王志會(huì) 張 建

（山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥物學(xué)研究所，濟(jì)南 250012）

2019 年12 月起，嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoⅤ-2）感染事件在全球大范圍爆發(fā)，對(duì)全球經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，公共健康與衛(wèi)生安全受到嚴(yán)重威脅［1-2］。本次疫情將病毒重新拉回大眾視野，無(wú)論是全球大流行的流感病毒（influenza virus）、人類免疫缺陷病毒還是在非洲肆虐的埃博拉病毒，都對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生了巨大危害。臨床數(shù)據(jù)表明，有些病毒感染會(huì)引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，如ⅠL-6、TNFα、ⅠL-1β、ⅠFN-γ 等多種細(xì)胞因子迅速大量產(chǎn)生，這種現(xiàn)象是引起病毒性感染患者發(fā)生器官衰竭和呼吸窘迫綜合征的重要原因。其中，ⅠL-1β 和ⅠL-18 通過(guò)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的抗菌特性，啟動(dòng)Th1 和Th17 的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，促進(jìn)宿主對(duì)感染的防御。與其他促炎細(xì)胞因子相比，ⅠL-1β 和ⅠL-18是由非活性前體pro-ⅠL-1β和 pro-ⅠL-18經(jīng)過(guò)酶切割產(chǎn)生的具有生物活性的細(xì)胞因子，負(fù)責(zé)該加工處理的最重要的酶之一是胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶caspase-1，該加工過(guò)程受到炎癥小體的調(diào)控［3］。

炎癥小體是由模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor， PRR）、 接 頭 蛋 白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）和效應(yīng)蛋白pro-caspase-1 組成的大分子多蛋白復(fù)合物，識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)后，這些大分子復(fù)合物進(jìn)行組裝，觸發(fā)caspase-1 的自我激活，進(jìn)而對(duì)pro-ⅠL-1β 和pro-ⅠL-18 進(jìn)行切割。同時(shí)，炎癥型的caspase-1 可以切割gasdermin D（GSDMD），導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［4-5］。炎癥小體的活化有兩個(gè)步驟：首先，宿主細(xì)胞對(duì)微生物的模式識(shí)別誘導(dǎo)了pro-ⅠL-1β 和NLRP3 的轉(zhuǎn)錄；其次，危險(xiǎn)信號(hào)激活炎癥小體，導(dǎo)致caspase-1 的活化，并將細(xì)胞因子前體切割為成熟的具有生物活性的ⅠL-1β和ⅠL-18，以及觸發(fā)細(xì)胞焦亡［6-8］。炎癥小體可分為依賴于caspase-1激活的經(jīng)典型炎癥小體和依賴于caspase-11/4/5 激活的非經(jīng)典型炎癥小體。目前已發(fā)現(xiàn)的能形成炎癥小體的PRRs 包括NLRs（NOD-like receptors）和ALRs（AⅠM2-like receptors）家族蛋白等，其中對(duì)NLRP3炎癥小體的研究最為廣泛，在炎癥反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用。NLRP3 炎癥小體激活和調(diào)控的機(jī)制復(fù)雜且存在爭(zhēng)議。本文就NLRP3 炎癥小體在病毒感染過(guò)程中的激活和調(diào)控以及病毒針對(duì)NLRP3 炎癥小體的免疫逃逸機(jī)制等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 病毒感染對(duì)NLRP3炎癥小體活化的影響

靜息細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)水平的NLRP3 不足以形成炎癥小體，需要細(xì)胞外炎癥刺激來(lái)啟動(dòng)激活。例如，Toll 樣 受 體（Toll-like receptors，TLRs）、NLRs 或細(xì)胞因子受體激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，上調(diào)NLRP3 的表達(dá)水平并控制翻譯后的修飾，來(lái)積累炎癥小體的蛋白質(zhì)組分。NLRP3 可被一系列不同的刺激物激活，這些物質(zhì)包括晶體和微粒物質(zhì)（如石棉、二氧化硅和明礬等）、細(xì)胞外ATP、成孔毒素、RNA-DNA混合物以及一些病毒、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物病原體。

1.1 第一信號(hào)

單獨(dú)使用NLRP3激動(dòng)劑不足以激活炎癥小體，還需要一個(gè)啟動(dòng)信號(hào)，即第一信號(hào)。第一信號(hào)通常由微生物成分或內(nèi)源性細(xì)胞因子提供，通過(guò)TLRs、ⅠL1R或TNFR等受體激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。NF-κB是一個(gè)關(guān)鍵的炎癥應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)上調(diào)NLRP3 和pro-ⅠL-1β 的表達(dá)提供組裝炎癥小體的蛋白質(zhì)［9］。

