呂建林,柳琳琳,張文富,王光耀,胡振斌,毛德文*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 廣西南寧530023; 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西南寧530001)

肝衰竭(liver failure，LF)是臨床常見的多種因素形成的肝功能嚴(yán)重障礙性疾病，具有極高病死率[1]。由于形成LF病因較多，如肝炎病毒、藥物(肝毒性物質(zhì))、膽道疾病及代謝異常等多因素均可引起LF，一旦發(fā)病即出現(xiàn)一系列如黃疸、腹水、肝性腦病等臨床癥候群，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對LF的治療多為對癥治療，尚未有特效藥物[2]。根據(jù)LF癥狀體征，多屬中醫(yī)急黃、臌脹及黃疸等范疇。隨著各代中醫(yī)家對LF的病因認(rèn)識與治療，逐步形成解毒化瘀、補(bǔ)陽祛瘀解毒、清熱祛濕解毒等治法[3-5]。因此運用現(xiàn)代技術(shù)挖掘現(xiàn)有各代中醫(yī)家治療LF的文獻(xiàn)資料，得出治療LF的用藥規(guī)律，同時結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從微觀層面分析所得組方用藥核心藥團(tuán)的作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)中醫(yī)處方藥物配伍的潛在機(jī)制，以期為LF的臨床及實驗研究作出貢獻(xiàn)。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)(處方)來源

以“肝衰竭”、“中醫(yī)治療”、“中藥治療”、“中醫(yī)藥治療”、“中醫(yī)”、“中藥”、“中醫(yī)藥”、“l(fā)iver failure”, “LF”,“traditional Chinese medicine treatment”, “traditional Chinese medicine”, “traditional Chinese medicine”, “traditional Chinese medicine”等為主題詞，檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國知網(wǎng)(CNKI)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)、萬方(WanFang)和維普(VIP)數(shù)據(jù)庫所有與肝衰竭相關(guān)的文獻(xiàn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

運用中藥處方治療LF的臨床研究，明確提供中醫(yī)大家配伍用藥經(jīng)驗及全部中藥處方組成的期刊文獻(xiàn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

排除基礎(chǔ)研究及非臨床研究，排除中西醫(yī)結(jié)合治療LF的臨床研究，排除重復(fù)中藥處方及無具體中藥處方的期刊文獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)篩選后得154篇期刊文獻(xiàn)，154劑/張臨床中藥處方數(shù)據(jù)，參考《中藥大辭典》和《中藥學(xué)》(十二五教材)對所得處方用藥名稱、功能分類進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范整理，遵循客觀原則進(jìn)行信息提取，將所得數(shù)據(jù)使用 Excel軟件建立“肝衰竭(LF)處方用藥”數(shù)據(jù)庫，通過二分類變量形式錄入處方用藥信息，為確保處方用藥信息錄入準(zhǔn)確無誤，數(shù)據(jù)的錄入以數(shù)據(jù)員1及數(shù)據(jù)員2交叉核對的形式進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)挖掘分析

運用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計；SPSS Modeler對數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，獲得治療肝衰竭(LF)核心藥團(tuán)；SPSS Statistics對數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析。

1.5.2 網(wǎng)絡(luò)藥理分析

在TCMSP、 SymMap、TCM-ID數(shù)據(jù)庫平臺檢索肝衰竭(LF)核心藥團(tuán)的所有化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30 %及類藥性(drug—likeness，DL)≥0.18的藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)選取藥物活性成分；通過Pharmmapper數(shù)據(jù)庫篩除重復(fù)靶點，并將肝衰竭(LF)核心藥團(tuán)的化合物潛在靶點上傳至UniProt數(shù)據(jù)庫中篩選物種為“Homo sapiens”的靶點作為核心藥團(tuán)作用于肝衰竭(LF)的有效作用靶點；將所得肝衰竭(LF)核心藥團(tuán)潛在靶點信息上傳STRING獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫上所獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析，并行拓?fù)鋵W(xué)網(wǎng)絡(luò)分析和評估節(jié)點在全網(wǎng)絡(luò)中的重要程度；篩選TTD、Genecards數(shù)據(jù)庫綜合得出肝衰竭(LF)相關(guān)靶點，利用Venn分析工具，將兩者與肝衰竭(LF)核心藥團(tuán)潛在靶點進(jìn)行比對分析；篩選David數(shù)據(jù)庫，對核心藥團(tuán)對肝衰竭(LF)的作用靶點進(jìn)行GO及KEGG分析，且利用“富集因子=目標(biāo)基因集中屬于該通路的基因數(shù)量/背景基因集中該通路所有基因的數(shù)量”計算出富集因子，最后繪制氣泡圖。

