苗向碩 吳 偉 吳曉娟

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004)

米糠是稻谷籽粒的精華所在，雖然只占稻谷質(zhì)量的6%～8%，卻集中了64%的稻谷營(yíng)養(yǎng)素和90%以上的人體必需元素。米糠含有11%～17%的米糠蛋白(Rice bran protein，RBP)，是一種重要的植物蛋白資源。RBP過(guò)敏性低，其氨基酸組成與FAO/WHO推薦的氨基酸組成的理想模式非常接近，生物效價(jià)高，是一種公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，可廣泛應(yīng)用于包括嬰幼兒食品在內(nèi)的各類(lèi)食品中[1]。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶兒茶素中的主要成分，約占兒茶素的50%～80%，EGCG因其高含量和優(yōu)異的生物活性而被認(rèn)為是茶多酚中最重要的成分[2-3]。EGCG具有良好的抗氧化性，其淬滅自由基的能力比維生素C和維生素E還要強(qiáng)，由于EGCG安全無(wú)毒且抗氧化作用很強(qiáng)，使得食品在較長(zhǎng)時(shí)間保持其原有的色澤和營(yíng)養(yǎng)水平，有利于延長(zhǎng)食品保質(zhì)期、改善食物品質(zhì)。因而廣泛應(yīng)用于焙烤食品、糕點(diǎn)、乳制品、肉制品及水產(chǎn)品等[4]。

EGCG在食品體系中會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和功能特性，因此EGCG和各類(lèi)食品蛋白質(zhì)相互作用成為研究熱點(diǎn)。目前已有報(bào)道主要集中于EGCG與動(dòng)物蛋白(牛乳鐵蛋白[5]、牛血清蛋白[6]和β-乳球蛋白[7])相互作用的研究，鮮有關(guān)于EGCG與植物蛋白相互作用的研究報(bào)道。近年來(lái)富含RBP和EGCG的食品在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[4, 8, 9]，但缺乏RBP與EGCG相互作用機(jī)制方面的研究，本研究采用熒光光譜、紫外-可見(jiàn)光譜研究RBP與EGCG相互作用，為開(kāi)發(fā)富含RBP和EGCG食品及調(diào)控此類(lèi)食品品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠、EGCG(純度≥98%), 其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機(jī)、FD5-4冷凍干燥機(jī)、F4600熒光分光光度計(jì)、Blue Star紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 RBP提取

參考吳偉等[10]方法提取RBP。新鮮米糠除雜過(guò)40目篩，隨后與正己烷以1 ∶5(g ∶mL)料液比混合脫脂，重復(fù)脫脂五次。將脫脂米糠和去離子水以1 ∶10(g ∶mL)混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下攪拌提取4 h，隨后以8 000 r/min在4 ℃下離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.0，靜置20 min后在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min得到RBP沉淀，水洗RBP沉淀3次后將沉淀分散于5倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.0，采用截留分子量3 500 u的透析袋透析24 h脫鹽，最后冷凍干燥得到RBP。

1.3.2 熒光光譜測(cè)定

取2 mL濃度為1.5mg/mL的RBP溶液加入10 mL試管中，隨后加入梯度體積2 mg/mL的EGCG溶液，再用pH 7.0的0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液定容至3 mL，使得最終RBP濃度為1 mg/mL，并得到質(zhì)量比為(1 ∶0，1 ∶0.02，1 ∶0.04，1 ∶0.06，1 ∶0.08，1 ∶0.10，1 ∶0.12，1 ∶0.14，1 ∶0.16，1 ∶0.18，RBP ∶EGCG)的RBP-EGCG混合液，充分混勻后，分別在17、27、37 ℃的恒溫水浴鍋中保溫5 min。在激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5、10 nm ，掃描速度1 200 nm/min的條件下測(cè)定RBP熒光光譜。

1.3.3 同步熒光光譜測(cè)定

樣品制備同1.3.2，測(cè)定溫度為300 K，分別固定 Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，激發(fā)和發(fā)射的寬度分別為5、10 nm，掃描速度1 200 nm/min，掃描250～450 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜。

1.3.4 三維熒光光譜測(cè)定

樣品制備同1.3.2，起始激發(fā)波長(zhǎng)為 200 nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置在200～350 nm的范圍內(nèi)，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置在200～500 nm的范圍內(nèi)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5、10 nm，掃描速度1 200 nm/min，每隔10 nm記錄1次，共掃描 31 次。