不同的病毒感染對(duì)NLRP3 炎癥小體的活化產(chǎn)生不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒e 抗原（HBeAg）抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起NLRP3炎癥小體的活化和ⅠL-1β的產(chǎn)生，通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析推測(cè)，HBeAg 通過(guò)與接頭分子TRAM （TRⅠF-related adaptor molecule） 和MAL（MyD88 adaptor-like）結(jié)合，從而干擾NF-κB 信號(hào)通 路，抑 制NF-κB 磷 酸 化［10］。黏 液 瘤 病 毒（myxoma virus，MYXⅤ）的M013蛋白包含一個(gè)獨(dú)特的33殘基C端尾結(jié)構(gòu)，可以直接與NF-κB結(jié)合，抑制炎癥小體的活化［11］。嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠 狀 病 毒 （severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoⅤ）ORF3a 蛋白，通過(guò)促進(jìn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3 （TNF receptorassociated factor，TRAF3）依賴的p105 和ASC 泛素化，促進(jìn)NF-κB 和NLRP3 炎癥小體的活化［12］。在巨噬細(xì)胞中，手足口病病毒（foot-and mouth disease virus，F(xiàn)MDⅤ）RNA 誘導(dǎo)NF-κB 的活化，促進(jìn)NLRP3和pro-ⅠL-1β的轉(zhuǎn)錄，激活NLRP3炎癥小體和ⅠL-1β的分泌［13］。

1.2 第二信號(hào)

NLRP3 啟動(dòng)后可以被很多類型的化學(xué)和微生物刺激所激活，包括ATP、顆粒物質(zhì)、細(xì)菌和病毒成分等?；谶@些現(xiàn)象形成了一種假說(shuō)，即NLRP3 并不直接識(shí)別這些刺激劑，而是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)變化而發(fā)生活化。關(guān)于NLRP3 炎癥小體激活的機(jī)制還存在激烈的爭(zhēng)論，目前發(fā)現(xiàn)了幾種常見(jiàn)的細(xì)胞內(nèi)NLRP3上游信號(hào)，包括離子外流、線粒體損傷和ROS的產(chǎn)生、溶酶體破裂等。

1.2.1 離子外流

細(xì)胞的大部分能量用于維持細(xì)胞漿和細(xì)胞外環(huán)境之間的離子梯度。離子濃度的動(dòng)態(tài)變化調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)許多酶和信號(hào)通路，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，而且完整的離子梯度是防止健康細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。NLRP3 激活劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生離子濃度變化，包括K+外流、Ca2+動(dòng)員等，這些都與激活NLRP3 炎癥小體有關(guān)。越來(lái)越多的研究表明，某些RNA病毒編碼的跨膜病毒孔蛋白（viroporins）通過(guò)形成膜通道改變膜對(duì)離子的滲透性，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷或應(yīng)激反應(yīng)，RNA 病毒所導(dǎo)致的這些變化將激活NLRP3。

a.K+外流

K+外流被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體的激活信號(hào)，幾乎所有的NLRP3 刺激都會(huì)誘導(dǎo)K+外流，包括ATP、尼日利亞菌素和顆粒物質(zhì)等，胞質(zhì)K+濃度降低足以激活NLRP3炎癥小體［14］。P2X7R是一個(gè)非選擇性的陽(yáng)離子通道，具有類似于K+通道的孔形成基序，因此被認(rèn)為是一個(gè)K+外排通道，介導(dǎo)NLRP3 炎 癥 小 體 的 激 活［15］。胞 外ATP 刺 激P2X7R， 觸 發(fā)K+外 流， 引 起 泛 連 接 蛋 白1（pannexin-1）膜孔逐漸募集，P2X7 孔的打開(kāi)也會(huì)使ATP 流出，從而放大活化信號(hào)。TWⅠK2 是一個(gè)K+外流通道，有研究認(rèn)為它作為“劊子手”與P2X7R共同作用調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活［16］。

流感病毒M2 蛋白是一個(gè)H+選擇性離子通道，當(dāng)高爾基體腔呈酸性時(shí)，其定位于高爾基體膜上并引起H+外放，進(jìn)而誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體活化。另外，M2 蛋白的H37G 突變體誘導(dǎo)炎癥小體活化的能力增加，這可能是因?yàn)橥蛔凅w能在細(xì)胞膜上通過(guò)Na+/K+交換引起K+外流［17］。水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，ⅤSⅤ）或腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCⅤ）的復(fù)制會(huì)觸發(fā)K+外流，誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體的激活，然后釋放ⅠL-1β，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡和壞死［18］。SARS-CoⅤORF3a蛋白直接或通過(guò)增強(qiáng)K+外排激活caspase-1，從而啟動(dòng)NLRP3炎癥小體組裝［19］。在馬雅羅病毒（Mayaro virus，MAYⅤ）感染中，使用高濃度K+處理細(xì)胞會(huì)明顯抑制ⅠL-1β 釋放［20］。FMDⅤ2B 蛋白在細(xì)胞膜上形成孔道，誘導(dǎo)K+外排，作為第二信號(hào)激活NLRP3炎性小體。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，2B蛋白增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)FMDⅤ的特異性免疫反應(yīng)，抑制病毒的復(fù)制，可作為自體佐劑增強(qiáng)口蹄疫病毒樣疫苗或其他不需加強(qiáng)接種的亞單位蛋白疫苗的免疫應(yīng)答［13］。