2 數(shù)據(jù)挖掘方面

2.1 用藥頻次統(tǒng)計

將所納入期刊文獻(xiàn)中154首臨床處方的全部中藥按降序排列，共有186種中藥，累計出現(xiàn)8 040次。在154首臨床處方中，使用頻次≥20次的中藥共有20種，累計頻率3 060次，包含有清熱藥(兼涼血、解毒、燥濕、瀉火)6味，利濕藥(兼退黃、消腫)5味，補(bǔ)氣藥3味，活血化瘀藥2味，溫里藥1味，瀉下藥1味，解表藥1味，開竅藥1味。使用頻次最多的前10味中藥分別是茵陳(119次)、赤芍(94次)、大黃(87次)、梔子(59次)、丹參(59次)、茯苓(57次)、白術(shù)(51次)、郁金(42次)、甘草(42次)及虎杖(38次)。使用頻次≥20次的中藥見表1。

表1 中藥用藥頻次1Tab.1 Frequency of Chinese medicine

注1：頻次≥20次。

2.2 高頻中藥關(guān)聯(lián)分析

高頻中藥關(guān)聯(lián)通過SPSS Modeler軟件運用Aprioi算法對高頻中藥(頻次≥20次)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，設(shè)置前項數(shù)為5，最低條件支持度為10 %，最小規(guī)則置信度為100 %，共得到10個高頻中藥組合，其中支持度最高的肝衰竭(LF)核心藥團(tuán)(13.725 %)是茵陳→白術(shù)→大黃，所得高頻中藥組合的提升度均>1 %，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。高頻中藥關(guān)聯(lián)組合見表2，高頻中藥間關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)見圖1。

表2 高頻中藥關(guān)聯(lián)分析Tab.2 Analysis of association rules of high frequency Chinese medicine

圖1 高頻中藥間關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
Fig.1 Association network display between high frequency Chinese medicine

2.3 高頻中藥因子分析

對高頻中藥(頻次≥20)運用SPSS Statistic進(jìn)行因子分析，統(tǒng)計得出KMO量數(shù)為0.538，巴特利特檢驗中，P=0.000，提示因子分析可行。取初始值大于1的成分共有8個，因子累計貢獻(xiàn)率為64.546 %，顯示該因子分析結(jié)果可包涵大部分信息，使用全體旋轉(zhuǎn)法得出旋轉(zhuǎn)矩陣成分圖(圖2)。將中藥歸于因子貢獻(xiàn)率最高的公因子中，可得8個公因子，具體見表3。

圖2 因子分析成分圖Fig.2 Factor analysis composition diagram

表3 高頻中藥因子分析信息表Tab.3 High frequency Chinese medicine factor analysis information table

3 網(wǎng)絡(luò)藥理方面

3.1 LF核心藥團(tuán)化學(xué)成分

檢索TCMSP、 SymMap、TCM-ID數(shù)據(jù)庫獲取LF核心藥團(tuán)(茵陳→白術(shù)→大黃)化學(xué)成分，共獲取200個化合物，其中茵陳53個、白術(shù)55個、大黃92個。根據(jù)口服利用度(OB≥30 %)及藥物相似性(DL≥0.18)篩選得出茵陳13個、白術(shù)7個、大黃16個?；衔锇刑J薈大黃素(aloe-emodin)、毛細(xì)血管素(capillarisin)、異鼠李素(isorhamnetin)等，LF核心藥團(tuán)各個有效成分的OB、DL值見表4。

表4 LF核心藥團(tuán)化學(xué)成分1Tab.4 LF core drug group chemical composition table

注1：根據(jù)OB值降序排列。A：茵陳；B：白術(shù)；C：大黃。

3.2 LF核心藥團(tuán)化學(xué)成分潛在靶點及相互作用

根據(jù)匹配度將獲得的潛在靶點進(jìn)行降序排列，選取LF核心藥團(tuán)化學(xué)成分的前十個蛋白進(jìn)行下一步研究，共得350個。剔除相同的靶點后，最終得到102個靶點。包括PTGS2、HSP90AA1、DPP4、NCOA2、PTGS1等靶點。其中網(wǎng)絡(luò)度數(shù)值越大，提示核心藥團(tuán)通過該靶點治療LF的可能性越大，具體參數(shù)見表5，靶點相互作用關(guān)系圖見圖 3。

圖3 核心藥團(tuán)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein interaction network diagram of core drug group

表5 核心藥團(tuán)化學(xué)成分化學(xué)成分—作用靶點參數(shù)Tab.5 Chemical composition-target parameters of core pellets

3.3 LF相關(guān)靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建及比對分析

圖4 核心藥團(tuán)作用靶點與LF靶點的韋恩圖Fig.4 Venn diagram of core drug group target and LF target

