張桂英 朱 靜 張喜文 師俊玲 曲 睿 杜文娟 姜龍波 李 萍

(山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所1，長治 046011)

(信陽農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院2，信陽 464000)

(空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室; 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院3，西安 710072)

小米營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素及鈣磷鐵等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1，2]，具降脂、降壓、滋陰養(yǎng)血、調(diào)節(jié)睡眠等功效[3]。目前，米發(fā)糕[4]和小米糕[5]研究較多，但以小米為主要原料的發(fā)糕鮮見報道。小米發(fā)糕風(fēng)味獨特、極易消化，是一種深受大眾喜愛的粗糧制品。民間生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法，主要菌種為乳酸菌和酵母菌。由于多數(shù)乳酸菌對人體健康的有益特性及其在國民經(jīng)濟中的重要作用，近年來，利用乳酸菌發(fā)酵食品、藥品等層出不窮[4]。如何將小米發(fā)糕發(fā)酵劑中的優(yōu)良乳酸菌引入市售混合菌劑，將會成為傳統(tǒng)發(fā)酵劑研究領(lǐng)域的一個創(chuàng)新點[4,6,7]。

米發(fā)糕發(fā)酵劑中優(yōu)勢菌是酵母菌和乳酸菌。乳酸菌屬包括肉食桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、四鏈球菌屬、魏斯氏菌屬[8]。本研究在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所已有的工作基礎(chǔ)上[9-11]，從前期選育的優(yōu)良小米品種中，通過小米發(fā)糕感官評價、理化分析和質(zhì)構(gòu)分析等篩選獲得5份品質(zhì)差異較大的小米品種為對象，利用自然發(fā)酵法制備發(fā)酵劑，通過細菌總數(shù)測定和其制備小米發(fā)糕品質(zhì)的感官評價，初步篩選差異較大的2個品種進行乳酸菌的分離。采用乳酸菌傳統(tǒng)分離方法，分析了發(fā)酵劑中的乳酸菌優(yōu)勢菌群，并通過分離乳酸菌制作小米發(fā)糕，測定其對產(chǎn)品風(fēng)味、品質(zhì)等的影響，進一步篩選適合小米發(fā)糕制作的乳酸菌菌種。為進一步了解傳統(tǒng)發(fā)酵劑中乳酸菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料

發(fā)酵劑制備用小米粉：1號[(長農(nóng)35，國鑒谷2013002)[9]，2號(晉谷56，晉審谷(認)2013002)][10]，6號(長谷4號，國00027992)[11]，8號(M1)，10號(K4)，由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究選育；乳酸菌對小米發(fā)糕品質(zhì)影響實驗用小米粉：“谷谷香”小米面粉；味憶佳綿白糖；新良中勁小麥粉；安琪高活性干酵母。

1.1.2小米粉的制備

小米經(jīng)除雜后，40℃干燥至恒重后進行磨粉，小米粉過100目篩備用。

1.1.3培養(yǎng)基及主要藥品試劑

MRS固體(液體)培養(yǎng)基[4]；TaqDNA聚合酶、D2000Marker；細菌基因組DNA提取試劑盒；其他化學(xué)藥品均為進口分析純藥品。

1.1.4儀器與設(shè)備

T100TMThermal Cycler PCR儀；SW-CJ-2F 超凈化工作臺；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器；SPX-250生化培養(yǎng)箱；TGL-16C離心機；JC101-2A電熱干燥箱；XF-2醒發(fā)箱；SH2-82A氣流恒溫振蕩器；TU-1810紫外可見風(fēng)光光度計。

1.2 方法

1.2.1小米發(fā)糕蒸制工藝

參照米發(fā)糕的制備工藝進行調(diào)整[12, 13]，稱取120g小米面粉，加入6g綿白糖之后攪拌均勻，用120mL沸水燙面，然后加入80g中筋面粉，用手和面至光滑，至35℃醒發(fā)箱發(fā)酵2h，然后觀察生面團的形態(tài)和發(fā)酵速度。取發(fā)酵面團每50g塑性，然后進行30min二次醒發(fā)，涼水上鍋，電磁爐1300W到鍋蓋發(fā)熱，調(diào)制1600W到出汽，再蒸制30min。