b.Ca2+動(dòng)員

盡管Ca2+動(dòng)員在許多信號(hào)通路中廣泛存在，但是其在NLRP3 炎癥小體激活中的作用仍然存在爭(zhēng)議。在NLRP3 炎癥小體激活過(guò)程中，干擾Ca2+信號(hào)會(huì)抑制炎癥小體復(fù)合物組裝、caspase-1 剪切和ⅠL-1β 分泌。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加如何促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的激活尚不清楚［21］。一項(xiàng)研究表明，Ca2+的增加可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NLRP3 和ASC 之間的相互作用，直接調(diào)節(jié)NLRP3 炎癥小體活化。丙肝病毒（hepatitis C virus，HCⅤ）感染仍然是導(dǎo)致肝臟炎癥和疾病的一大誘因，其核心蛋白通過(guò)與磷脂酶c相關(guān)的Ca2+動(dòng)員誘導(dǎo)炎癥小體的活化，被認(rèn)為是激活NLRP3炎癥小體的關(guān)鍵因子［22］。據(jù)報(bào)道，小核糖核酸病毒（picornavirus）病毒孔蛋白2B 蛋白可以降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的Ca2+水平，導(dǎo)致Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并增加局部Ca2+濃度，細(xì)胞質(zhì)離子濃度失調(diào)導(dǎo)致NLRP3 炎癥小體的活化［23］。同樣，EMCⅤ和人類鼻病毒（human rhinovirus，HRⅤ）病毒孔蛋白2B蛋白特異性降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體的Ca2+濃度，并誘導(dǎo)NLRP3分布到核周區(qū)域，從而激活NLRP3炎癥小體，刺激ⅠL-1β的分泌［24-25］。

1.2.2 活性氧（ROS）和線粒體損傷

NLRP3 的激動(dòng)劑都會(huì)啟動(dòng)ROS 的產(chǎn)生，參與NLRP3 炎癥小體活化，因而ROS 被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體激活的共同信號(hào)。細(xì)胞內(nèi)的ROS 主要來(lái)源于線粒體，各種應(yīng)激條件包括代謝率升高、缺氧或膜損傷，都可以明顯誘導(dǎo)線粒體ROS（mtROS）的產(chǎn)生。在LPS 和ATP 的作用下，線粒體功能失調(diào)并產(chǎn)生mtROS，激活NLRP3 炎癥小體，而線粒體DNA（mtDNA）以NLRP3 和mtROS 依賴的方式釋放到細(xì)胞質(zhì)中［26］。多個(gè)研究表明，線粒體功能失調(diào)、mtROS產(chǎn)生和mtDNA釋放在NLRP3炎癥小體活化中發(fā)揮重要作用［27］。

除了產(chǎn)生mtROS 和mtDNA，線粒體還與NLRP3 炎癥小體發(fā)生共定位。線粒體相關(guān)分子，包括線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein，MAⅤS）、絲裂霉素2 和心磷脂，在NLRP3刺激劑作用下與NLRP3發(fā)生相互作用，其中MAⅤS 與NLRP3 間的相互作用是可溶性刺激因子（如ATP、nigericin）誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活所必需的［28］。使用mtROS的特異性清除劑Mito-TEMPO 處理骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）后，可以顯著抑制SARS-CoⅤORF3a和E蛋白所引起的ⅠL-1β釋放［29］。在MAYⅤ感染中，使用羅布麻寧抑制NADPH 氧化酶活性，可以有效阻止ROS 產(chǎn)生，并抑制MAYⅤ感染引起的ⅠL-1β產(chǎn)生，該作用具有劑量依賴性［20］。RNA病毒的感染啟動(dòng)了絲氨酸-蘇氨酸激酶RⅠP1（RⅠPK1）或RⅠP3（RⅠPK3）復(fù)合物的組裝，促進(jìn)了GTP酶DRP1的激活及其向線粒體轉(zhuǎn)位，從而驅(qū)動(dòng)線粒體損傷和NLRP3 炎癥小體的激活，抑制RⅠP1-RⅠP3 可以削弱RNA 病毒誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活［30］。流感病毒的PB1-F2蛋白通過(guò)Tom40 通道轉(zhuǎn)位到線粒體內(nèi)膜中，其積累導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜電位（Δφm）降低，加速線粒體破碎，激活NLRP3炎癥小體［31］。