1.3.5 紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)定

取3 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的RBP溶液于石英比色池中，掃描250～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。掃描完畢后，將不同質(zhì)量濃度的EGCG-RBP混合液充分混合后加入到比色池中，放置5 min后掃描吸收光譜，測(cè)定溫度為300 K。以相同質(zhì)量濃度的RBP溶液作空白，記錄RBP溶液的紫外-可見(jiàn)吸收差譜。

1.3.6 EGCG與RBP結(jié)合距離的測(cè)定

EGCG溶液紫外光譜的測(cè)定步驟：移取3 mL質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL的EGCG溶液于石英比色池中，紫外吸收光譜的波長(zhǎng)掃描范圍為 300～500 nm。RBP溶液熒光光譜的測(cè)定步驟：移取3 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的RBP溶液于石英比色池中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度分別為5、10 nm，掃描速度1 200 nm/min，測(cè)定溫度為298 K。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG與RBP相互作用的熒光光譜

2.1.1 EGCG濃度對(duì)RBP內(nèi)源熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光反映RBP中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基微環(huán)境的變化，進(jìn)而能夠表征EGCG對(duì)RBP結(jié)構(gòu)的影響[4]。由于EGCG熒光發(fā)射信號(hào)非常弱，對(duì)RBP熒光信號(hào)的干擾可以忽略，因而本研究中不考慮“內(nèi)濾光效應(yīng)”的干擾問(wèn)題[11]。如圖1所示，隨著EGCG濃度的增加，一方面RBP的熒光強(qiáng)度明顯下降，說(shuō)明EGCG和RBP之間存在較強(qiáng)的相互作用；另一方面RBP最大發(fā)射峰從358.4 nm逐漸紅移至 377.2 nm，表明隨著EGCG濃度的增加，RBP中芳香族氨基酸殘基微環(huán)境由疏水性逐漸向親水性轉(zhuǎn)變，說(shuō)明RBP空間結(jié)構(gòu)逐漸處于更加延伸的狀態(tài)[12]。

注：RBP質(zhì)量濃度為1 mg/mL；1～10 分別表示EGCG質(zhì)量濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL。圖2、圖4同。

2.1.2 EGCG濃度對(duì)RBP同步熒光光譜的影響

同步熒光光譜可表征EGCG對(duì)RBP中酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環(huán)境的變化，Δλ=15 nm 時(shí)僅顯示酪氨酸殘基的光譜特征，Δλ=60 nm時(shí)僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光[5]。由圖2可以看出，隨著EGCG濃度的增加，RBP色氨酸和酪氨酸殘基的同步熒光強(qiáng)度降低，且色氨酸殘基的熒光淬滅程度更大，表明EGCG對(duì)RBP的熒光淬滅主要作用于色氨酸殘基。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，酪氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)為368.4 nm，隨著EGCG濃度的增加沒(méi)有發(fā)生明顯變化；當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，隨著EGCG濃度的增加，色氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)由288 nm逐漸紅移至292.2 nm，表明EGCG和RBP作用時(shí)主要影響的是色氨酸殘基微環(huán)境。

圖2 不同濃度EGCG對(duì)RBP同步熒光光譜的影響

2.1.3 EGCG濃度對(duì)RBP三維熒光光譜的影響

三維熒光光譜中的峰位、指紋信息和熒光強(qiáng)度可以科學(xué)、可靠地反映蛋白質(zhì)的組成分布和特征構(gòu)象變化。圖3中可以看出，峰A表示瑞利散射峰(Ex=Em)，峰B是二級(jí)散射峰(Em=2Ex)，峰1代表RBP的色氨酸殘基產(chǎn)生的特征峰，峰2代表多肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)的特征峰，這些都是三維熒光光譜中的典型峰[13]。如圖3所示，隨著EGCG濃度的增加，峰1的顏色變淺，輪廓線更細(xì)，等高線變得稀疏，說(shuō)明EGCG可使得RBP熒光強(qiáng)度顯著降低，表明EGCG與RBP之間發(fā)生了強(qiáng)烈的相互作用。加入EGCG后峰2等高線變得密集，區(qū)域面積發(fā)生變化，表明EGCG-RBP復(fù)合物的形成使得蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架發(fā)生變化，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。由表1可知，色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，表明色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性逐漸降低，極性增加，與同步熒光光譜的結(jié)果一致。EGCG使得峰A和峰B的熒光強(qiáng)度降低的原因可能是EGCG與RBP結(jié)合后，破壞了RBP表面的保護(hù)水層，RBP變得更加分散，引起RBP粒徑變小，光散射作用減弱，從而使這兩個(gè)散射峰的熒光強(qiáng)度減弱，這說(shuō)明EGCG與RBP之間形成了不發(fā)光基態(tài)復(fù)合物。

