羅毅,汪敏加,蘇全生,何本翔,鄧友章,高偉強,姜河

(1.成都體育學院附屬醫(yī)院博士后工作站, 四川成都610041;2.成都體育學院運動與健康學院， 四川成都610041;3.成都中醫(yī)藥大學四川成都610075; 4.成都市第一人民醫(yī)院骨科, 四川成都610041)

椎間盤退變是臨床常見的疾病，可引起脊柱疼痛、腰疼、行走困難等多種臨床癥狀，給患者帶來巨大的痛苦，也給社會帶來很大的經(jīng)濟負擔[1]。椎間盤退變的病理過程伴隨著椎間盤細胞、椎間盤細胞外基質(zhì)的減少，而其細胞外基質(zhì)成分主要是蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白，與軟骨細胞相類似[2]，因此可通過誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化成為軟骨細胞來修復(fù)椎間盤退變[3]。因此，促進軟骨生成、修復(fù)具有重要的臨床意義。近年來，利用組織工程技術(shù)達到該目的逐漸成為研究的熱點，富血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)來源于自體，激活后可形成三維多孔結(jié)構(gòu)的凝膠，是組織工程技術(shù)中良好的支架材料[4]。PRP是血小板的濃縮物，富含有多種生長因子，具有極高的生物安全性，可促進細胞生長及組織修復(fù)，并可促進脂肪間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化[5]；肌腱干細胞可從肌腱中分離進行體外培養(yǎng)，具有自我更新能力及成骨、成軟骨、成脂肪分化潛能，可作為組織工程技術(shù)中的種子細胞[6]；TGF-β3是TGF-β超家族的成員，廣泛表達于各種組織中，介導多種干細胞的分化過程，其可促進間充質(zhì)干細胞成肌腱分化[7]，還可促進軟骨前體細胞分化為軟骨細胞[8]，但PRP凝膠及TGF-β3聯(lián)合使用對肌腱干細胞成軟骨分化的影響目前并不清楚，本文通過體外分離培養(yǎng)人跟腱來源肌腱干細胞，對PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對肌腱干細胞成軟骨分化的影響做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基：貨號為11885084、胎牛血清FBS：貨號為11011-8611、PBS緩沖液：貨號為P1022、中性蛋白酶dispase：貨號為D6430、Ⅰ型膠原酶：貨號為C8140、胰蛋白酶-EDTA消化液：貨號為T1300、100×青鏈霉素混合液：貨號為P1400、凝血酶：貨號為T8021、甲苯胺藍染色液：貨號為G2543，Solarbio公司；CD29-PE：貨號為HUTS-21，BD Biosciences公司；CD90-PE：貨號為130-097-932、CD34-FITC：貨號為130-081-001、CD106-FITC：貨號為130-104-124，上海振譽生物科技有限公司；BMP-2：貨號為PHC7141、地塞米松：貨號為D1383，Sigma公司；脯氨酸：貨號為BP1824-ONY，北京百奧萊博科技有限公司； ITS Premix混合液：貨號為092001344，西寶生物科技(上海)股份有限公司；維生素C：貨號為D1184，上海寶曼生物科技有限公司；Sox9、CollagenⅡ、GAPDH引物，上海生工生物工程股份有限公司合成；RNAiso Plus：貨號為9108、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：貨號為RR037Q/A/B、熒光定量PCR試劑盒：貨號為639519，Takara公司；GAPDH兔源一抗：貨號為ab181602、Sox9兔源一抗：貨號為ab185230、CollagenⅡ兔源一抗：貨號為ab34712、羊抗兔二抗：貨號為ab150077，Abcam公司；RIPA裂解液：貨號為P0013K、BCA試劑盒：貨號為P0011，碧云天生物技術(shù)研究所等

1.1.2 儀器

S-520掃描電鏡：日立公司；Model 680酶標儀：美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；CKX53倒置相差顯微鏡：日本Olympus 公司生產(chǎn)；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀、CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀：美國Bio-Rad公司；3900型高通量DNA合成儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；RM2235石蠟切片機：德國Leica公司；Centrifuge 5424R低溫高速離心機：德國 Eppendorf 股份公司等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基的配制

hTSCs完全培養(yǎng)基：在L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 %胎牛血清、100 U/mL的青霉素、鏈霉素混合液混勻。

