宋 娟 呂成志 王 棟 丁 峰 于緒東

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶提取物茶多酚的主要活性成分，約占兒茶素總含量的80%。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG作為一種天然的抗氧劑，能夠清除機體內的活性氧，有效地抑制氧化應激，從而保護黑素細胞[1]。另一種中藥材補骨脂是較強的黑色素促進劑，能增強皮膚對紫外線的效應，使酪氨酸酶活性增加，促進黑色素的形成和轉運[2,3]。因此，聯(lián)合應用天然無毒的EGCG和補骨脂對白癜風的治療具有很高的臨床價值，然而，補骨脂中的異補骨脂素為水難溶性藥物，存在皮膚滲透性差的缺陷，生物利用度低，致使其很難滲透至皮膚深層，EGCG較差的穩(wěn)定性及較弱的皮膚滲透性進一步限制了其在白癜風治療中的應用。脂質體是由脂質雙分子層組成閉合囊泡，具有生物相容性好、制備工藝簡單、同時包載水溶性和脂溶性的藥物、性質穩(wěn)定、皮膚滲透性及滯留性強等特點。本文將EGCG及補骨脂共同包載于脂質體中首次制備了EGCG-補骨脂脂質體(EGCG- PL)，并對其體外透皮性質進行檢測。

1 材料

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀(1525 Binary泵、2487 UV檢測器、Breeze色譜工作站，美國Waters公司)；TK-12A型 Franz擴散池(上海鍇凱科技貿易有限公司)；BS110S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；JY92-II 型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；LP 220S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；Nano ZS90粒度儀(英國Malvern公司)；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥 EGCG(杭州禾田生物科技有限公司，純度98%)；大豆卵磷脂(北京奧博星生物技術有限公司)；乙醇(大連川連酒廠)；膽固醇(廣州南方化玻公司)。

2 方法

2.1 逆向蒸發(fā)法制備EGCG-PL 稱取磷脂、VE及膽固醇溶解于有機溶劑中，得到有機相；EGCG和穩(wěn)定劑M形成復合物的水溶液即為水相；然后將水相與有機相混合(1∶3，V/V)，進行超聲分散，直至形成穩(wěn)定的W/O型乳劑，40℃減壓旋蒸，除去有機溶劑后，加入水化介質，在40℃水浴中旋轉充分水化，然后在減壓條件下繼續(xù)蒸發(fā)殘存的有機溶劑，隨后加入3 mL補骨脂的乙醇溶液，40℃攪拌2 min， 0.22 μm微孔濾膜過濾，即得EGCG- PL。

2.2 EGCG-PL質量評價

2.2.1 EGCG-PL的外觀 采用目測法，觀察EGCG-PL的外觀。

2.2.2 EGCG-PL的粒徑及Zeta電位 取EGCG-PL適量，以水為稀釋介質，用激光粒度測定儀測定EGCG-PL的粒度及其分布和Zeta電位。

2.2.3 pH值 采用PB-10型pH計對EGCG-PL的pH值進行測定。

2.2.4 超濾-HPLC測定EGCG-PL的包封率 精密量取EGCG-PL 0.4 mL置10 mL量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，取稀釋后的樣品，置超濾離心管中(超濾膜截留分子量為50 KDa)，10000 rpm離心20 min，測定游離藥物濃度(C游離)，另精密量取EGCG-PL 0.2 mL兩份分別置10 mL的量瓶中，加一定量的甲醇后超聲，其中一份加甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2稀釋至刻度，另一份加甲醇稀釋至刻度，測定總藥量(C)，按如下公式計算EGCG-PL中藥物的包封率。包封率(%)=(C-C游離)/C×100%。

2.2.5 EGCG-PL中藥物含量測定

(1)HPLC 色譜條件 色譜柱：Elite-ODS柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶水=40∶60；柱溫：30℃；流速：1.1 mL·min-1；檢測波長：246 nm；進樣量：20 μL。

測定方法：精密量取0.2 mL EGCG-PL置10 mL量瓶中，加入5 mL甲醇后超聲，采用甲醇稀釋至刻度。取上清液過0.45 μm濾膜。精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用標準曲線法計算補骨脂素及異補骨脂素的含量。

(2)專屬性 空白脂質體溶液：精密量取 0.2 mL不含補骨脂的空白脂質體溶液置10 mL量瓶中，按“(1)中測定方法”進行操作，精密量取續(xù)濾液20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。

標準溶液：取“線性關系”項下5.0 μg·mL-1溶液，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。

供試品溶液：精密量取 0.2 mL EGCG-PL 溶液置10 mL量瓶中，按“(1)中測定方法”項下操作，精密量取續(xù)濾液20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。

