張 珊 鞏衛(wèi)康 張 娜 李春華

（北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124）

人 分 泌 型 磷 脂 酶 A2-ⅠⅠA （secretory phospholipase A2group ⅠⅠA，sPLA2-ⅠⅠA）是一種脂解酶，在細(xì)胞脂代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用［1］。sPLA2-ⅠⅠA 通過催化甘油磷脂sn-2 位酯鍵水解，產(chǎn)生眾多信號(hào)介質(zhì)前體，參與許多炎癥性疾病的發(fā)生，如哮喘、關(guān)節(jié)炎和癌癥等［2］。研究sPLA2-ⅠⅠA的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)和功能之間的關(guān)系可更好地理解其相關(guān)疾病的分子機(jī)制。

到目前為止，有16 種亞型的sPLA2從蛇、人、豬以及植物等生物中純化出來(lái)。它們的結(jié)構(gòu)具有6對(duì)以上二硫鍵和保守的催化二聯(lián)體His/Asp 及鈣結(jié)合 環(huán)（Xxx-Cys-Gly-Xxx-Gly-Gly）。 大 部 分 的sPLA2具有相似的折疊結(jié)構(gòu)：3個(gè)α螺旋（α-helix）、2 個(gè)β 折疊（β-sheet）和1 個(gè)保守的Ca2+結(jié)合環(huán)（loop2）（圖1）。在哺乳動(dòng)物中研究最多的sPLA2是人ⅠⅠA型的sPLA2（sPLA2-ⅠⅠA），該型酶含有7對(duì)二硫鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，還具有防御細(xì)菌感染和殺菌的能力［3］。sPLA2-ⅠⅠA 催化循環(huán)包括4 個(gè)步驟：a. 酶通過底物結(jié)合區(qū)與膜結(jié)合；b.從膜上提取單個(gè)磷脂分子到酶的結(jié)合口袋；c.水解磷脂的sn-2 位酯鍵；d. 釋放水解產(chǎn)物［4］。酶與底物結(jié)合是催化循環(huán)中重要的環(huán)節(jié)，其中膜作為變構(gòu)劑，它的結(jié)合使酶從關(guān)閉構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榇蜷_構(gòu)象，促進(jìn)酶結(jié)合磷脂分子而發(fā)生催化反應(yīng)［4］。因此，sPLA2-ⅠⅠA 的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)以及別構(gòu)過程一直是人們研究的熱點(diǎn)。

Fig.1 Structure of sPLA2(PDB ID:3u8b)

2015 年Mouchlis 等［4］應(yīng) 用 分 子 動(dòng) 力 學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬方法研究了不同類型sPLA2酶結(jié)合口袋的功能差異，并對(duì)其催化循環(huán)提出了新的見解。2020年Manukyan［5］用MD模擬方法研究了人類sPLA2在有無(wú)膜環(huán)境下的構(gòu)象變化。眾所周知，MD模擬可以在原子水平探測(cè)生物分子的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，但是它非常耗時(shí)，很難對(duì)蛋白質(zhì)大尺度的功能性運(yùn)動(dòng)進(jìn)行采樣分析。針對(duì)該問題，研究人員提出了一些粗?；哪Ｐ?，其中彈性網(wǎng)絡(luò)模型（elastic network model，ENM）是研究蛋白質(zhì)功能性運(yùn)動(dòng)最為有效的方法之一。兩種常用的ENM是高斯網(wǎng)絡(luò)模型（Gaussian network model，GNM）［6］和 各 向 異 性 網(wǎng) 絡(luò) 模 型（anisotropic network model，ANM）［7］。結(jié) 合ENM，Atilgan等［8］提出了微擾響應(yīng)掃描（perturbation-response scanning，PRS）方法來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)殘基對(duì)外界微擾的響應(yīng)程度，該方法已被廣泛應(yīng)用于識(shí)別蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)控中潛在的別構(gòu)位點(diǎn)［9］。另外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)（protein structure network，PSN）方法也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊和關(guān)鍵位點(diǎn)預(yù)測(cè)的研究。

本研究使用基于結(jié)構(gòu)的模型和方法，包括ENM、PRS和PSN分析了人sPLA2-ⅠⅠA型結(jié)構(gòu)的共享和特異性和動(dòng)力學(xué)與其功能的關(guān)系，并識(shí)別了關(guān)鍵殘基，加深了對(duì)酶催化機(jī)制的理解。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)集的建立