hTSCs的體外分離、培養(yǎng)：參照文獻[9]，收集醫(yī)院骨科急性跟腱斷裂患者(經(jīng)知情同意)行跟腱縫合修補術(shù)時修剪的跟腱組織，在超凈工作臺中，以加入100 U/mL的青霉素、鏈霉素混合液的PBS漂洗干凈，，剪除表面部分結(jié)締組織，分離得到跟腱組織，將其剪為1 mm3的碎塊置于10 mL離心管中，加入10倍量濃度為1 %dispase酶、Ⅰ型膠原酶的混合液(比例為1∶1)，在37 ℃水浴中消化2 h，采用血清終止消化，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，得到細胞沉淀，加入hTSCs完全培養(yǎng)基混勻，以孔隙為70 μm的細胞篩網(wǎng)過濾形成單細胞懸液，然后以以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，離心管底部的細胞沉淀以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計數(shù)后以5×105個/mL的密度后接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5 % CO2 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次完全培養(yǎng)基(棄去未貼壁細胞)，培養(yǎng)約1周左右，胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻(記為原代細胞)，采用有限稀釋法接種于96孔培養(yǎng)板中，使每孔細胞為1～3個，在37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后標記出單個細胞的孔，待單細胞克隆生長至孔底80 %時，胰酶消化后合并多個單克隆細胞擴大培養(yǎng)，取第1～3代細胞用于后續(xù)實驗。

hTSCs成軟骨分化培養(yǎng)基的配制[10]：在L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 %胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、100μg/mL丙酮酸鹽、40 μg/mL脯氨酸、50 mg/mL ITS Premix混合液(含6.25 mg/mL胰島素、6.25 mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 mg/mL亞硒酸、1.25 mg/m牛血清白蛋白、5.35 mg/mL亞油酸)、500 ng/mL BMP-2、50 mg/L維生素C混勻。

1.2.2 TSCs鑒定

CD29、CD90是hDPSCs的標志抗原，CD34、CD106分別是造血干/祖細胞、血管內(nèi)皮細胞表面的標志抗原[11]。流式細胞術(shù)檢測上述標志抗原：將“1.2.1”中的第2代細胞胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計數(shù)后取含有5×105個細胞的單細胞懸液以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，細胞沉淀中加入300 μL含有1 μg CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD106-FITC抗體的Buffer，4 ℃下避光孵育45 min，PBS 洗2次，12 000 g離心5 min，重懸于300 μL預(yù)冷的PBS中，以PE或FITC標記的同型匹配的IgG作為陰性對照。采用流式細胞儀分選分析，以FlowJo軟件分析結(jié)果，計算陽性表達細胞百分率。

1.2.3 PRP凝膠的制備及其細胞相容性的檢測

“1.2.1”中的患者自體靜脈采血10 ml全血，參照文獻[12]，平分置入含1 ml復(fù)方枸櫞酸鈉的2個10 mL抗凝管中搖勻，以200 g的離心力離心10 min，吸取全部上清液至交界面下2 mm轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，待溶液平衡后再以以200 g的離心力離心10 min，吸去3/4的上清液棄去，剩余部分即為PRP。將PRP與激動劑(由1 mL 10 %氯化鈣與1 000 U凝血酶混合而成)以9∶1的比例混合搖勻，靜置約2 min，形成PRP凝膠，經(jīng)固定、脫水、干燥、導電處理后行掃描電鏡檢測其立體結(jié)構(gòu)。

“1.2.1”中的第2代細胞胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計數(shù)后取細胞濃度為1×106個/mL的單細胞懸液，將其與自體PRP以1∶6的比例混合均勻后，按比例加入激活劑形成凝膠，加入完全培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換一次培養(yǎng)液，1周后經(jīng)上述方法處理后行掃描電鏡掃描檢測PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物。按上述方法制備PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物接種在于96孔培養(yǎng)板中，以未加PRP凝膠處理的細胞作為對照組(control)，每組設(shè)4個孔，分別在0 d、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以全自動酶標儀測定450 nm波長下各孔吸光度(optical density，OD)，計算各組細胞在相應(yīng)時間的相對增殖率，以0 d時對照組相對增值率為100 %。公式為：相對增殖率(%)=藥物處理組OD值/0d時對照組OD值×100 %。

1.2.4 細胞處理及分組

以L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將TGF-β3配制為1 μg/mL的儲備液備用?！?.2.1”中的第2代細胞胰酶消化后以完全培養(yǎng)基重懸混勻，計數(shù)后取細胞濃度為1×106個/mL的單細胞懸液接種在2個24孔培養(yǎng)板中，隨機分為對照組(control)、TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組四組，以1.2.3中的方法制備PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物后，根據(jù)分組加入TGF-β3處理細胞(使終濃度為10 ng/mL)[13]，并同時更換所有細胞培養(yǎng)基為成軟骨分化培養(yǎng)基，21 d后，一板細胞control組、TGF-β3組以4 %多聚甲醛固定，PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組取出并固定PRP凝膠-hTSCs復(fù)合物，石蠟包埋后切片，然后做甲苯胺藍染色。另一板細胞用胰酶消化后，分別收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.5 成軟骨分化染色實驗