圖3 未添加EGCG(a)和EGCG添加濃度為0.08 mg/mL(b)的RBP的等高線圖

表1 EGCG-RBP體系三維熒光光譜的特征參數(shù)

2.2 EGCG與RBP相互作用的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

由圖4可知，隨著EGCG濃度的增加，RBP吸光度逐漸升高，出現(xiàn)明顯的增色效應(yīng)，同時(shí)，最大吸收峰波長(zhǎng)發(fā)生紅移，由280 nm增加至302 nm，表明EGCG與RBP相互作用引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，形成了基態(tài)復(fù)合物。結(jié)合前面熒光光譜結(jié)果推測(cè)，EGCG-RBP復(fù)合物最大吸收峰波長(zhǎng)的紅移，可能是由于EGCG使RBP中色氨基酸殘基發(fā)生位移或被結(jié)合，形成新的共軛體系，使π-π*躍遷能量增大[14]。

圖4 不同濃度EGCG對(duì)RBP紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響

2.3 EGCG與RBP相互作用機(jī)制

2.3.1 熒光淬滅機(jī)制

由熒光光譜可知，EGCG對(duì)RBP熒光具有明顯的猝滅作用，通過(guò)對(duì)其淬滅機(jī)制分析，可以更準(zhǔn)確地判斷EGCG與RBP是否形成了復(fù)合物[11]。熒光淬滅機(jī)制可分為動(dòng)態(tài)淬滅、靜態(tài)淬滅和動(dòng)態(tài)靜態(tài)混合淬滅3種。動(dòng)態(tài)猝滅是由熒光團(tuán)和猝滅劑之間的碰撞引起的，隨著溫度升高，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)會(huì)增大。靜態(tài)猝滅是由于熒光團(tuán)和猝滅劑之間形成了基態(tài)復(fù)合物，由于復(fù)合物的穩(wěn)定性通常會(huì)隨著溫度升高而下降，因而其猝滅常數(shù)則會(huì)隨溫度升高而降低[11]。因此，可利用Stern-Volmer方程[7]求解不同溫度下EGGC和RBP相互作用的淬滅常數(shù)，從而判斷其淬滅機(jī)制。

Stern-Volmer方程如下：

(1)

式中：F0是未加入EGCG時(shí)的熒光強(qiáng)度；F是加入EGCG時(shí)的熒光強(qiáng)度；[Q]為EGCG濃度/mol/L；Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)[L/(mol·s)]；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/L/mol；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體的壽命(生物大分子的平均壽命約為10-8s)。

根據(jù)式(1)，以 [Q]為橫坐標(biāo)作圖，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)，得到不同溫度下 EGCG 對(duì)RBP猝滅的Stern-Volmer 曲線(圖5)。由圖5直線的斜率和τ0可得到不同溫度條件下EGCG與RBP相互作用的Ksv和Kq，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)相關(guān)系數(shù)≤0.98時(shí)，表明在這一系列濃度下可能存在動(dòng)態(tài)和靜態(tài)混合的淬滅機(jī)制[15]。如圖5所示，Stern-Volmer曲線在低EGCG濃度時(shí)線性相關(guān)，高EGCG濃度時(shí)逐漸偏向y軸，說(shuō)明同時(shí)存在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)淬滅[6]，并且Ksv隨著溫度的升高而有所增大，說(shuō)明EGCG淬滅RBP內(nèi)源熒光的機(jī)制存在因分子間碰撞導(dǎo)致的熒光淬滅，即動(dòng)態(tài)淬滅。同時(shí)，由于不同溫度曲線下的Kq遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)[約為2×1010L/(mol·s)]，表明EGCG 對(duì)RBP的猝滅機(jī)制也存在因分子間生成不發(fā)光基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)淬滅，結(jié)合其熒光光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜出現(xiàn)的變化分析，靜態(tài)淬滅在EGGC對(duì)RBP的熒光淬滅過(guò)程中起主導(dǎo)作用[16]。相關(guān)研究同樣發(fā)現(xiàn)EGCG與β-乳球蛋白[17]和鰱魚(yú)肌球蛋白[18]相互作用時(shí)同時(shí)存在靜態(tài)熒光淬滅和動(dòng)態(tài)熒光淬滅。