1.2.2小米發(fā)糕發(fā)酵劑中乳酸菌的分離、純化及篩選

從酵子內(nèi)部及酵子表面各取面5g，合并轉(zhuǎn)置于90mL 無菌水的三角瓶中(瓶中預(yù)先放一定數(shù)量的小玻璃珠)，160r/min，30min，使酵子樣品盡可能溶解，制成酵子懸液。將酵子懸液依次稀釋103～106倍，制成梯度稀釋液，混勻后37℃培養(yǎng)48h，挑取不同形態(tài)單個菌落，劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，重復(fù)4次純化乳酸菌。純化得到的乳酸菌菌株，觀察并記錄菌落特征并挑取單菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，并置于4℃保藏。小米發(fā)糕發(fā)酵劑中乳酸菌屬的鑒定按照文獻[14,15]中的方法進行，包括：革蘭氏染色；過氧化氫酶實驗；葡萄糖產(chǎn)氣、產(chǎn)酸實驗。

1.2.3乳酸菌對小米發(fā)糕品質(zhì)的影響

(1)乳酸菌的擴大培養(yǎng)：將1.2.2斜面保存的乳酸菌，接種于裝有5mLMRS培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)24h，按5%的接種量再接種于100mL三角瓶中，培養(yǎng)結(jié)束后，5000r/min離心10min收集菌體，用滅菌蒸餾水清洗3次，4℃保存用于小米發(fā)糕制作。

(2)小米發(fā)糕制作：按1.2.1方法制備小米發(fā)糕，酵母菌與乳酸菌的菌種比例107∶107(數(shù)量比)，加入量2%。

(3)指標測定:小米發(fā)糕含水量的測定[16]，比容采用菜籽置換法[17]，pH和總酸度(TTA值)測定參照GB5009.239—2016；還原糖含量測定參照GB5009.7—2016。

(4)感官評定:參考文獻進行相應(yīng)調(diào)整[13]，制定小米發(fā)糕感官評價標準，見表1。小米發(fā)糕感官評價方法：在小米發(fā)糕蒸制好后2～5h進行感官評定。10位經(jīng)過訓(xùn)練的評委對切好的1.0cm厚小米發(fā)糕樣品進行評分。評委中的男性4位，女性6位，年齡在18～35歲范圍內(nèi)。小米發(fā)糕的感官評定主要從小米發(fā)糕的食用品質(zhì)指標進行評分(表1)，取其平均值。以小米發(fā)糕形態(tài)蓬松、色澤金黃均勻、有柔和的發(fā)酵味、酸甜適中，口感松軟為最高分(滿分100分)，總分為各項指標平均得分之和。

表1 小米發(fā)糕感官評價標準表

其中，小米發(fā)糕體積的測定采用小米置換法[17]。比容(mL/g)= 體積(mL)/質(zhì)量(g)，取4次測定的平均值作為米發(fā)糕的比容。

1.2.4菌株16s rDNA序列分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，使用1%瓊脂糖電泳進行檢測，并以此DNA為模板，利用細菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3’)針對性地對16s rDNA序列進行擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL：10×Buffer5μL、dNTP4μL、MgCl24μL、引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA40～50ng、Ex Taq1.5U、滅菌超純水補齊至50μL。反應(yīng)條件為：98℃2min，98℃10s，57℃10s，72℃15s，35個循環(huán)，72℃2min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進行檢測。純化后的PCR產(chǎn)物用ABI3730基因測序儀測序。使用Lasergene軟件內(nèi)部的SeqMan對測序結(jié)果進行拼接及引物序列校準。將拼接后的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，然后使用MEGA5軟件對基因序列及若干近源種的16s rDNA基因進行多序列比對，并使用鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離源篩選

