吳根土，陳廣香，張珈源，胡橋，馬明鴿，竇彥霞，李明駿，青玲

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轉(zhuǎn)水稻條紋病毒本氏煙的抗病性

吳根土，陳廣香，張珈源，胡橋，馬明鴿，竇彥霞，李明駿，青玲

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物學(xué)重慶市高校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

【目的】編碼的蛋白是水稻條紋病毒（，RSV）RNA沉默抑制子。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)本氏煙（）對(duì)RSV有一定的抗性。為深入揭示NS3在寄主體內(nèi)的作用機(jī)制，本文將進(jìn)一步探究轉(zhuǎn)本氏煙對(duì)其他煙草病害的抗性?！痉椒ā恳砸吧捅臼蠠熀娃D(zhuǎn)本氏煙為試驗(yàn)材料，通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法接種馬鈴薯X病毒（，PVX）侵染性克隆，觀察病毒癥狀，抽提系統(tǒng)發(fā)病葉片總RNA，并利用RT-qPCR方法檢測(cè)病毒的相對(duì)積累量；采用灌根接種法分別接種煙草青枯病菌（）、煙草黑脛病菌（var.），觀察植株表型并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)?！窘Y(jié)果】PVX侵染本氏煙后，植株葉片主要表現(xiàn)為花葉、褪綠等癥狀，表達(dá)植株與野生型植株具有相同的PVX癥狀表現(xiàn)。在接種PVX 10 d后，RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與野生型植株病毒積累量相比，表達(dá)抑制了PVX在本氏煙體內(nèi)的積累水平，兩個(gè)轉(zhuǎn)株系（NS3-6、NS3-9）中PVX的相對(duì)積累量分別為野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害癥狀，且兩者的癥狀無明顯差異。在青枯病菌侵染早期，表達(dá)在一定程度上利于病菌的侵染，表現(xiàn)出對(duì)青枯病較為敏感；而在接種14 d，野生型植株的發(fā)病率為100.00%，病情指數(shù)為78.67，而NS3-6、NS3-9株系的發(fā)病率分別為95.00％、98.33％，病情指數(shù)分別為70.00、73.00；14 d之后發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸升高，而表達(dá)株系的病情指數(shù)均低于野生型植株。黑脛病菌在野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株上均為在莖基部出現(xiàn)黑褐色壞死斑等典型病害癥狀，且表達(dá)也不影響本氏煙的癥狀表現(xiàn)。在黑脛病菌的侵染初期，NS3-6株系的發(fā)病率高于野生型植株；但在整個(gè)黑脛病發(fā)生過程中，轉(zhuǎn)株系的病情指數(shù)均低于野生型植株，在接種12 d，野生型本氏煙的發(fā)病率為96.67％，病情指數(shù)為77.50，而NS3-6、NS3-9株系的發(fā)病率分別為90.00％、86.67％，病情指數(shù)分別為64.17、62.08?！窘Y(jié)論】通過病原侵染過程觀察表明表達(dá)在一定程度上影響了煙草病害在本氏煙上的侵染和嚴(yán)重程度，且對(duì)不同病原菌的影響不同。