圖5 不同溫度條件下EGCG對(duì)RBP熒光猝滅的Stern-Volmer方程曲線圖

表2 EGCG-RBP復(fù)合物的熒光淬滅常數(shù)及相關(guān)系數(shù)

2.3.2 EGCG-RBP復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及作用力

當(dāng)小分子獨(dú)立地與大分子上的位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)可以通過(guò)以下等式確定[19]：

(2)

式中：F0表示沒(méi)有猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；F表示有猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；KA為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度。

圖6顯示log [(F0-F)/F]對(duì)log [Q]的雙對(duì)數(shù)曲線，由擬合曲線的斜率和截距得到n和KA(表3)。從表3中可以看出，結(jié)合常數(shù)KA的數(shù)量級(jí)達(dá)到106，而相關(guān)研究表明EGCG與牛血清蛋白[6]、β-乳球蛋白[7]和鰱魚(yú)肌球蛋白[18]相互作用的KA數(shù)量級(jí)分別為104、104和105，小于本文EGCG與RBP的相互作用KA數(shù)量級(jí)，表明EGCG與RBP之間的結(jié)合力較強(qiáng)，這可能是由于RBP與牛血清蛋白、β-乳球蛋白和鰱魚(yú)肌球蛋白結(jié)構(gòu)差異引起的。KA值隨著溫度的升高而增大，也表明EGCG與RBP相互作用時(shí)存在動(dòng)態(tài)淬滅。在不同溫度條件下n均約等于1，表明EGCG與RBP有1個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，且n值隨溫度的變化不明顯，同樣表明EGCG與RBP發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用，類(lèi)似現(xiàn)象在茶多酚與大豆分離蛋白[11]、EGCG與β-乳球蛋白[17]、EGCG與鰱魚(yú)肌球蛋白[18]相互作用的研究中也有報(bào)道。

圖6 不同溫度條件下EGCG熒光猝滅RBP的雙對(duì)數(shù)曲線

表3 EGCG-RBP復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及相關(guān)系數(shù)

小分子和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力主要包括疏水相互作用、靜電引力、范德華力、氫鍵等，熱力學(xué)參數(shù)ΔH和ΔS是確認(rèn)作用力的主要依據(jù)。當(dāng)ΔH<0、ΔS<0時(shí)，分子間的作用力主要是氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH>0、ΔS>0時(shí)，分子間的作用力主要是疏水相互作用；當(dāng)ΔH<0、ΔS>0時(shí)，分子間的作用力主要是靜電引力；當(dāng)ΔH>0、ΔS<0時(shí)，分子間的作用力主要是疏水相互作用和靜電引力[7]?？捎蒝an’t Hoff方程[7]判定EGCG與RBP之間的作用力類(lèi)型。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

式中：R為氣體常數(shù)8.314 J/(K·mol)；T為實(shí)驗(yàn)的溫度；KA為在相應(yīng)的溫度(290、300 K和310 K)下的結(jié)合常數(shù)。計(jì)算結(jié)果如表3所示。

以lnKA對(duì)1/T作圖，ΔH和ΔS值分別從曲線的斜率和截距計(jì)算。由表4可知，ΔG<0，說(shuō)明EGCG與RBP的結(jié)合可以自發(fā)進(jìn)行。該反應(yīng)的ΔH>0，表明EGCG與RBP之間的相互作用為吸熱反應(yīng)，升溫有利于反應(yīng)的進(jìn)行，這與結(jié)合常數(shù)KA隨著溫度的升高而逐漸升高相吻合。ΔH>0、ΔS>0說(shuō)明EGCG 與RBP之間的作用力主要為疏水相互作用。

表4 不同溫度下EGCG與RBP相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.3.3 EGCG與RBP的能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離

