏈霉素(streptomycin, STR)的適體，并將互補(bǔ)的適體鏈固定在SPCE表面上；在KAN和STR存在的情況下，適體與靶標(biāo)優(yōu)先結(jié)合，導(dǎo)致電流峰變化，以此構(gòu)建定量檢測(cè)加標(biāo)牛奶中KAN和STR的電化學(xué)適體傳感器，LOD分別低至50.86、26.17 ng/L，線性范圍為0.1～1000 nmol/L。該傳感器具有一次性使用和便攜式的特點(diǎn)，可滿足真實(shí)牛奶樣品中KAN和STR的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)要求。

3.1.2 非標(biāo)記型電化學(xué)傳感器

非標(biāo)記型電化學(xué)傳感器大多通過檢測(cè)生物分子識(shí)別前后法拉第阻抗的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)。除了常用的納米材料，導(dǎo)電聚合物因官能團(tuán)可確保生物分子在電極上的穩(wěn)定性且能增加結(jié)合位點(diǎn)的表面積，也可用于修飾電極。DAPR等[42]建立了首個(gè)無標(biāo)記全聚合物微流體電化學(xué)適體傳感器。該傳感器是一次性使用設(shè)備，以Topas?為基底，采用雙層導(dǎo)電聚合物PEDOT: TsO和PEDOT- OH: TsO作為電極材料，使用電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)法，可測(cè)定牛奶中質(zhì)量濃度為0.03～349.40 μg/L的氨芐青霉素和5.83 μg/L～582.58 mg/L的卡那霉素，具有可靠性、低樣品消耗、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠和快速響應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。

3.2 光學(xué)生物傳感器

3.2.1 熒光適體傳感器

熒光因具有高選擇性、高靈敏度、多功能性的優(yōu)勢(shì)，成為生物傳感器中最常用的換能器信號(hào)[48]。熒光適體傳感器根據(jù)測(cè)定形式的不同可分為直接、競(jìng)爭(zhēng)、夾心、置換免疫測(cè)定四類；其傳感原理主要基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，常采用納米材料作為能量受體、供體、猝滅劑、輔助載體和接頭，采用有機(jī)熒光染料作標(biāo)記物。LIAO等[43]建立了一種熒光猝滅適體傳感器。以熒光素FAM標(biāo)記KAN適體，并將其通過非共價(jià)吸附固定于熒光猝滅劑碳納米管(carbon nanotube, CNT)上，同時(shí)加入互補(bǔ)鏈(complementary DNA, cDNA)，由于適體和cDNA的雜交，熒光不被CNT淬滅。在KAN存在的情況下，KAN競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適體，導(dǎo)致cDNA的解離，從而使熒光淬滅。優(yōu)化條件后，LOD為0.23 μg/L，線性范圍為0.58～29.13 μg/L，平均回收率98.5%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.81%～4.67%。

LIU等[44]以磁性納米顆粒作為適體的載體，以熒光染料FAM、ROX分別標(biāo)記土霉素和KAN適體的cDNA，采用直接競(jìng)爭(zhēng)模型，可同時(shí)定量檢測(cè)豬肉、牛奶和蜂蜜樣品中的土霉素和KAN，測(cè)得線性范圍為1～50 ng/mL，分析時(shí)間為80 min， LOD分別為0.85、0.92 ng/mL，回收率為76.5%～94.7%、77.8%～93.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10.0%。適體磁捕獲試驗(yàn)的主要優(yōu)點(diǎn)有：操作簡(jiǎn)單，可縮短孵育時(shí)間；增加生物分子固定的表面積；提高識(shí)別探針和分析物的結(jié)合效率；提高靈敏度。

ZHANG等[37]基于紙基微流體技術(shù)建立了熒光適體傳感器，并成功應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)重金屬離子Hg2 +、Ag+以及NEO殘留。該傳感器以氧化石墨烯(graphene oxide，GO)為猝滅劑，以熒光染料Cy5為適配體標(biāo)記物，采用兩種檢測(cè)方式：初始熒光被部分淬滅，若新霉素存在，將與適配體結(jié)合形成雙鏈體，與GO表面之間通過酰胺偶聯(lián)結(jié)合得更加緊密，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低;若樣品中含有Hg2 +、Ag+，使得適配體從GO表面釋放，最終導(dǎo)致熒光恢復(fù)。經(jīng)優(yōu)化條件后，Hg2+、Ag+和NEO檢測(cè)限分別為2.43、5.07、110 μg/L，平均回收率為87.5%～116%(Hg2+)、91%～126%(Ag+)、95%～101%(NEO)。這是一種低成本、易制造、高靈敏、可多重檢測(cè)的生物傳感器。

3.2.2 液晶適體傳感器

液晶是一種介于固態(tài)與液態(tài)的中間態(tài)物質(zhì)，兼具流動(dòng)性與雙折射性。液晶傳感器通過生物分子識(shí)別，使得液晶分子的有序垂直排列被擾亂，從而導(dǎo)致偏光圖像顏色與亮度的變化，以此定性檢測(cè)目標(biāo)分析物[49]。WANG等[45]建立了以適配體作為識(shí)別元件的液晶傳感器，用以現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)動(dòng)物性食品中殘留的KAN。適體與KAN相互作用，將形成穩(wěn)定的G-四鏈體，從而破壞液晶分子的定向排列，利用交叉偏振器，可觀測(cè)到從粉紅色到綠色的顏色變化，檢測(cè)限達(dá)0.58 μg/L。 該傳感器的檢測(cè)結(jié)果肉眼可見，無需儀器讀數(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、無需標(biāo)記、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在半定量檢測(cè)的不足。