將在30℃下培養(yǎng)48h的菌落進行計數(shù)，并結(jié)合小米發(fā)糕相應(yīng)的品質(zhì)特征，篩選差異較大的兩種分離源，結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵劑中乳酸菌總數(shù)和小米發(fā)糕的品質(zhì)特征

從菌落計數(shù)結(jié)果看，乳酸菌菌落數(shù)達到107～109cfu/g，與大多數(shù)酸面團的報道結(jié)果一致[18,19]。

對采集的小米粉制備的小米發(fā)糕樣品感官進行評定，由表2可知，6號小米粉制備的小米發(fā)糕酸度最大，黏性較大，質(zhì)硬，彈性較低；2號和10號樣品酸味淡，黏度略大，總體彈性低，總體來說，10號比2號品質(zhì)好，但酸味比2號濃些；8號樣品酸味較大，黏度略大，彈性較好；1號樣品發(fā)糕酸味適中，質(zhì)地細膩，彈性較好，口感更順滑柔和。且發(fā)現(xiàn)6號面團的發(fā)酵速度較其他快，說明同樣時間內(nèi)，其產(chǎn)酸量更大，其他產(chǎn)品發(fā)酵速度差異不大。

總體來說，1號樣品感官品質(zhì)較好，6號較差，且面團的發(fā)酵速度也不同。不同來源的酸面團中細菌的種類和數(shù)量均有所不同[20]，因此選擇差異最大的2個發(fā)酵劑作為乳酸菌的分離源。

2.2 乳酸菌的篩選

將分離純化的91株細菌，進行革蘭氏染色、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和過氧化氫酶活性檢測，由乳酸菌的特性，認為革蘭氏染色陽性，葡萄糖產(chǎn)酸陽性，葡萄糖產(chǎn)氣陰性及過氧化氫酶陰性的菌株為乳酸菌。符合條件的菌株共有33株，初步鑒定為乳酸菌。

2.3 乳酸菌對小米發(fā)糕品質(zhì)的影響

2.3.1乳酸菌對小米發(fā)糕含水量的影響

調(diào)粉后，含水量高的面團容易被CO2膨脹，因而發(fā)酵速度較快，較硬的面團則對氣體膨脹力的抵抗能力強，從而使面團發(fā)酵速度受到抑制[21]。由圖1可知，編號為LA1-46、LA1-28、LA6-34和LA6-40的乳酸菌調(diào)制的面團含水量較高(>44%)，發(fā)酵速度較快。根據(jù)GB7099—2015《糕點、面包衛(wèi)生標準》、GB/T20977—2007《糕點通則》以及GB5009.3—2016《食品中水分的測定》等的要求，小米發(fā)糕的含水量應(yīng)該在34%～44%之間。含水量的多少，影響著小米發(fā)糕的口感，含水量太低的話，嚼起來比較干澀。由圖1可知，LA1-28和LA6-34乳酸菌蒸制的小米含水量均大于44%，不符合標準，其余的小米發(fā)糕均符合要求，與面團含水量結(jié)果一致。但相對來說LA1-46、LA6-35和LA6-40乳酸菌蒸制的小米發(fā)糕含水量適中，口感較好。

圖1 小米發(fā)糕面團(a)和發(fā)糕含水量(b)

圖2 小米發(fā)糕pH值(a)和總酸度(TTA值)(b)