“1.2.4”中的control組、TGF-β3組細胞，蒸餾水漂洗后，加入甲苯胺藍染色液侵染30min，蒸餾水漂洗后在顯微鏡下觀察，PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組石蠟切片，經(jīng)脫蠟、透明、梯度酒精(由高到低)浸泡、蒸餾水漂洗后，加入甲苯胺藍染色液侵染30 min，蒸餾水漂洗、梯度酒精(由低到高)脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 Sox9、CollagenⅡ表達的檢測

“1.2.4”中收集的細胞，加入RNAiso Plus提取總RNA、操作步驟參照說明書，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行熒光定量PCR反應(yīng)，以GADPH為內(nèi)參基因，操作步驟、反應(yīng)體系的配制、反映條件的設(shè)定依照說明書進行，qRT-PCR引物序列見表1，以2-ΔΔCt的算法對各組兩種基因mRNA相對表達量進行分析。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer Sequence of qRT-PCR

“1.2.4”中收集的各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液吹打均勻，在4 ℃下裂解2 h、以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上清，以BCA試劑盒測定總蛋白濃度，操作步驟參照說明書，調(diào)整各組蛋白濃度使之相同，根據(jù)目的蛋白分子量配制適宜濃度的SDS-PAGE膠，在電泳儀中對各組20 μg蛋白樣品進行電泳分離，轉(zhuǎn)移目的蛋白至PVDF膜上，加入5 %脫脂牛奶，室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST溶液漂洗，加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST溶液漂洗，采用ECL顯色，將條帶置于凝膠成像儀中觀察蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 hTSCs的鑒定結(jié)果

流式細胞檢測結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)傳代的hTSCs CD29、CD90標志抗原的表達分別達到99.08 %、99.88 %，而CD34、CD45、CD133標志抗原的表達分別僅為0.08 %、0.09 %，見圖1，表明本研究分離培養(yǎng)傳代的hTSCs是高純度的肌腱干細胞。

圖1 hDPSCs的流式細胞鑒定結(jié)果Fig.1 Flow cytometric identification of hDPSCs

2.2 PRP凝膠的細胞相容性

對PRP凝膠進行掃描電鏡觀察，可見PRP凝膠形成了立體網(wǎng)狀的三維結(jié)構(gòu)，凝膠的框架由纖維素組成，該結(jié)構(gòu)孔隙均勻，血小板在其中均勻分布，且附著良好。PRP凝膠-hTSCs細胞復(fù)合物也為立體網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，在其中，hTSCs細胞牢牢附著在纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，并且生長情況良好。Control組及PRP凝膠組細胞在7 d后增殖趨于穩(wěn)定，與control相比，PRP凝膠處理的hTSCs相對增值率呈上升趨勢，在7 d后差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

PRP凝膠三維結(jié)構(gòu)

PRP凝膠TSCs復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)

圖3 PRP凝膠對hTSCs增殖的影響Fig.3 Effect of PRP gel on hTSCs proliferation

2.3 PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對肌腱干細胞成軟骨分化的影響

與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細胞成軟骨細胞比例增加(P<0.05)；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細胞成軟骨細胞比例均增加(P<0.05)，見圖4、5。

圖4 各組肌腱干細胞成軟骨分化結(jié)果(×200)Fig.4 Chondrogenic differentiation of tendon stem cells in each group(×200)

圖5 各組肌腱干細胞成軟骨分化細胞比例Fig.5 Proportion of chondrogenic differentiation cells of tendon stem cells in each group

注 A：control組；B：PRP凝膠組；C：TGF-β3組；D：PRP凝膠+ TGF-β3組。與control組相比，aP<0.05；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，bP<0.05。

2.4 各組hTSCs Sox9、CollagenⅡmRNA的表達

與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細胞Sox9、CollagenⅡmRNA的相對表達量增加(P<0.05)；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細胞Sox9、CollagenⅡmRNA的相對表達量均增加(P<0.05)，見圖6。

圖6 各組細胞Sox9、CollagenⅡmRNA的相對表達量Fig.6 Relative expression of Sox9 and Collagen II in cells of each group

注 A：control組；B：PRP凝膠組；C：TGF-β3組；D：PRP凝膠+ TGF-β3組。與control組相比，aP<0.05；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，bP<0.05。