查詢TTD數(shù)據(jù)庫，獲得6個經(jīng)實驗及臨床試驗的藥物治療性靶點，其中有0個與核心藥團(tuán)的潛在靶點重合；初步篩選Genecards數(shù)據(jù)庫得出1 438個候選基因，依據(jù)“Relevance score”度取相關(guān)度最高的前300個結(jié)果，與核心藥團(tuán)(茵陳→白術(shù)→大黃)靶點重合的有20個。通過合并數(shù)據(jù)庫法查詢后，共篩選出305個LF高度相關(guān)性靶點，與核心藥團(tuán)(茵陳→白術(shù)→大黃)有20個重疊靶點，所得韋恩圖見圖4。

3.4 核心藥團(tuán)主要活性成分對LF作用靶點的生物信息學(xué)分析

通過David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析，富集出28個生物學(xué)過程，其中包含一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、膠原分解代謝過程(collagen catabolic process)、細(xì)胞外基質(zhì)拆卸(extracellular matrix disassembly)、蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控(positive regulation of protein kinase B signaling)等。4個細(xì)胞組成，其中包括細(xì)胞外空間(extracellular space)、細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region)、蛋白質(zhì)性細(xì)胞外基質(zhì)(proteinaceous extracellular matrix)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)等。以及12個分子功能，絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、酶結(jié)合(enzyme binding)、咖啡因氧化酶活性(caffeine oxidase activity)、金屬內(nèi)肽酶活性(metalloendopeptidase activity)等。具體相關(guān)分類見圖5。

圖5 核心藥團(tuán)對LF作用靶點的GO分析結(jié)果Fig.5 Results of GO analysis of core drug group on LF target

進(jìn)行KEGG分析可得到11條信號通路，其中包含有TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路及FoxO信號通路，KEGG分析結(jié)果見表6；利用“富集因子=目標(biāo)基因集中屬于該通路的基因數(shù)量/背景基因集中該通路所有基因的數(shù)量”計算出富集因子，并繪制氣泡圖，見圖6。

表6 核心藥團(tuán)對LF作用靶點的KEGG分析結(jié)果Tab.6 Results of KEGG analysis of Core drug group on LF target

圖6 核心藥團(tuán)對LF作用靶點KEGG分析的氣泡圖
Fig.6 Bubble map of KEGG analysis of targets of core drug group on liver failure

4 討論

數(shù)據(jù)挖掘方面，處方用藥統(tǒng)計后顯示，治療肝衰竭(LF)的高頻用藥以清熱藥和利濕藥為主，輔以活血化瘀藥、補(bǔ)氣藥及瀉下藥。清熱藥以“清泄里熱”為主功效，其中不少清熱藥功效廣泛，同時有瀉火、涼血和解毒的作用。利濕藥以“滲泄水濕、通利水道”為主，根據(jù)各類藥物功效可分為利濕退黃、通淋和利水消腫三類。提示對LF的臨床用藥，可注重選用清熱藥及利濕藥，如清熱瀉火，兼涼血、解毒及清利濕熱的梔子；以利濕為主，兼可退黃、清熱解毒的茵陳、虎杖；具有利水滲濕，兼有健脾作用的茯苓。隨證輔以郁金活血涼血利膽退黃，白術(shù)補(bǔ)氣健脾燥濕利尿，大黃清泄?jié)駸釣a火解毒等活血化瘀、補(bǔ)虛、瀉下等藥物。這也符合清熱利濕為主，兼化瘀解毒的中醫(yī)治療法則。

高頻中藥關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度的最高的高頻中藥組合有10個，置信度均為100 %，提示10個LF高頻中藥組合預(yù)測準(zhǔn)確程度可信。其中支持度最高的LF核心藥團(tuán)是茵陳→白術(shù)→大黃，余為茵陳→金錢草、茵陳→白花蛇舌草、茵陳→金錢草→大黃、茵陳→郁金→丹參→大黃、茵陳→白花蛇舌草→赤芍、茵陳→柴胡→大黃、茵陳→虎杖→郁金、大黃→郁金→梔子→赤芍、茵陳→郁金→丹參→大黃→赤芍。由此得出，對于LF的臨床用藥需注重利濕藥—補(bǔ)虛藥—瀉下藥及利濕藥—清熱藥—活血化瘀藥—瀉下藥的配伍應(yīng)用，提示此配伍可作為LF臨床研究的未來研究方向。