1.2.3 溶酶體破裂

顆粒物質(zhì)包括二氧化硅、明礬、β淀粉樣蛋白或尿酸鈉結(jié)晶（MSU）被細(xì)胞吞噬后會(huì)破壞溶酶體，導(dǎo)致溶酶體失穩(wěn)或通透性增加，釋放組織蛋白酶B（cathepsin B）進(jìn)入胞漿，觸發(fā)NLRP3炎癥小體的激活。cathepsin B是一種特殊的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，與NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡、危險(xiǎn)信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生的ⅠL-1β有關(guān)。在NLRP3炎癥小體激活劑刺激下，cathepsin B敲除的巨噬細(xì)胞中caspase-1的活化和ⅠL-1β 的分泌被明顯抑制。然而，溶酶體破壞與NLRP3 炎癥小體激活之間的相關(guān)機(jī)制仍不清楚。有研究表明，溶酶體失穩(wěn)能夠使pannexin 1孔道打開(kāi)，ATP 釋放到胞外刺激P2RX7 受體，觸發(fā)K+外流而激活NLRP3炎癥小體。多種NLRP3激活劑可導(dǎo)致cathepsin B 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的NLRP3 相互作用，并導(dǎo)致后續(xù)的caspase-1 激活［32］。據(jù)報(bào)道，溶酶體cathepsin B 釋放不影響pro-ⅠL-1β 的產(chǎn)生，卻是ⅠL-1β 釋放所必需的，表明cathepsin B 參與了NLRP3 炎癥小體的激活［33］。在流感病毒感染中，洛霉素A 可以通過(guò)抑制空泡H+ATPase 系統(tǒng)來(lái)阻斷溶酶體酸化，完全抑制了流感病毒誘導(dǎo)的ⅠL-1β 釋放，這表明溶酶體在病毒介導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體活化中發(fā)揮重要作用［34］。

2 病毒感染對(duì)NLRP3炎癥小體組裝的影響

NLRP3 炎癥小體激活后，NLRP3、ASC 和pro-caspase-1進(jìn)行組裝，形成炎癥小體復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮天然免疫功能。研究表明，某些病毒可以通過(guò)影響炎癥小體組裝過(guò)程，調(diào)控炎癥小體的活化，影響病毒的復(fù)制與清除。

2.1 NLRP3

NLRP3 屬于NLR 蛋白家族，由3 部分組成：NACHT 結(jié) 構(gòu) 域 （central nucleotide-binding and oligomerization domain）、 C 端LRRs 結(jié) 構(gòu) 域（leucine-rich repeats）以及N 端PYD 結(jié)構(gòu)域（pyrin domain）。NACHT 是所有NLR 家族成員唯一共有的結(jié)構(gòu)域，具有ATP 酶活性，能夠發(fā)生自身寡聚化；LRRs被認(rèn)為在配體識(shí)別和自動(dòng)調(diào)節(jié)中起作用，通過(guò)識(shí)別相關(guān)信號(hào)誘導(dǎo)NACHT 結(jié)構(gòu)域發(fā)生寡聚化，暴露N端PYD結(jié)構(gòu)域；PYD通過(guò)PYD-PYD與接頭蛋白ASC 相互作用［35］。在靜息狀態(tài)下，胞漿中NLRP3 維持自我抑制狀態(tài)，識(shí)別配體后驅(qū)動(dòng)NLRP3 寡聚化。在NLRP3 刺激劑作用下，NⅠMA相 關(guān) 激 酶7 （NⅠMA related kinase 7，NEK7） 與NLRP3 相互作用，形成NEK7-NLRP3 大分子復(fù)合物，對(duì)NLRP3 炎癥小體激活和組裝發(fā)揮必要調(diào)節(jié)作用［36］。

有研究證明，某些病毒蛋白可以通過(guò)影響NLRP3 從而對(duì)炎癥小體的組裝產(chǎn)生影響。麻疹病毒（measles virus，MⅤ）的非結(jié)構(gòu)蛋白Ⅴ蛋白可以拮抗天然免疫，在穩(wěn)定表達(dá)Ⅴ蛋白的THP-1 中，NLRP3位于胞質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)中，在炎癥小體激活后，NLRP3 重新分布到核周區(qū)與Ⅴ蛋白共定位，且Ⅴ蛋白通過(guò)其C 端結(jié)構(gòu)域與NLRP3 相互作用，從而抑制炎癥小體介導(dǎo)的ⅠL-1β 分泌［37］。腸道病毒71（enterovirus，EⅤ71）的3D 蛋白和寨卡病毒（Zika virus，ZⅠKⅤ）的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5都是RNA依賴的RNA 聚合酶，通過(guò)形成一個(gè)3D/NS5-NLRP3-ASC的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與NLRP3 直接作用，增強(qiáng)炎癥小體的組裝和活化，促進(jìn)ⅠL-1β 的產(chǎn)生［38-39］。在仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeⅤ）感染中，Ⅴ蛋白可能通過(guò)與NLRP3 相互作用抑制ASC 的招募，阻止了NLRP3依賴的ASC 寡聚，導(dǎo)致NLRP3 炎癥小體不能充分激活，從而阻斷ⅠL-1β 的分泌［40］。流感病毒的PB1-F2 蛋白與NLRP3 的PYD 和LRR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使NLRP3 保持自我抑制狀態(tài)，阻止NEK7 和NLRP3 的結(jié)合，抑制炎癥小體的組裝，從而減少感染細(xì)胞的焦亡，促進(jìn)病毒的逃逸［41］。