3.3 重力生物傳感器

3.3.1 壓電晶體免疫傳感器

壓電晶體免疫傳感器的基本原理是抗原與抗體相互作用，導(dǎo)致電極表面質(zhì)量變化，由于石英晶體的壓電效應(yīng)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為振蕩電路輸出電信號(hào)的頻率變化。MISHRA等[46]將鏈霉素的單克隆抗體通過硫醇化抗體的自組裝單層固定于金晶表面，建立了基于流動(dòng)注射分析-電化學(xué)石英晶體納米天平技術(shù)檢測(cè)牛奶樣品中STR殘留的超靈敏生物傳感器。該傳感器檢測(cè)限為0.3 μg/L，回收率達(dá)98%～99.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.351%，具有良好的重現(xiàn)性；且快速響應(yīng)，可在17 min內(nèi)完成分析。這些結(jié)果充分體現(xiàn)該傳感器的高靈敏度、可靠性與可重復(fù)性。

3.3.2 懸臂式適體傳感器

懸臂式生物傳感器同樣是常見的重力生物傳感器之一。通過吸附分子，引起懸臂梁的撓曲以及振動(dòng)頻率的改變，從而將分子相互作用轉(zhuǎn)換為機(jī)械運(yùn)動(dòng)。它分為2種工作模式：靜態(tài)模式與動(dòng)態(tài)模式。在靜態(tài)模式中，可通過測(cè)量靜態(tài)彎曲或撓度，實(shí)現(xiàn)定量分析；動(dòng)態(tài)模式下，則通過測(cè)量諸如共振頻率等動(dòng)態(tài)特性實(shí)現(xiàn)。值得一提的是，動(dòng)態(tài)模式下的懸臂梁傳感器受介質(zhì)黏性的影響，而在靜態(tài)模式下則不然，故在檢測(cè)液體樣品時(shí)，通常優(yōu)選靜態(tài)模式。BAI等[47]建立了一種懸臂陣列適體傳感器，用以檢測(cè)牛奶的KAN。以適體作為受體分子，對(duì)傳感懸臂進(jìn)行功能化；利用6-巰 基-1-己醇修飾參考懸臂，以消除環(huán)境干擾因素。KAN與適體間的相互作用將引起懸臂表面的應(yīng)力變化，使得傳感懸臂和參考懸臂對(duì)之間發(fā)生差異偏轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示，表面應(yīng)力變化與KAN濃度在58.26 mg/L～5.83 g/L呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995；在信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限為29.13 μg/mL。同時(shí)，該傳感器對(duì)其他抗生素如新霉素，核糖霉素和氯霉素也具有良好選擇性。

4 展望

獸藥殘留仍是當(dāng)今重要的動(dòng)物源性食品安全問題之一，建立完善的獸藥殘留檢測(cè)體系之于人體健康有著非凡的意義。盡管生物傳感器法作為一門多學(xué)科交叉的高新技術(shù)，以其靈敏度高、響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)單、低成本以及便于攜帶等優(yōu)勢(shì)，在眾多檢測(cè)AGs殘留的分析方法中脫穎而出，但它在該領(lǐng)域仍存在一些挑戰(zhàn)和不足：(1)電化學(xué)傳感器雖具有高靈敏度，易于小型化和低成本等優(yōu)點(diǎn)，但需要電極改性；(2)熒光傳感器常需要信號(hào)探針標(biāo)記，這可能改變生物識(shí)別分子活性結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)型，從而影響靶結(jié)合親和力；(3)懸臂傳感器雖無需標(biāo)記，但它們的靈敏度和可重復(fù)性仍然有很大的提升空間。

大量研究表明，開發(fā)更有效的生物傳感器主要取決于3個(gè)因素：生物分子識(shí)別元件，傳感器和納米技術(shù)。雖然抗體是目前最常用的生物識(shí)別元件，但更多選擇性好、穩(wěn)定性高、親和力高、易于修飾、制備簡(jiǎn)單的新型受體正在不斷被研發(fā)，尤其是重組抗體、核酸適配體和分子印跡聚合物有著良好的前景。此外，金屬納米顆粒、量子點(diǎn)、磁性納米粒子、碳納米材料等功能化納米材料被廣泛用作標(biāo)記支持物和信號(hào)增強(qiáng)劑，以提高靈敏度和線性范圍；通過增加表面相互作用，降低檢測(cè)限。納米技術(shù)有助于減少微流體回路，從而縮短檢測(cè)時(shí)間，使生物傳感器朝著高度集成化、自動(dòng)化、簡(jiǎn)單化、小型化的方向發(fā)展。

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，新型標(biāo)記材料、新型抗體、新型檢測(cè)模式的深入研究，建立新型便攜化、高通量、高靈敏、多殘留快速檢測(cè)的生物傳感器檢測(cè)體系指日可待。