(3)線性關系 精密稱取補骨脂素及異補骨脂素對照品 10.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別配制成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0及 50.0 μg·mL-1系列標準溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以補骨脂素及異補骨脂素的峰面積A對質量濃度C進行線性回歸。

(4)準確度 精密量取0.2 mL空白脂質體溶液置10 mL量瓶中，分別加入0.1 mL低、中、高三個濃度的補骨脂素及異補骨脂素標準溶液，渦旋30 s，加甲醇5 mL超聲1 min后，加甲醇稀釋至刻度，取上清液過0.45 μm濾膜。精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算低、中、高三個濃度平均回收率。

(5)精密度 取“線性關系”項下5.0 μg·mL-1溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復進樣6次，計算峰面積的相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值。

(6)穩(wěn)定性 取供試品溶液，室溫放置，分別于0 h和4 h精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰面積，計算不同時間色譜峰面積的相對標準偏差(Relative Stanclard Deviation, RSD)值。

2.2.6 EGCG-PL的穩(wěn)定性 取EGCG-PL置于西林瓶中，密封，放置在(6±2)℃下，于0 d及30 d取樣，檢測EGCG-PL外觀、pH值、含量及包封率變化。

2.3 大鼠體外經皮滲透性及皮膚滯留量考察

2.3.1 Franz擴散裝置進行體外經皮滲透性試驗 將處理好的大鼠皮膚固定于供給池和接受池之間，分別取2 mL EGCG-PL及EGCG-補骨脂乙醇溶液(EGCG-PS)，置于供給池中并將其頂部密封。通過取樣管向接受池中注滿20%的乙醇溶液，接受液與鼠皮充分接觸且無氣泡。將該裝置置于(32±0.5)℃恒溫水浴中，磁力攪拌速度為400 r/min，分別于0.5、1、30、5、8、12、24 h取出5 mL接受液，0.45 μm微孔濾膜過濾，并立即補加同溫同體積新鮮接受液，排除接受池中的氣泡，采用 HPLC法測定不同時間接受液中EGCG、補骨脂素及異補骨脂素的濃度，按如下公式計算單位面積累積透過量(Q)。以時間(t)為橫坐標，Q為縱坐標作圖，得到藥物體外經皮滲透曲線。Q=Cn?！罺/A；Cn校=Cn測+Vi/V×ΣCp。式中Q為t時間單位面積累積透過量(μg/cm-2)， Cn校和Cn測分別為校正后第n次取樣測得接受液中藥物的濃度；V和Vi分別為接受液的總體積和每次取樣體積；ΣCp為該取樣點前各點的測定濃度之和；A為有效透皮擴散面積。

2.3.2 皮膚內藥物滯留量試驗 體外透皮試驗24 h結束后，取下鼠皮，反復用20%乙醇及蒸餾水洗凈皮膚表面殘存藥物，濾紙吸干溶劑后剪去周邊的皮膚，稱重，將皮膚剪碎，置于超聲管中，加入5 mL甲醇，超聲5 min，將上清液移入至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過濾，取續(xù)濾液加流動相對倍稀釋后，過0.45 μm 濾膜，精密量取20 μL進樣，測定皮膚中滯留的藥物濃度，計算單位面積皮膚中EGCG、補骨脂素及異補骨脂素的滯留量。

3 結果

3.1 EGCG-PL質量評價

3.1.1 EGCG-PL的外觀 見圖1。

圖1 肉眼觀察EGCG-PL為棕色半透明乳狀液，且?guī)黠@的乳光

3.1.2 EGCG-PL粒徑及Zeta電位 采用逆向蒸發(fā)法制備的EGCG-PL粒徑分布均勻(圖2)，平均粒徑為(118.1±17.0) nm，PDI為0.20±0.07，Zeta電位為-29.3 mV，EGCG-PL所帶相同電荷之間的排斥作用能有效阻止脂質體的聚集，提高EGCG-PL穩(wěn)定性。

圖2 EGCG-PL的粒徑分布

3.1.3 pH值 本文測得EGCG-PL的pH值為5.84±0.11，有利于脂質體和藥物的穩(wěn)定性。

3.1.4 EGCG-PL的包封率 采用超濾-HPLC測定EGCG-PL中EGCG的平均包封率為(85.58±1.07)%，補骨脂素及異補骨脂素的平均包封率分別為(55.49±2.82)%和(53.73±1.29)%。

3.1.5 EGCG-PL中藥物含量測定

(1)專屬性 各樣品色譜圖(圖3)表明，空白脂質體溶液對藥物的測定無干擾，該方法具有良好的專屬性。

圖33a空白脂質體的液相色譜圖;3b標準溶液的液相色譜圖;3c EGCG-PL的液相色譜圖

(2)線性關系 以補骨脂素及異補骨脂素的峰面積A對質量濃度C進行線性回歸，得到補骨脂素標準曲線的回歸方程為：A=101356C+6561.9，r=0.9999，異補骨脂素的回歸方程為A=104590C+14208，r=0.9999，表明補骨脂素及異補骨脂素在1.0～50.0 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