高頻中藥因子分析得出8個公因子，F(xiàn)1梔子、大黃、金錢草、黃芩(清熱—瀉下—利濕—清熱)；F2黃芪、柴胡、赤芍、丹參(補(bǔ)虛—解表—活血化瘀—活血化瘀)；F3虎杖、郁金(利濕—活血化瘀)；F4石菖蒲、白花蛇舌草(開竅—清熱)；F5茯苓、澤瀉(利濕—利濕)；F6牡丹皮、生地黃(清熱—清熱)；F7附子、茵陳、白術(shù)(溫陽—利濕—利濕)；F8甘草(補(bǔ)虛)。可見清熱藥及利濕藥在中醫(yī)藥治療LF中發(fā)揮著重要作用，且注重清熱藥、利濕藥與活血化瘀藥、補(bǔ)虛藥的搭配應(yīng)用。

網(wǎng)絡(luò)藥理方面，篩選LF核心藥團(tuán)(茵陳→白術(shù)→大黃)后發(fā)現(xiàn)部分化合物對肝衰竭具有重要的作用。如蘆薈大黃素(aloe-emodin)、毛細(xì)血管素(capillarisin)、異鼠李素(isorhamnetin)等。經(jīng)研究驗證，蘆薈大黃素具有抗HBV病毒作用，藥效與拉米夫定相當(dāng)，而且蘆薈大黃素具有激活CYP3A4的特性，可增強(qiáng)抗HBV的療效[6]。實驗研究表明，毛細(xì)血管通過至少兩種不同的途徑對大鼠原代肝細(xì)胞中t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性具有抑制作用[7]。亦有研究[8]發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管素在保護(hù)肝功能方面具有強(qiáng)保護(hù)作用。實驗結(jié)果[9]顯示毛細(xì)血管素可抑制脂多糖(LPS)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、IL-1β、NO及PGE2，且能抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)及NF-κB和MAPKs的活化，即毛細(xì)血管素可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥。經(jīng)實驗[10]發(fā)現(xiàn)異鼠李素可抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成和自噬，能顯著抑制肝纖維化。同時研究表明異鼠李素在肝纖維化和肝纖維化模型中均具有抗纖維化活性[11]。LF核心藥團(tuán)的化合物靶點網(wǎng)絡(luò)中，起重要作用的靶點有PTGS2、HSP90AA1、DPP4、PTGS1等。這些靶點與抗肝纖維化[12、13]、保護(hù)肝功能[13]等過程有關(guān)，且部分存在著協(xié)同作用。

分析LF核心藥團(tuán)靶點網(wǎng)絡(luò)時發(fā)現(xiàn)核心藥團(tuán)中存在多個與保護(hù)肝功能、抗肝炎病毒、抗肝纖維化相關(guān)的重要靶點。為此對LF核心藥團(tuán)作用于LF的作用靶點進(jìn)行進(jìn)一步的GO功能及KEGG通路分析。GO功能分析中發(fā)現(xiàn)LF核心藥團(tuán)對一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、膠原分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)拆卸的作用。在KEGG道路分析中發(fā)現(xiàn)TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路及FoxO信號通路等信號通路所含基因大致相似，如IL6、MAPK14、IL1B等，各信號通路通過研究表明與LF相關(guān)。實驗結(jié)果顯示BAPTA-AM脂質(zhì)體(BAL)在急性肝衰竭(ALF)小鼠模型中可逆轉(zhuǎn)形態(tài)變化并調(diào)節(jié)TNF-α和NF-κB表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞中LPS刺激的炎癥反應(yīng)，從而有效治療肝衰竭[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]負(fù)調(diào)節(jié)NOD樣受體3(NLRP3)表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子microRNA-223在慢性肝損傷及其他肝臟疾病中起重要作用，且發(fā)現(xiàn)miR-223的類似物miR-2233p可下調(diào)急性肝炎的炎癥因子IL6和IL12以及趨化因子Ccl2，Ccl3，Cxcl1和Cxcl2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在慢性肝損傷中可顯著緩解纖維化發(fā)展和肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，提示負(fù)調(diào)控NOD樣受體信號通路可用于治療急慢性肝損傷性疾病。GTE可通過降低內(nèi)毒素-TLR4(Toll樣受體4)-NFκB(核因子kappa-B)的炎癥來緩解非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[16]。

本研究運用現(xiàn)代技術(shù)挖掘中醫(yī)藥治療LF的臨床數(shù)據(jù)，從而得出治療LF的處方用藥規(guī)律及LF核心藥團(tuán)。進(jìn)一步運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從微觀層面初探LF核心藥團(tuán)治療LF的相關(guān)潛在靶點、復(fù)雜生物學(xué)過程和通路機(jī)制，以期為后續(xù)涵括LF核心藥團(tuán)新處方的有效成分及作用機(jī)制提供前期理論基礎(chǔ)，更好地論述LF中藥成方應(yīng)用的科學(xué)性，給臨床用藥提供理論支持。