2.5 各組hTSCs Sox9、CollagenⅡ蛋白的表達

與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的相對表達量增加(P<0.05)；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的相對表達量均增加(P<0.05)，見圖7、8。

圖7 各組細胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的免疫印跡檢測結(jié)果
Fig.7 Immunoblotting results of Sox9 and Collagen Ⅱ proteins in cells of each group

圖8 各組細胞Sox9、CollagenⅡ蛋白的相對表達量
Fig.8 Relative expression of Sox9 and Collagen Ⅱ proteins in cells of each group

注 A：control組；B：PRP凝膠組；C：TGF-β3組；D：PRP凝膠+ TGF-β3組。與control組相比，aP<0.05；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，bP<0.05。

3 討論

椎間盤退變的主要機制是細胞外基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量減少，進而造成椎間盤高度逐漸降低，同時引起椎間盤負重關(guān)節(jié)面及其他結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)改變，因細胞外基質(zhì)的主要成分與軟骨細胞成分相類似[14]，通過組織工程技術(shù)促使種子細胞向軟骨分化提高椎間盤細胞外基質(zhì)的含量，是預(yù)防和治療椎間盤退變的一條重要策略。性能優(yōu)良的支架材料及合適的種子細胞的選取是目前構(gòu)建可注射組織工程骨的關(guān)鍵步驟，肌腱干細胞(TSCs)是2007年學者首次從肌腱中分離出的能自我更新的細胞，該細胞具有多向分化潛能，即可向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞分化，可作為組織工程技術(shù)中合適的種子細胞[15]。研究表明，TSCs在體外培養(yǎng)時相比種子細胞骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)表現(xiàn)出更快地增殖速度以及更高的分化潛能，取代BMSCs作為股骨頭壞死組織修復(fù)中的種子細胞，治療股骨頭壞死療效更好[16]。PRP凝膠是自體血液兩次離心后，激活得到的具有三維立體結(jié)果的膠體，無免疫源性，是組織工程技術(shù)中良好的支架材料，含有高濃度的血小板及大量的生長因子，有利于促進種子細胞增殖、分化[17]。研究表明，PRP作為支架材料，和BMSCs具有良好的生物相容性，并能在一定程度上促進BMSCs成軟骨分化[18]，TSCs分化時受到生物活性因子、細胞外基質(zhì)的改變、生物支架材料的選擇等多種因素的影響[19]，因而預(yù)計PRP凝膠可能促TSCs成軟骨分化。研究表明，TGF-β3可介導大鼠跟腱來源肌腱干細胞多方向分化，短時間、低濃度的TGF-β3刺激會抑制TSCs向非肌腱方向分化，而高濃度、長時間TGF-β3刺激會促進其向成骨、成軟骨等方向分化[20]，但PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對肌腱干細胞成軟骨分化的影響目前并不明確，本研究分離、培養(yǎng)了人肌腱中TSCs，采用流式細胞技術(shù)檢測了細胞表面抗原，結(jié)果顯示細胞高表達干細胞標記物CD29和CD90，與BMSCs表面標記物相似，而造血干/祖細胞表面標記物CD34、血管內(nèi)皮細胞表面標記物CD106的表達呈陰性，表明本研究提取的TSCs非血液細胞來源，且未受其污染，揭示本研究從人肌腱中分離、培養(yǎng)出了高純度的TSCs，為后續(xù)研究打下了良好的基礎(chǔ)。后續(xù)研究結(jié)果顯示，PRP凝膠具有良好的細胞相容性，并對hTSCs有一定的促增殖作用。與control組相比，TGF-β3組、PRP凝膠組、PRP凝膠+ TGF-β3組細胞成軟骨細胞比例、Sox9、CollagenⅡ表達均增加；與TGF-β3組、PRP凝膠組分別相比，PRP凝膠+ TGF-β3組細胞成軟骨細胞比例、Sox9、CollagenⅡ表達均增加。表明PRP凝膠和hTSCs具有良好的生物相容性，可促其增殖，和TGF-β3相同，可促其成軟骨分化，兩者聯(lián)合其促成軟骨分化作用進一步增強。揭示PRP凝膠和hTSCs可能是構(gòu)建可注射組織工程骨合適的支架材料及種子細胞，TGF-β3可促進其成軟骨分化。

綜上所述，PRP凝膠、TGF-β3都對人肌腱干細胞的成軟骨分化能力有促進作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)調(diào)作用，這為臨床上利用組織工程技術(shù)預(yù)防和治療椎間盤退變，構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷、股骨頭壞死等提供了新的參考，但PRP凝膠聯(lián)合TGF-β3對hTSCs成骨、成脂分化的影響本研究未進行探討，還需要進一步的深入研究。