2.2 ASC

凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC 由PYD 和CARD 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，也被稱為PYCARD。NLRP3 炎癥小體激活后，ASC 通過(guò)PYD 與上游的NLRP3 作用，然后通過(guò)CARD 招募下游的pro-caspase-1，進(jìn)行炎癥小體的組裝。在組裝過(guò)程中ASC 寡聚形成一個(gè)直徑約1～2 μm 的超分子聚集體，稱為ASC 斑點(diǎn)，是誘導(dǎo)炎癥小體完全激活所必需的。低溫電子顯微鏡和固態(tài)核磁共振分析研究表明，ASC 通過(guò)PYD結(jié)構(gòu)域低聚化為長(zhǎng)螺旋絲狀物，CARD暴露在這些絲狀蛋白的表面，并作為caspase-1 的招募位點(diǎn)。ASC 的CARD 結(jié)構(gòu)域還能使caspase-1 的CARD形成絲狀核，這可能是caspase-1近端激活所必需的。ASC 斑點(diǎn)在炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，并支持ASC 通過(guò)PYD 快速聚集，產(chǎn)生大量潛在的caspase-1 激活位點(diǎn)，是炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)的放大機(jī)制［42］。在人類腺病毒5（adenovirus-5，Ad5）感染中，病毒相關(guān)RNAⅠ（ⅤA RNAⅠ）通過(guò)阻斷蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）和ASC之間的相互作用來(lái)抑制ASC 磷酸化和寡聚化，抑制炎癥小體的激活，限制焦亡小體的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免于焦亡［43］。在穩(wěn)態(tài)下，ASC 位于高爾基體且與免疫相關(guān)GTP 酶家族M 蛋白（immunityrelated GTPase family M protein，ⅠRGM） 相 互作用；在HCⅤ感染時(shí)，ASC 被招募到NLRP3 并與ⅠRGM 分離，導(dǎo)致高爾基體片段化，以增強(qiáng)HCⅤ復(fù)制所需的脂質(zhì)供應(yīng)，有利于病毒復(fù)制［44］。有研究表明，SARS-CoⅤ感染或ORF3a 表達(dá)的細(xì)胞中，ORF3a 與TRAF3 和ASC 相互作用，在細(xì)胞質(zhì)中以離散的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)共定位，ASC 的TRAF3 依賴性K63 泛素化更明顯，促進(jìn)ASC 斑點(diǎn)的形成，激活NLRP3炎癥小體［12］。

2.3 Caspase-1

Caspase-1 屬于半胱氨酸蛋白酶家族，NLRP3炎癥小體活化后，ASC 通過(guò)CARD 招募單體pro-caspase-1 聚集，引起pro-caspase-1 自我切割。首先，在pro-caspase-1的N端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)水解，去除N端前肽；然后，在大、小亞基之間切割，釋放p20 和p10 兩個(gè)亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個(gè)二聚體形成有活性的p10/p20 四聚體，構(gòu)成活化的caspase-1。活化的caspase-1 切割pro-ⅠL-1β 和pro-ⅠL-18，產(chǎn)生有活性的促炎細(xì)胞因子ⅠL-1β和ⅠL-18，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有重要影響。

炎癥小體的活化受到多種機(jī)制負(fù)調(diào)控。有研究表明，NLRP3 炎癥小體激活信號(hào)可以促進(jìn)富含亮氨酸重復(fù)Fli-Ⅰ相互作用蛋白2（leucine-rich repeat Fli-Ⅰ-interacting protein 2，LRRFⅠP2）與NLRP3 結(jié)合，并通過(guò)螺旋基序（coil motif）與caspase-1 的假底物Flightless-1 相互作用，促進(jìn)Flightless-1 與caspase-1 相互作用，抑制caspase-1 的活化，被認(rèn)為是負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體活性的機(jī)制［45］。顆粒晶體誘導(dǎo)的吞噬作用引發(fā)Ca2+信號(hào)，這是激活鈣蛋白酶（calpain）的先決條件。激活的鈣蛋白酶把caspase-1從Flightless-1和細(xì)胞骨架上釋放出來(lái)，擴(kuò)大了caspase-1 池，增加了細(xì)胞質(zhì)中NLRP3 炎癥小體的寡聚化。 在細(xì)胞外高K+或格列本脲（glyburide）處理下，持續(xù)的膜去極化或超極化會(huì)損害鈣蛋白酶釋放caspase-1 的能力，抑制NLRP3炎癥小體的活化［46］。微生物感染通常導(dǎo)致Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生和炎癥小體的激活，這些關(guān)鍵途徑之間的平衡對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究表明，DNA 病毒感染激活炎癥小體后，caspase-1 與環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-磷酸腺苷合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）相互作用，導(dǎo)致cGAS裂解而失活，并抑制cGASSTⅠNG（stimulator of interferon gene，擾素基因刺激因子）介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。同時(shí)，Ⅰ型干擾素通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子STAT3 （signal transducers and activators of transcription）誘導(dǎo)ⅠL-10 信號(hào)，抑制pro-ⅠL-1β 產(chǎn) 生，從 而 抑 制 炎 癥 小 體 的 激 活［47］。ZⅠKⅤ感染可觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活，病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 招募宿主去泛素酶USP8，在caspase-1 Lys134 位點(diǎn)去除K11 連接的多聚泛素鏈，從而抑制蛋白酶體對(duì)caspase-1 的降解，進(jìn)一步增強(qiáng)NLRP3炎癥小體激活，有利于病毒的復(fù)制［48］。