水稻條紋病毒；；轉(zhuǎn)基因本氏煙；抗病性

0 引言

【研究意義】植物RNA沉默（RNA silencing）不僅調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，也是抵御病原物侵染的重要機(jī)制[1]。然而，幾乎所有的植物病毒均會(huì)編碼RNA沉默抑制子（viral suppressors of RNA silencing，VSR）來干擾寄主的RNA沉默，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[2-5]。同時(shí)，VSR還可協(xié)助病毒積累，加重病毒病癥狀[6-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，水稻條紋病毒（，RSV）NS3同時(shí)具有作為VSR協(xié)助RSV侵染和作為寄主防衛(wèi)反應(yīng)誘導(dǎo)因子抑制病害發(fā)生的雙重功能[9-10]。本研究繼而以轉(zhuǎn)RSV本氏煙（）為材料，分析其對(duì)煙草重要病害的抗性，對(duì)深入揭示VSR在寄主體內(nèi)的雙重功能具有重要意義，并可為植物抗病育種提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】由RSV引發(fā)的水稻條紋葉枯病在我國(guó)稻區(qū)時(shí)有發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。RSV基因組由4條RNA單鏈（RNA1、RNA2、RNA3、RNA4）組成，共編碼7個(gè)蛋白。除RNA1反義編碼RNA依賴RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）外，其他3條RNA鏈均以雙義編碼策略編碼病毒蛋白，分別含有2個(gè)不重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF），這2個(gè)ORF由具有轉(zhuǎn)錄終止功能的非編碼區(qū)（intergenic region，IR）間隔[12-13]。NS3是RNA3正義鏈編碼的蛋白，被鑒定為RNA沉默抑制子[14]。通過遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)水稻（）和本氏煙，表型觀察發(fā)現(xiàn)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株未呈現(xiàn)生長(zhǎng)異常，因此認(rèn)為其不是癥狀決定因子[9,14]。但是，NS3蛋白在維持病毒與傳播介體昆蟲，病毒與寄主植物的互作過程中起到很大的作用。NS3可以與介體灰飛虱（）體內(nèi)蛋白酶體途徑中的重要因子LsRPN3（regulatory-particle non-ATPase subunit 3）互作，進(jìn)而抑制26S蛋白酶體途徑，幫助昆蟲介體傳播病毒[15]。NS3與OsDRB1（dsRNA-binding protein）互作，增加microRNA（miRNA）的積累，從而有利于RSV在水稻中的侵染和積累[16]。姜良良[17]研究發(fā)現(xiàn)，NS3蛋白與本氏煙核定位蛋白NbPip3（protein interacting with p3）互作，從而促進(jìn)自噬途徑對(duì)NS3降解，參與植物抗RSV侵染的作用途徑。因此，NS3在RSV傳播、侵染及在寄主體內(nèi)積累等過程中均起到一定的作用，其在病原與寄主互作過程中起著多重作用。隨著氣候逐漸變暖和植物產(chǎn)品調(diào)動(dòng)日益頻繁，植物病原物不斷擴(kuò)散及危害加重的可能性增大，為抗病育種工作者帶來挑戰(zhàn)。在抗植物病毒研究中，人們通常是以轉(zhuǎn)入病毒基因來獲取抗病毒材料[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，VSR除了作為RNA沉默抑制子協(xié)助病毒侵染，還可以促使寄主對(duì)其他病原物產(chǎn)生抗性，例如轉(zhuǎn)入煙草蝕紋病毒（，TEV）的植物對(duì)番茄黑斑病毒（，TBRV）和煙草霜霉菌（）抗性增強(qiáng)[21]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期工作中，筆者通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)水稻和本氏煙。轉(zhuǎn)基因水稻接種RSV后發(fā)現(xiàn)，在RSV侵染早期，水稻對(duì)RSV敏感性增強(qiáng)，表現(xiàn)為癥狀加重、病毒積累量增多；而在侵染后期，與野生型植株上的病毒相比，轉(zhuǎn)水稻上病毒癥狀較輕，而病毒積累量卻無明顯變化。進(jìn)一步抗性分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)水稻對(duì)稻瘟病菌（）的抗性增強(qiáng)[9]；在轉(zhuǎn)本氏煙上接種RSV后發(fā)現(xiàn)病毒癥狀較輕，且病毒的發(fā)病率和積累量顯著降低，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)影響了寄主內(nèi)源抗性基因表達(dá)[10]。因此，表達(dá)是否會(huì)通過影響本氏煙抗性基因表達(dá)而增強(qiáng)對(duì)其他病原菌的抗性有待驗(yàn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對(duì)該問題，本研究在轉(zhuǎn)基因本氏煙上分別接種馬鈴薯X病毒（，PVX）、煙草青枯病菌（）、煙草黑脛病菌（var.），觀察發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，為揭示在寄主體內(nèi)的作用機(jī)制和抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年4月至2018年6月在西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)溫室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草：野生型本氏煙（wild-type）、轉(zhuǎn)本氏煙（-transgenic）由筆者實(shí)驗(yàn)室保存，種于西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物溫室中，溫室條件為16 h光照/8 h黑暗，溫度24℃。植株培養(yǎng)至4—6葉期備用。在前期工作中，已對(duì)轉(zhuǎn)本氏煙的生長(zhǎng)發(fā)育與野生型植株進(jìn)行了比較，表達(dá)對(duì)本氏煙發(fā)芽速率、生長(zhǎng)速率、株型、葉型及株高均未造成影響，與野生型植株生長(zhǎng)發(fā)育相一致；同時(shí)，利用PCR技術(shù)及Northern雜交技術(shù)檢測(cè)了陽性植株和基因轉(zhuǎn)錄情況[10]，利用Western雜交技術(shù)檢測(cè)了陽性植株NS3蛋白表達(dá)[22]。

供試菌株：PVX侵染性克隆由寧波大學(xué)植物病毒研究所燕飛研究員提供；青枯病菌為西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)研究室丁偉教授贈(zèng)送；黑脛病菌為筆者實(shí)驗(yàn)室 竇彥霞老師培養(yǎng)、保存。

供試培養(yǎng)基：試驗(yàn)過程使用的培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基、肉汁凍培養(yǎng)基（NA）、TTC培養(yǎng)基（TCC）和燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）。

主要試劑：CTAB，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；總RNA抽提試劑盒（TaKaRa 9697），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa RR037A）；ExTaq DNA聚合酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；SYBR Green I熒光染料，Promega公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA抽提及PCR檢測(cè) DNA抽提：用CTAB法抽提野生型和轉(zhuǎn)基因本氏煙總DNA。取少量的本氏煙葉片放入2 mL的EP管中，用液氮快速研磨成粉末后進(jìn)行總DNA抽提，DNA沉淀用50 μL的ddH2O溶解。取2 μL DNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA質(zhì)量。