2.3.2乳酸菌對小米發(fā)糕pH值和總酸度(TTA值)的影響

小米發(fā)糕樣品的酸度測定結(jié)果見圖2。所有樣品的pH值處于4.92～6.26之間，TTA值4.9～10.1，國內(nèi)外鮮有小米發(fā)糕相關(guān)報道，與國內(nèi)外已報道的面制品的酸度基本一致[18]。其中，LA6-29乳酸菌對小米發(fā)糕面團pH值與TTA值與其他樣品相差較大，pH最大，TTA值較低?？偹岫?TTA值)的測定可以發(fā)現(xiàn)，LA6-39乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕pH值最小，產(chǎn)酸最多，發(fā)酵效果最好。LA1-24乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕pH值最大，產(chǎn)酸最少，發(fā)酵效果最差。乳酸菌除了主要產(chǎn)生乳酸外，還能促使形成多種新的香味物質(zhì)。但是，如果pH過低也會影響風(fēng)味和口感。參照GB/T21118—2007，總酸度要求5.6～7.2，LA1-46、LA6-10、LA6-16和LA1-28乳酸菌蒸制的發(fā)糕均不符合國際標準。因此，結(jié)合小米發(fā)糕的感官品質(zhì)和水分含量結(jié)果，LA6-35和LA6-40乳酸菌蒸制的小米發(fā)糕風(fēng)味更好。乳酸菌在發(fā)酵過程中，能產(chǎn)生乳酸、醋酸等，降低發(fā)酵制品中pH值，并能合成具有抗菌作用的細菌素，這對于抑制發(fā)酵食品中致病、致腐菌具有重要意義[22]。

2.3.3乳酸菌對小米發(fā)糕糖含量的影響

不同乳酸菌發(fā)酵的樣品，可溶性糖含量的變化也存在差異，由圖3可知，LA6-40乳酸菌發(fā)酵的小米發(fā)糕還原糖含量最高，LA6-28乳酸菌發(fā)酵的小米發(fā)糕還原糖含量最低。單一乳酸菌發(fā)酵的老面團的樣品各可溶性糖含量最高，乳酸菌和酵母菌復(fù)配使用次之[23]，乳酸菌可調(diào)節(jié)面制品的可溶性糖含量，LA6-40乳酸菌對小米發(fā)糕還原糖含量影響最大。糖類在小米發(fā)糕最終的口感方面影響很大，如果糖度過低，其酸味就過高，所以，結(jié)合小米發(fā)糕的感官品質(zhì)和其他結(jié)果，LA6-40乳酸菌發(fā)酵的小米發(fā)糕酸甜適中，風(fēng)味最好。

圖3 小米發(fā)糕還原糖含量

表3 乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕感官評定

2.3.4乳酸菌對小米發(fā)糕感官品質(zhì)的影響

GB/T20977—2007《糕點通則》中對小米發(fā)糕的感官指標要求是以小米發(fā)糕形態(tài)蓬松、色澤金黃均勻、有酒香味、有柔和的發(fā)酵味、口感松軟、酸甜適中、無粘牙現(xiàn)象、切面有細密針眼且分布均勻、加壓后能恢復(fù)現(xiàn)狀為最高分(滿分100分)。由表3可知，經(jīng)過感官評定發(fā)現(xiàn)，LA6-40和LA1-18乳酸菌發(fā)酵下的小米發(fā)糕總分較高，適宜作為發(fā)酵小米發(fā)糕復(fù)配的乳酸菌，與已有報道結(jié)果相同，非小麥粉制品由于面筋蛋白含量較少，在預(yù)防腹腔疾病方面具有積極作用，但不宜通過酵母菌發(fā)酵，而乳酸菌可很好的解決此問題。例：乳酸桿菌比酵母菌降pH能力更強，短乳桿菌可生成更多的雙乙酰，而腸膜樣明串株菌可賦予玉米粉高黏度特性，同時這3種菌株制作的玉米面包具有極佳的感官特性[24]。乳酸菌對小米發(fā)糕品質(zhì)的改良的原因可能是其在發(fā)酵中產(chǎn)生的蛋白酶可在酸性環(huán)境下降解谷蛋白，這種降解可改善面團流變學(xué)特性，使面包獲得更好的質(zhì)地[25]；其不僅可產(chǎn)生乳酸，還能生成乙酸、丙酸等其他有機酸，與發(fā)酵中生成的醇、酮等作用，生成具有獨特風(fēng)味的其他物質(zhì)[26]；起到一定的自然防腐效果[27]。Katina等[28]研究發(fā)現(xiàn)，采用乳酸菌發(fā)酵全谷物面團，不僅能改善面團營養(yǎng)價值，且可為相關(guān)保健制品的研發(fā)提供參考。