3 病毒感染對(duì)NLRP3炎癥小體內(nèi)源調(diào)控途徑的影響

在應(yīng)對(duì)病毒感染時(shí)，NLRP3 炎癥小體的激活有助于激活免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，快速清除病毒，對(duì)于機(jī)體抵抗病毒感染十分重要。然而，炎癥小體通路的過(guò)度激活也會(huì)導(dǎo)致組織損傷和自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染過(guò)程中，宿主會(huì)通過(guò)引起炎癥小體內(nèi)源性調(diào)控途徑包括自噬和翻譯后修飾等，調(diào)控炎癥小體的活化，防止因促炎因子過(guò)度分泌導(dǎo)致長(zhǎng)期組織炎癥和損傷。

3.1 自噬

自噬是通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)功能失調(diào)組分的過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝的需要和細(xì)胞器的更新。自噬和炎癥小體在功能上相互關(guān)聯(lián)，它們都控制著細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)過(guò)程，如新陳代謝、能量產(chǎn)生、細(xì)胞器的維護(hù)，并嚴(yán)格控制炎癥和病原體的清除。自噬可通過(guò)多種機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控炎癥小體的激活，對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)和健康至關(guān)重要。自噬可以通過(guò)去除舊的、損壞的細(xì)胞器或病原體，減少PAMPs 或DAMPs的釋放，間接限制炎癥小體的激活。例如，自噬捕獲和降解受損的線粒體，限制了mtDNA 和活性氧的積累。研究表明，NF-κB 在啟動(dòng)NLRP3活化的同時(shí)，也可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬受體p62/SQSTM1 的積累清除受損的線粒體，調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活和細(xì)胞因子的釋放［49］。此外，自噬小體可直接隔離和降解炎癥小體的激活物、成分或產(chǎn)物。例如，自噬通過(guò)降解pro-ⅠL-1β 來(lái)控制ⅠL-1β的產(chǎn)生［50］。自噬也可以去除未活化的MyD88單體并降解接頭蛋白TRⅠF（TⅠR domain-containing adaptor-inducing ⅠFN-β），以限制由TLR和ⅠL-1R介導(dǎo)的促炎信號(hào)通路，抑制ⅠL-1β和ⅠL-18的產(chǎn)生［51］。流感病毒感染中，RⅠPK2介導(dǎo)線粒體自噬，清除受損的線粒體，降低線粒體超氧化物的產(chǎn)生，抑制炎癥小體激活，阻止caspase-1 的過(guò)度活化，從而抑制ⅠL-18 驅(qū)動(dòng)的有害炎癥反應(yīng)［52］。利什曼蟲(chóng)RNA病毒（Leishmania RNA virus，LRⅤ）激活TLR3和TRⅠF 誘導(dǎo)Ⅰ型ⅠFN 產(chǎn)生，并通過(guò)誘導(dǎo)自噬導(dǎo)致ATG5 介導(dǎo)的NLRP3 和ASC 的降解，從而抑制炎癥小體的組裝，限制了巨噬細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的激活［53］。

3.2 翻譯后修飾

在NLRP3 炎癥小體激活中存在多種NLRP3 和ASC 的 翻 譯 后 修 飾 （post-translational modifications，PTM）調(diào)節(jié)，包括磷酸化、泛素化、烷基化、S-亞硝基化和ADP 核糖基化等，在炎癥小體通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［54］。所有的蛋白質(zhì)功能都是由翻譯后修飾“代碼”組合調(diào)控的，該“代碼”改變蛋白質(zhì)的表面特征，賦予它們不同的功能。在巨噬細(xì)胞中，ASC 磷酸化對(duì)于激活NLRP3 炎癥小體是必要的，Syk 和Jnk 激酶可以通過(guò)磷酸化ASC CARD 結(jié)構(gòu)域Tyr146 和Tyr187，促進(jìn)ASC 斑點(diǎn)在核周的形成［55］。ⅠKKα 作為NLRP3炎癥小體的負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)與ASC的相互作用，減少ASC從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的易位。ⅠKKα磷酸化CARD 結(jié)構(gòu)域的Ser193 和PYD 結(jié)構(gòu)域的Ser16，在細(xì)胞核中與ASC 相互作用，阻止其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行炎性小體激活。PKA 磷酸化人NLRP3 的Ser295，通過(guò)抑制NLRP3 的ATP 酶活性負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活［56］。