從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載來(lái)自人分泌型磷脂酶（sPLA2）ⅠⅠA 型的31 個(gè)X 射線（X-ray）衍射晶體結(jié)構(gòu)作為研究對(duì)象，其PDB ⅠD分別為：1ayp-A，1ayp-B，1ayp-C，1ayp-D， 1ayp-E，1ayp-F，1db4-A，1db5-A，1dcy-A，1j1a-A，1j1a-B，1kqu-A，1kvo-A，1kvo-B，1kvo-C，1kvo-D，1kvo-E，1kvo-F，1n28-A，1n28-B，1n29-A，1pod-A，1poe-A，1poe-B，3u8b-A，3u8d-A，3u8d-B，3u8h-A，3u8h-B，5g3n-A，5g3n-B。

1.2 彈性網(wǎng)絡(luò)模型

彈性網(wǎng)絡(luò)模型（ENM）將蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化為粗粒化的彈性網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)殘基簡(jiǎn)化為網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)節(jié)點(diǎn)，用Cα原子表示；如果兩個(gè)Cα原子間的距離小于某一截?cái)喟霃?，則認(rèn)為它們之間存在相互作用，用倔強(qiáng)系數(shù)相同的彈簧相連。本工作選取7.0 ?為截?cái)喟霃健＿@樣，該彈性網(wǎng)絡(luò)的總勢(shì)能為：

其中，γ是彈簧的彈性系數(shù)，ΔR（3N維的列向量）代表N個(gè)Cα原子偏離平衡位置的位移，E是單位矩陣，?為矩陣的直積，Γ為N×N階的Kirchhoff 矩陣，其元素為：

其中，Rij是第i個(gè)和第j個(gè)Cα原子之間的距離，rc為截?cái)喟霃?。每個(gè)殘基的均方漲落以及不同殘基間漲落的交叉相關(guān)性分別表示為：

其中kB為Boltzmann常數(shù)，T為絕對(duì)溫度。

GNM 模型可以提供殘基運(yùn)動(dòng)的幅度，但不包括方向信息，而ANM 模型可以提供該信息。在ANM 中，選取14.0 ? 為截?cái)喟霃?，網(wǎng)絡(luò)的總勢(shì)能為：

其中，Rij和Rij0分別為節(jié)點(diǎn)i和j之間的瞬時(shí)距離以及處于平衡位置時(shí)的距離。蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)模式由一個(gè)Hessian 矩陣H決定，它的元素是大小為3×3 的子矩陣。子矩陣的元素hij為體系勢(shì)能函數(shù)（5）對(duì)位置的二階偏導(dǎo)數(shù)，當(dāng)i≠j時(shí)，hij為：

當(dāng)i=j時(shí)，hij為：

在ANM中，殘基的均方漲落以及殘基間漲落的交叉相關(guān)性為：

歸一化的交叉相關(guān)性為：

交叉相關(guān)性的取值范圍為-1到1，正值表示殘基的運(yùn)動(dòng)方向相同，負(fù)值表示它們的運(yùn)動(dòng)方向相反。該值的絕對(duì)值越大表示兩個(gè)殘基間的運(yùn)動(dòng)相關(guān)性越強(qiáng)。

1.3 微擾響應(yīng)掃描模型

微擾響應(yīng)掃描（PRS）［8］是基于線性響應(yīng)理論（linear response theory，LRT）［10］發(fā) 展 的 模 型。PRS可以計(jì)算擾動(dòng)某個(gè)殘基時(shí)所有殘基的響應(yīng)，從而來(lái)推斷蛋白質(zhì)的變構(gòu)特性。由胡克定律F=HΔR，可以計(jì)算在受到外力擾動(dòng)時(shí)所有殘基位置 的 改 變 量ΔR，其 中H是ANM 中3N×3N的Hessian 矩陣（截?cái)喟霃饺詾?4.0 ?）。在PRS 中，每次對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)節(jié)點(diǎn)施加外力，觀測(cè)其他所有殘基的響應(yīng)。以對(duì)殘基i施加外力為例：