(3)準確度 通過計算得到補骨脂素低、中、高三個濃度平均回收率分別為100.84%、99.78%、100.95%(n=3)，RSD分別為1.81%、1.54%、1.13%，異補骨脂素低、中、高三個濃度平均回收率分別為99.51%、100.19%、100.48%(n=3)，RSD 分別為 1.00%、0.47%、0.14%，回收率均符合要求。

(4)精密度 精密度試驗結果見表1。結果表明，補骨脂素峰面積的RSD為0.89%，異補骨脂素峰面積的RSD為1.07%，表明該方法精密度符合要求。

表1 精密度試驗結果

(5)穩(wěn)定性 供試品溶液放置4 h補骨脂素峰面積的 RSD為0.86%，異補骨脂素峰面積的RSD為1.35%，表明供試品溶液在室溫放置4 h穩(wěn)定。

(6)含量測定 采用上述驗證的HPLC法對所制備的三批EGCG-PL中EGCG、補骨脂素及異補骨脂素的含量進行測定。結果表明，三批樣品中EGCG的含量為(1.29±0.10)mg·mL-1，補骨脂素及異補骨脂素含量分別為(223.01±16.81)μg·mL-1和 (195.13±8.46)μg·mL-1。

3.1.6 EGCG-PL的穩(wěn)定性 見表2。EGCG-PL在(6±2)℃條件下放置30天后，與0天時樣品相比，脂質體未見分層，三種主藥包封率及含量無明顯變化，說明EGCG-PL長期放置物理穩(wěn)定性良好。

3.2 大鼠體外經皮滲透性及皮膚滯留量考察

3.2.1 體外經皮滲透性試驗 體外經皮滲透曲線結果(圖4)示：與EGCG-PS相比，EGCG-PL中EGCG、補骨脂素及異補骨脂素較易透過皮膚進入接受液中，其24 h單位面積累積透過量分別是EGCG-PS組的1.94、2.24及2.19倍。

表2 EGCG-PL穩(wěn)定性

圖44a:EGCG累積滲透曲線;4b:補骨脂素累積滲透曲線;4c:異補骨脂素累積滲透曲線

3.2.2 皮膚內藥物滯留量試驗 單位面積皮膚中EGCG、補骨脂素及異補骨脂素的滯留量結果如表3，由表可知，EGCG-PL的大鼠皮膚內EGCG、補骨脂素及異補骨脂素的滯留量要明顯高于EGCG-PS組。

表3 兩種EGCG制劑單位面積皮內藥物滯留量

注：*P<0.05,☆P<0.001

4 討論

EGCG是一種天然無毒的抗氧劑，通過有效抑制氧化應激產生抗白癜風的作用。然而EGCG不穩(wěn)定，極易在光照、高溫、堿性等條件下發(fā)生分解。本研究證實了將EGCG包載于脂質體中能夠有效的提高藥物穩(wěn)定性，EGCG-PL在沒有避光的條件下放置30 d，EGCG的含量無明顯變化。而在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG在光照條件下放置24 h 藥物降解了16.69%。測定脂質體中藥物含量需加入破膜劑溶解脂質成分，釋放所包封的藥物。本研究檢測了Triton X-100、甲醇及乙腈三種破膜劑對脂質體中藥物含量測定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，Triton X-100在使用過程中容易產生泡沫，干擾定量，將樣品注入液相色譜儀，出現(xiàn)嚴重拖尾，峰型很差。乙腈破膜提取時，樣品回收率較低。選擇甲醇作為破膜溶劑時，樣品回收率符合要求，峰型較好且分析時間適宜，因此，本文最終選用甲醇作為破膜溶劑。體外經皮滲透性試驗結果顯示，EGCG-PL中EGCG、補骨脂素及異補骨脂素的累積透過量及皮膚滯留量要顯著大于EGCG-PS組，這是由于脂質體的納米結構能夠使其緊密的黏附在角質層，形成連貫的具有閉塞效應膜，增加皮膚水合作用，減少水分散失從而提高藥物滲透性；同時脂質體類似于表皮的結構，能進一步提高藥物滲透性；兩種制劑的皮膚滯留量研究發(fā)現(xiàn)，EGCG-PL較EGCG-PS能顯著提高EGCG、補骨脂素及異補骨脂素在皮膚中的滯留量。