根據(jù)F?ster’s偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[7]，蛋白質(zhì)和小分子配體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移應(yīng)該滿(mǎn)足以下條件: ①蛋白質(zhì)能產(chǎn)生熒光；②小分子配體的紫外光譜和蛋白的熒光發(fā)射光譜發(fā)生重疊；③給體和受體的結(jié)合距離小于7 nm。綜合EGCG與RBP的熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光譜，由式(5)～式(7)可計(jì)算EGCG與RBP的重疊積分J、能量轉(zhuǎn)移效率E、結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0[16]。

(5)

(6)

(7)

式中：F(λ)為蛋白在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；F和F0分別表示有和無(wú)猝滅劑時(shí)蛋白的熒光強(qiáng)度；ε(λ)則為小分子配體在波長(zhǎng)λ處的摩爾消光系數(shù)；J為蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射光譜與配體的吸收光譜之間的光譜重疊積分；R0是指能量轉(zhuǎn)移效率E=50% 時(shí)的臨界距離；r為結(jié)合的配體與蛋白質(zhì)之間的距離；K2為偶極空間取向因子(取值 2 /3)；N為介質(zhì)的折射指數(shù)(取值 1.336)；Φ為給體的光量子效率(取值0.118)。

由圖7根據(jù)式(5)計(jì)算得J=3.984 8×10-17cm3·L/mol，E=0.767 1，R0=0.976 3 nm，r=0.800 4 nm。結(jié)合距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于7 nm，而且結(jié)合距離符合0.5R0

圖7 EGCG紫外吸收光譜和RBP熒光發(fā)射光譜重疊圖

2.3.4 EGCG與RBP結(jié)合率的預(yù)測(cè)

EGCG-RBP結(jié)合率是EGCG與RBP結(jié)合的量占EGCG總濃度的百分比，它是反應(yīng)EGCG與RBP相互作用的重要參數(shù)之一。當(dāng)EGCG和蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)， 根據(jù)結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近1，可以建立EGCG與RBP結(jié)合率的理論模型。結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合率(Y)之間的關(guān)系可以通過(guò)式(8)描述[13]:

(8)

式中:Y是結(jié)合率；KA是不同溫度下的結(jié)合常數(shù)；X是EGCG與RBP的濃度比；P是RBP濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用式(8)分別計(jì)算了不同溫度下的不同濃度的EGCG的RBP結(jié)合率(圖8)。

圖8 不同溫度條件下EGCG與RBP的結(jié)合率

由圖8可知，EGCG 的RBP結(jié)合率表現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性，EGCG與RBP結(jié)合率隨著EGCG濃度的增大而減小，溫度變對(duì)兩者的結(jié)合率幾乎不產(chǎn)生影響。圖8中還完整描述了EGCG濃度與RBP濃度動(dòng)態(tài)變化時(shí)兩者之間結(jié)合率的全程規(guī)律，溫度290、300、310 K時(shí)的曲線方程為：

(9)

(10)

(11)

因此，可以通過(guò)測(cè)定RBP和EGCG濃度，由式(9)～式(11)計(jì)算其結(jié)合率，EGCG與RBP結(jié)合率可能對(duì)RBP消化性質(zhì)產(chǎn)生影響[20]。

3 結(jié)論

采用熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光譜法研究了EGCG與RBP之間的相互作用，內(nèi)源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光譜均證實(shí)，EGCG與RBP之間存在較強(qiáng)的相互作用，形成了不發(fā)光的基態(tài)化合物，并且EGCG與RBP相互作用時(shí)，主要影響的是色氨酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)EGCG與RBP的相互作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG引起的RBP熒光淬滅現(xiàn)象是動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅共同作用的結(jié)果，但以靜態(tài)淬滅為主。EGCG與RBP的結(jié)合常數(shù)KA的數(shù)量級(jí)達(dá)到106，表明EGCG與RBP之間的結(jié)合力較強(qiáng)。EGCG 與RBP反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔH和ΔS均大于0，說(shuō)明兩者之間的作用力主要為疏水相互作用。同時(shí)，EGCG與RBP之間存在能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合距離r非常小，也表明兩者之間具有較強(qiáng)的相互作用。最后，本文還建立了EGCG與RBP結(jié)合率的理論模型，發(fā)現(xiàn)EGCG與RBP結(jié)合率隨著EGCG濃度的增大而減小，溫度變化對(duì)兩者的結(jié)合率幾乎不產(chǎn)生影響。