得到的響應(yīng)為：

其中，ΔRi是在外力對(duì)殘基i擾動(dòng)后所有殘基位置的改變量。對(duì)于力的方向，有研究表明外力的方向?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)的擾動(dòng)不是非常重要［8］，因此在本文中，施加在i殘基3個(gè)方向上的力為（1,1,1）。

依次擾動(dòng)所有殘基可以得到一個(gè)N×N階的響應(yīng)矩陣P，其第j列代表擾動(dòng)殘基j其他殘基的響應(yīng)。將P矩陣進(jìn)行歸一化后，每一列的平均值代表了該列對(duì)應(yīng)殘基的敏感性，如第j列的平均值即為殘基j的敏感性，所有殘基的敏感性就組成了殘基敏感性特征曲線。該曲線峰值對(duì)應(yīng)的殘基被認(rèn)為是敏感殘基，在蛋白質(zhì)變構(gòu)中起關(guān)鍵作用［11］。

1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)方法

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成和功能的發(fā)揮在一定程度上依賴于殘基間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)（PSN）方法中，蛋白質(zhì)被簡(jiǎn)化成一個(gè)無(wú)權(quán)的圖，圖中的節(jié)點(diǎn)是殘基，邊是殘基間的相互作用。這里，當(dāng)殘基間的距離小于截?cái)喟霃?.0 ?時(shí)，認(rèn)為它們有相互作用。這樣，蛋白質(zhì)的PSN可以用鄰接矩陣來(lái)描述，其元素為：

其 中rij表 示 節(jié) 點(diǎn)i和j之 間 的 距 離。H（x） 是Heaviside 函數(shù)，當(dāng)x＞0 時(shí)，H（x）=1，當(dāng)x≤0 時(shí)，H（x）=0。節(jié)點(diǎn)i的度（degree）是與該節(jié)點(diǎn)連接的其他節(jié)點(diǎn)數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 高斯網(wǎng)絡(luò)模型的慢運(yùn)動(dòng)模式分析

在ENM 中，蛋白質(zhì)的低頻運(yùn)動(dòng)模式提供了分子大幅度的集合運(yùn)動(dòng)信息，與功能運(yùn)動(dòng)有關(guān)。為了解sPLA2的功能性動(dòng)力學(xué)特征，本文對(duì)人sPLA2-ⅠⅠA型31 個(gè)結(jié)構(gòu)分別構(gòu)建了GNM 模型，計(jì)算了前12個(gè)最慢運(yùn)動(dòng)模式（對(duì)漲落的貢獻(xiàn)大于50%）的均方漲落，以及其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（圖2a）。

圖2a 中的殘基漲落與前人MD 模擬［5］得到的漲落曲線相似，說(shuō)明GNM是獲得蛋白質(zhì)柔性的有效方法。從圖2a 發(fā)現(xiàn)處于漲落極小值的殘基，包括Cys26、Cys28、Cys43、Cys44、His47、Asp48、Cys49、 Tyr51、 Tyr66、 Cys77、 Cys83、 Cys90、Asp91、Cys97 和Cys117，也具有較小的標(biāo)準(zhǔn)差，說(shuō)明它們?cè)诓煌慕Y(jié)構(gòu)中都具有低運(yùn)動(dòng)性，是這些結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)共同特征。其中，His47、Asp48、Tyr51和Asp91構(gòu)成了催化網(wǎng)絡(luò)（圖2b），其通過與水分子發(fā)生相互作用穩(wěn)定了催化反應(yīng)所必需的氧離子中間體［12］。保守的催化二聯(lián)體His47-Asp91占據(jù)漲落的極小值，這符合催化殘基精確定位的要求［13］。另外，上述10個(gè)高度保守的半胱氨酸也處于極小值處，參與了二硫鍵的形成，起到了維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。殘基Tyr66 也高保守，有低運(yùn)動(dòng)性，參與了與68 位Tyr/Phe/Trp 的芳香環(huán)堆疊相互作用，起到了穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用［14］。