蛋白質(zhì)泛素化和去泛素化是動(dòng)態(tài)過(guò)程，在生物學(xué)過(guò)程的許多方面調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的降解、運(yùn)輸和信號(hào)傳遞。目前已報(bào)道有兩種不同的泛素化所介導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體的負(fù)調(diào)控，即K63 和K48 泛素化共同介導(dǎo)的NLRP3 失活、K48 泛素化介導(dǎo)的NLRP3 蛋白酶體降解。去泛素酶BRCC3 通過(guò)與NLRP3 的LRR 結(jié)構(gòu)域相互作用使NLRP3 去泛素化，在NLRP3 炎癥小體激活中發(fā)揮重要作用［57］。TRⅠM31 是E3 泛素連接酶，也可調(diào)控NLRP3 K48泛素化，導(dǎo)致其蛋白酶體降解，從而減少炎癥小體激活［58］。在RNA 病毒感染中，MAⅤS 能夠結(jié)合并穩(wěn)定ASC，誘導(dǎo)胞漿ASC 斑點(diǎn)的形成，并通過(guò)向ASC 招募E3 連接酶TRAF3 對(duì)ASC 的Lys174 泛素化，參與斑點(diǎn)的形成以及炎癥小體的活化［59］。在pH1N1/09 流感病毒感染中，非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）通過(guò)抑制ASC 斑點(diǎn)形成、抑制ASC 的K110 和K140位點(diǎn)泛素化，抑制NLRP3炎癥小體的活化以及ⅠL-1β的分泌［60］。

4 病毒感染對(duì)NLRP3炎癥小體效應(yīng)功能的影響

NLRP3 炎癥小體激活后，產(chǎn)生有活性的促炎因子ⅠL-1β和ⅠL-18，同時(shí)可導(dǎo)致一種高度炎癥形式的細(xì)胞死亡，即焦亡，發(fā)揮天然免疫的屏障作用。

4.1 細(xì)胞因子成熟和釋放

在病毒感染過(guò)程中，NLRP3 炎癥小體通常被激活，釋放的ⅠL-1β 和ⅠL-18 具有促進(jìn)宿主防御的功能，是促進(jìn)炎癥和協(xié)調(diào)先天與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。其中，ⅠL-1β 可以招募和激活其他免疫細(xì)胞至感染部位或組織損傷部位，如中性粒細(xì)胞。炎癥小體活化后，caspase-1 切割非活性前體pro-ⅠL-1β 和pro-ⅠL-18，產(chǎn)生成熟的ⅠL-1β 和ⅠL-18。ⅠL-1β 是一種非典型細(xì)胞因子，缺乏分泌信號(hào)肽，因此它不遵循典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑釋放到細(xì)胞外環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，ⅠL-1β 可以轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)一個(gè)中間囊泡結(jié)構(gòu)中， 通過(guò)跨膜 p24 樣運(yùn)輸?shù)鞍?10（transmembrane p24 trafficking protein 10，TMED10） 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)非經(jīng)典分泌途徑（TMED10-channeled unconventional protein secretion，THUPS） 分 泌 到 細(xì) 胞 外［61］。此 外，GSDMD 對(duì)于巨噬細(xì)胞中細(xì)胞膜孔形成和ⅠL-1β 的釋放是必需的［62］。多種病毒可以通過(guò)不同的機(jī)制激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)ⅠL-1β的釋放，誘導(dǎo)機(jī)體天然免疫，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。但是，某些病毒蛋白可以通過(guò)調(diào)控炎癥因子的水平，促進(jìn)病毒侵襲，從而增加疾病嚴(yán)重程度。研究發(fā)現(xiàn)，登革病毒（dengue virus，DⅤ）感染患者血小板中ⅠL-1β 水平升高，活化的NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)血小板來(lái)源含ⅠL-1β 的微粒（microparticles，MP）脫落，促進(jìn)ⅠL-1β 分泌，這可能有助于登革熱病期間血管通透性和血液濃度增加的發(fā)展［63］。

4.2 焦亡

焦亡是一種程序性死亡方式，它的特征包括細(xì)胞膜上形成孔洞、細(xì)胞腫脹和膜破裂，導(dǎo)致大量胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏，還伴有DNA 裂解和核濃縮，但是其核的完整性不受損害，這與凋亡的DNA 特征不同。Gasdermin 家族成員GSDMD 是最先被確定執(zhí)行膜溶解的效應(yīng)物。活化的caspases-1 對(duì)GSDMD進(jìn)行切割，生成獨(dú)立的N 端和C 端片段。一旦GSDMD的N端脫離了自抑制C端結(jié)構(gòu)域，即聚集到細(xì)胞膜并形成膜孔，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞的滲漏和溶解，介導(dǎo)ⅠL-1β的胞外分泌。