2.4 乳酸菌的系統(tǒng)鑒定

乳酸菌在改良MRS平板上的菌落形態(tài)為：直徑約1～3mm、圓形、中間突起、邊緣整齊、表面光滑濕潤、乳白色、菌體黏稠；革蘭氏染色鏡檢為G+短桿菌，短鏈或成鏈或成鏈排列。

以乳酸菌的總DNA為模板，采用細菌16s rDNA通過引物進行擴增，得到單一條帶，大小約為1.5kb的特異性擴增產(chǎn)物。并將PCR產(chǎn)物送公司進行序列測定，具有典型的16s rDNA。由圖3可知，測序菌株與比對菌株以非常高的置信度處于同一分支上，因此可判定，通過BLAST軟件在Genbank中進行序列相似性比對，菌株與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。由系統(tǒng)發(fā)育分析判斷，11株菌株歸屬為食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)(LA1-10、LA1-12、LA1-18、LA1-27、LA1-38、LA6-3、LA6-10、LA6-12、LA6-29、LA6-35、LA6-40)，LA6-8歸屬為融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)，LA6-39歸屬為明串珠菌屬(Leuconostoc)，LA1-24歸屬為檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，LA6-16歸屬為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，LA1-28歸屬為腸桿菌屬(Enterobacter)，LA1-15、LA1-29、LA1-46和LA6-4經(jīng)過多次建樹和其他類別親緣關(guān)系較遠。

注：采用鄰接(Neighbor-Joining)法和p距離公式進行系統(tǒng)發(fā)育分析，括號內(nèi)為GenBank收錄號，每個分支點處的數(shù)字為Bootstrap(1 000次抽樣)的支持百分率，標尺代表0.1%的序列差異度。

酸面團中分離出乳酸菌50多種，絕大多數(shù)是乳桿菌如短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)、融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)等，與報道一致[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，LA6-40制備小米發(fā)糕的綜合感官評價最高，經(jīng)鑒定為食竇魏斯氏菌。其對產(chǎn)品品質(zhì)改良的主要原因可能是食竇魏斯氏菌產(chǎn)生的胞外多糖可改善蕎麥酸面團糖代謝、面包面團面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及面包烘焙特性[30]，融合魏斯氏菌也具備同樣的作用。植物乳桿菌也用于改善糙米糕等產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味[31]。

3 結(jié)論

采用山西地區(qū)五種小米粉樣品制備小米發(fā)糕發(fā)酵劑，其中8號(M1)發(fā)酵劑中乳酸菌數(shù)最少，6號(長谷4號)乳酸菌數(shù)最多。感官評定結(jié)果表明，6號小米粉制備的小米發(fā)糕酸度最大，黏性較大，質(zhì)硬，彈性較低，品質(zhì)最差；1號樣品發(fā)糕酸味適中，質(zhì)地細膩，彈性較好，口感更順滑柔和，品質(zhì)最好。選擇品質(zhì)差異最大的6號和1號發(fā)酵劑作為后續(xù)乳酸菌分離源。共分離乳酸菌91株，革蘭氏染色陽性，葡萄糖產(chǎn)酸陽性，葡萄糖產(chǎn)氣陰性及過氧化氫酶陰性的菌株33株。經(jīng)分子鑒定發(fā)現(xiàn)，食竇魏斯氏菌(11株)、魏斯氏菌屬(18株)和檸檬明串珠菌(4株)，其中優(yōu)勢菌為魏斯氏菌屬。乳酸菌對小米發(fā)糕品質(zhì)影響的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌1-6-40發(fā)酵制備的小米發(fā)糕含水量39.74%，pH6.20，TTA值5.3，還原糖含量2.27g/100g，其感官評分77.1分，其色澤金黃，口感細膩，酸甜適中，咬勁適度，彈性良好。