Fig.2 Residue fluctuations obtained by GNM for sPLA2 family member structures

sPLA2的C 端是loop 區(qū)，這可能是其具有較大漲落的原因。目前尚未發(fā)現(xiàn)它有重要的生物學(xué)功能，因此在分析漲落峰值的區(qū)域時(shí)沒有考慮C 端。將漲落中峰值的區(qū)域標(biāo)記為1～5（圖2a），并將其展示在結(jié)構(gòu)（PDB ⅠD：3u8b）中（圖2b）。區(qū)域1（Gly29～Ser35）屬于Ca2+結(jié)合環(huán)，主要負(fù)責(zé)Ca2+的結(jié)合。鈣離子通過與區(qū)域1中殘基的氧原子、催化殘基Asp48以及水分子的相互作用，得以穩(wěn)定在催化位點(diǎn)附近，為實(shí)現(xiàn)催化功能提供條件［5］。區(qū)域2（Gly58～Phe63）、區(qū)域4（Lys102～Tyr109）和區(qū)域5（Ser113～Lys115）主要參與了酶與膜的相互作 用， 特 別 是 殘 基Thr61、 Phe63、 Lys102、Lys107、Asn114 和Lys115 通過疏水或靜電相互作用與膜結(jié)合，其突變會(huì)影響酶的活性［15］。區(qū)域3（Ser71～Arg74）屬于連接兩個(gè)β 折疊的loop4，其功能還不是很明確。以前的MD模擬工作也顯示此區(qū)域的柔性較大，并且在有無(wú)膜的環(huán)境下，其殘基漲落的差異較為明顯［5］，因此推測(cè)該區(qū)域可能參與了膜的識(shí)別。另外，這些區(qū)域的漲落標(biāo)準(zhǔn)差較大，這是由于不同的結(jié)構(gòu)結(jié)合的配體有所不同導(dǎo)致的，體現(xiàn)了結(jié)構(gòu)對(duì)配體識(shí)別的特異性，這也說(shuō)明了這些區(qū)域?qū)Σ煌潴w結(jié)合的調(diào)控。

總之，從GNM 對(duì)慢運(yùn)動(dòng)模式分析的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，處于漲落極小值處的殘基是對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定或催化功能至關(guān)重要的殘基，這些殘基的低漲落是該酶成員共享的動(dòng)力學(xué)特征，而位于漲落峰值處的殘基可能與底物的結(jié)合有關(guān)，不同的結(jié)構(gòu)間存在顯著差異。

2.2 運(yùn)動(dòng)相關(guān)性分析

為了理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中殘基運(yùn)動(dòng)的關(guān)聯(lián)性，通過式（10）用ANM 模型計(jì)算了所有殘基漲落間的交叉相關(guān)系數(shù)的平均（圖3）。由于慢運(yùn)動(dòng)模式對(duì)應(yīng)著功能性運(yùn)動(dòng)，所以本文選取前21 個(gè)慢運(yùn)動(dòng)模式進(jìn)行計(jì)算（對(duì)漲落的貢獻(xiàn)大于50%）。

Fig.3 Average residue cross-correlations for human 31 sPLA2-IIA members

從 圖3 可 見，殘 基Thr104～Asn114 （位 于helix5和loop6上）與殘基Asn1～Thr13（位于helix1上）呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)，而與殘基Tyr21～His27（位于loop2 上）呈正相關(guān)。這些殘基在催化位點(diǎn)周圍，這種強(qiáng)相關(guān)運(yùn)動(dòng)有助于酶催化殘基的暴露及催化反應(yīng)的發(fā)生。此外，殘基Ala39～Arg53 和殘基Cys88～Asn100 之間存在較強(qiáng)的同向運(yùn)動(dòng)，它們分別位于承擔(dān)催化作用的helix3 和helix4 上，其中His47、Asp48、Tyr51 和Asp91 構(gòu)成了催化網(wǎng)絡(luò)。這些殘基的同向運(yùn)動(dòng)保證了催化功能的穩(wěn)定發(fā)揮。另外還發(fā)現(xiàn)，殘基Asn1～Thr13 （helix1）、殘基Ala39～Arg53 （helix3） 和 殘 基 Cys88～Asn100（helix4）呈現(xiàn)同向運(yùn)動(dòng)。helix1 和4 的同向運(yùn)動(dòng)部分是由于形成了疏水三聯(lián)體（Phe5-Ala94-Phe98）而形成的。該三聯(lián)體在空間上彼此接近，參與了高度保守的底物結(jié)合疏水通道的形成，促進(jìn)了磷脂與催化位點(diǎn)的結(jié)合［16］?？傊冈诖呋稽c(diǎn)周圍的強(qiáng)相關(guān)運(yùn)動(dòng)有助于酶與膜和磷脂的結(jié)合，促進(jìn)催化反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 微擾響應(yīng)掃描（PRS）分析