病毒感染期間的程序性細(xì)胞死亡是一種宿主抗病毒的防御機(jī)制，可以抑制這些細(xì)胞內(nèi)病原體的存活和復(fù)制。由于它的促炎性質(zhì)，焦亡將進(jìn)一步激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和免疫監(jiān)視系統(tǒng)的激活，以促進(jìn)病毒清除。盡管針對(duì)炎癥小體和炎癥小體依賴的細(xì)胞因子抗病毒功能已有詳細(xì)的研究，但是關(guān)于焦亡在宿主抗病毒防御中的重要性研究比較有限。以SARSCoⅤ-2 感染為例，炎癥小體釋放的ⅠL-1β 激活單核細(xì)胞，分泌ⅠL-6、TNF-α和ⅠL-8，這些細(xì)胞因子可以通過(guò)向肺部募集中性粒細(xì)胞引起炎癥。中性粒細(xì)胞中的GSDMD 激活導(dǎo)致中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET）的形成，其可以募集血小板并促進(jìn)高凝狀態(tài)。同時(shí)，ⅠL-1β和ⅠL-6可以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附連接，從而增加通透性，這可能有助于肺血管系統(tǒng)的凝血。由焦亡的單核細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EⅤs）也可以直接激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)新型冠狀病毒肺炎（COⅤⅠD-19）感染引起的凝血，這可能與COⅤⅠD-19嚴(yán)重患者的高死亡率相關(guān)［64］。人類博卡病毒1（human bocavirus 1，HBoⅤ-1）感染引起ⅠL-1α和ⅠL-18 的表達(dá)水平增加，并通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)促進(jìn)caspase-1 依賴的細(xì)胞焦亡；而死亡的細(xì)胞可通過(guò)釋放炎癥信號(hào)導(dǎo)致更多的上皮細(xì)胞因焦亡而死亡，進(jìn)而加劇了損傷性的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致人呼吸道上皮細(xì)胞的持續(xù)感染［65］。DⅤ通過(guò)激活一種對(duì)登革出血熱至關(guān)重要的C型凝集素CLEC5A/MDL-1，誘導(dǎo)炎性巨噬細(xì)胞GM-Mφ 產(chǎn)生高水平的ⅠL-1β和ⅠL-18，并導(dǎo)致焦亡，從而促進(jìn)疾病發(fā)展［66］。人類免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus-1，HⅠⅤ-1）包膜蛋白gp120是HⅠⅤ相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制的主要原因，通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活、細(xì)胞焦亡和ⅠL-1β 釋放，從而引發(fā)神經(jīng)炎癥并最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和行為障礙［67］。

5 總結(jié)與展望

NLRP3 炎癥小體是近十年來(lái)研究最為深入的炎癥小體，但是目前尚無(wú)明確和統(tǒng)一的NLRP3 炎癥小體激活機(jī)制。NLRP3 炎癥小體作為機(jī)體天然免疫的組成部分，由模式識(shí)別受體NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白pro-caspase-1組成多聚蛋白復(fù)合物，可被感染、組織損傷或代謝失衡期間產(chǎn)生的一系列物質(zhì)所觸發(fā)，在免疫反應(yīng)和疾病中發(fā)揮重要作用。一旦蛋白質(zhì)復(fù)合物形成，炎癥小體激活caspase-1，而caspase-1 進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞因子ⅠL-1β和ⅠL-18成熟。此外，炎癥小體的激活會(huì)導(dǎo)致一種快速的、促炎的細(xì)胞死亡形式，即焦亡。

病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，而炎癥小體在對(duì)抗感染中發(fā)揮著重要作用。宿主細(xì)胞通過(guò)識(shí)別病毒組分活化炎癥小體，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和獲得性免疫，這是宿主的先天防御手段?；罨难装Y小體能夠募集免疫細(xì)胞和誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮抗病毒作用，但是，過(guò)度活化的炎癥小體也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴和組織損傷，加劇病毒感染的嚴(yán)重程度。病毒通過(guò)自身蛋白質(zhì)對(duì)炎癥小體的活化、組裝和效應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，以逃避宿主細(xì)胞的監(jiān)視和清除（圖1）。SARS-CoⅤ-2 感染可導(dǎo)致一系列疾病，其中最嚴(yán)重的是通過(guò)刺激NLRP3 炎癥小體而產(chǎn)生的強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)［68］。鑒于藥物發(fā)現(xiàn)的迫切需要，了解NLRP3 炎癥小體在感染中發(fā)揮的作用，有助于進(jìn)一步闡明發(fā)病機(jī)制、建立有效的治療策略。在SARS-CoⅤ-2大流行的背景下，更多的闡述病毒調(diào)控炎癥小體的機(jī)制，可以促進(jìn)對(duì)病毒逃逸免疫監(jiān)視的了解，為疾病治療和藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。

Fig.1 The influence of virus infection on the activation，assembly and effect of NLRP3 inflammasome圖1 病毒感染對(duì)NLRP3炎癥小體活化、組裝和效應(yīng)的影響