PRS 方法將ENM 與LRT 相結(jié)合，用來(lái)評(píng)估在蛋白質(zhì)上施加微擾對(duì)其構(gòu)象的影響。計(jì)算了31 個(gè)結(jié)構(gòu)的平均PRS熱圖（圖4a），及其各列元素平均后得到的殘基敏感性曲線（圖4c）。發(fā)現(xiàn)敏感性較高的殘基恰好對(duì)應(yīng)于從GNM慢運(yùn)動(dòng)模式分析識(shí)別到的5個(gè)區(qū)域。區(qū)域1負(fù)責(zé)Ca2+結(jié)合，敏感性較高，這是酶實(shí)現(xiàn)催化功能的要求。區(qū)域2、4和5均參與了酶與膜的相互作用，膜作為變構(gòu)劑調(diào)控酶的構(gòu)象。也就是說(shuō)，這些區(qū)域在酶的變構(gòu)中起到了重要作用。總之，PRS是識(shí)別蛋白質(zhì)變構(gòu)過程中起關(guān)鍵作用殘基的有效方法。

Fig.4 Evaluation of the role of sPLA2 residues sensitivity and variation among family members

除此之外，關(guān)注到一些具有較低敏感性的殘基Phe5、Met8（位于helix1 上）、Asp41（位于helix3上）、Ⅰle75 （位于β 折疊上）、Cys88、Lys92、Ala95、Phe98（位于helix4 上），它們包埋在結(jié)構(gòu)中（圖4b）。有意思的是，這些低敏感殘基幾乎占據(jù)了快運(yùn)動(dòng)模式下（最快的3 個(gè)121～124）漲落極大值的位置（圖4c）。GNM 的快運(yùn)動(dòng)模式反映了蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)的幾何不規(guī)則性，在蛋白質(zhì)折疊中，相較于慢運(yùn)動(dòng)模式下漲落，快運(yùn)動(dòng)模式下的漲落伴隨著更大的熵減［17］。同以往的研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)快運(yùn)動(dòng)模式下活躍的殘基往往處于蛋白質(zhì)折疊核區(qū)域，并且這些殘基對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用［17-18］。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)它們?cè)诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中具有高的平均度值（圖4d）。殘基度值（degree）反映了殘基在局部網(wǎng)絡(luò)中的連通性，也反映了殘基對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用［19］。因此，這些殘基在結(jié)構(gòu)上的緊密堆積（高的連通性）以及在快運(yùn)動(dòng)模式下的高活動(dòng)性表明它們?cè)诜€(wěn)定結(jié)構(gòu)方面具有重要作用。

3 結(jié) 論

本工作探索了人sPLA2中ⅠⅠA 型結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)和變構(gòu)特性，探索了其動(dòng)力學(xué)共性和特異性與功能的關(guān)系。根據(jù)GNM分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中動(dòng)力學(xué)高度受限的殘基，即催化殘基和半胱氨酸殘基，與酶的共有功能有關(guān)，它們分別對(duì)酶的催化和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要，在不同成員之間共享。另外，識(shí)別到柔性較大的5個(gè)區(qū)域，它們參與了保證酶催化活性的鈣離子的結(jié)合，以及與別構(gòu)劑膜的結(jié)合。這些區(qū)域的漲落在不同成員中差異較為顯著，體現(xiàn)出了成員的特異性。ANM 分析結(jié)果暗示了酶催化位點(diǎn)周圍的強(qiáng)相關(guān)運(yùn)動(dòng)，這有利于配體的結(jié)合及酶催化功能的實(shí)現(xiàn)。最后PRS 方法對(duì)酶變構(gòu)特性的分析表明，對(duì)擾動(dòng)高度敏感的殘基對(duì)應(yīng)上述柔性較大的5 個(gè)區(qū)域，說(shuō)明這些殘基作為傳感器在變構(gòu)通信中發(fā)揮重要作用，而低敏感性殘基在快運(yùn)動(dòng)模式下較為活躍，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有大的貢獻(xiàn)。本工作有助于深入理解sPLA2酶共有和特異性功能背后動(dòng)力學(xué)的機(jī)制，對(duì)同系物設(shè)計(jì)和藥物設(shè)計(jì)有一定的指導(dǎo)意義。