PCR檢測(cè)：用抽提的總DNA作為模板，以已構(gòu)建好的pCV/NS3質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，野生型植株DNA作為陰性對(duì)照，ddH2O作為空白對(duì)照，用RSV基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為NS3 det F：5′- ATGGAAGGGAAGACTATGTTC-3′，NS3 det R：5′-TTAACCCATGCTGGGAGTATC-3′，檢測(cè)轉(zhuǎn)本氏煙的陽性率。

1.2.2 浸潤(rùn)接種PVX 將含有PVX侵染性克隆的農(nóng)桿菌GV3101涂于含50 μg?mL-1卡那霉素（Kan）和40 μg?mL-1利福平（Rif）抗生素LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落于含有相同抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min搖培16 h后菌液做PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行陽性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為陽性的菌液以1﹕100轉(zhuǎn)接到新的相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6—0.8，5 000 r/min離心10 min 收集菌體，并用ddH2O洗菌體2—3次。

用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染液（含10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1AS）懸浮菌體并將菌液OD600值調(diào)到1.0左右。室溫放置4 h后注射5葉期野生型本氏煙小苗、轉(zhuǎn)本氏煙，每個(gè)株系浸潤(rùn)20株。系統(tǒng)發(fā)病后（大約7 d），觀察PVX癥狀，取系統(tǒng)葉抽提RNA，用RT-qPCR方法檢測(cè)PVX積累量。重復(fù)3次。

1.2.3 熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)病毒積累量 取感染PVX的本氏煙葉片，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末，總RNA提取具體操作參照TaKaRa 9697試劑盒說明進(jìn)行?？俁NA用50 μL RNase Free ddH2O溶解，取2 μL RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)總RNA質(zhì)量。

cDNA合成參照TaKaRa RR037A試劑盒體系進(jìn)行。

用PVX的一段序列設(shè)計(jì)定量引物（PVX qF：5′-GGACATGAAGGTGCCCACAGA-3′，PVX qR：5′-CCACTGGAGCATACTTCATGCA-3′），以本氏煙甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，檢測(cè)體系：2×qPCR Mix 10.0 μL，PVX qF（10 nmol·L-1）0.3 μL，PVX qR（10 nmol·L-1）0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。讀取Ct值，相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 青枯病菌的制備與侵染 菌液制備：接種環(huán)蘸取青枯病菌菌液在TTC培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)48 h。待有單菌落長(zhǎng)出，用移植環(huán)挑取單菌落連續(xù)在TTC平板上純化[23]。病菌的致病力測(cè)定參照方中達(dá)[24]的方法，略有改變：在TTC培養(yǎng)基上，致病菌株菌落呈不規(guī)則圓形，邊緣液體狀乳白色帶寬，中心粉紅色點(diǎn)小，黏液多。將青枯致病菌株在NA培養(yǎng)基平板上活化，30℃擴(kuò)大培養(yǎng)，并用無菌水稀釋為OD600為0.1。

青枯病菌侵染本氏煙：用上述配制好的青枯病菌菌液對(duì)5葉期野生型和轉(zhuǎn)本氏煙進(jìn)行灌根處理，每株10 mL，每個(gè)處理20株。設(shè)等體積無菌水灌根處理作為空白對(duì)照。接種后的本氏煙苗置于25℃的溫室中，并每天噴霧進(jìn)行保濕，隔天觀察發(fā)病情況。煙草青枯病的嚴(yán)重度依據(jù)王海波[25]制定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 黑脛病菌的制備與侵染 黑脛病菌游動(dòng)孢子懸浮液的制備：參照馬國(guó)勝等[26]的方法培養(yǎng)，略有改動(dòng)。供試菌株在OA平板上25℃暗培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣切取10塊大小約2 mm×2 mm的菌絲塊，移入盛有20 mL液體OA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，25℃暗培養(yǎng)3 d，用滅菌鑷子把菌絲叢轉(zhuǎn)移到另一無菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌水20 mL，每12 h換一次滅菌水，直至孢子囊大量形成。待大量孢子囊產(chǎn)生后，將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱中15 min，取出置于25℃下30 min，即得到有大量孢子的孢子懸浮液。取樣鏡檢測(cè)定其濃度，并將其稀釋成104個(gè)/mL。

黑脛病菌游動(dòng)孢子懸浮液灌根接種：用上述游動(dòng)孢子懸浮液對(duì)5葉期野生型和轉(zhuǎn)本氏煙進(jìn)行灌根處理，每株10 mL，每個(gè)處理20株。設(shè)等體積無菌水灌根處理作為空白對(duì)照。并每天噴霧進(jìn)行保濕。接種后的煙草苗置于25℃的溫室中，觀察發(fā)病情況。煙草黑脛病的嚴(yán)重度依據(jù)王巖[27]使用的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入、計(jì)算平均值和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)

對(duì)提取成功的本氏煙植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為636 bp RSV擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。陽性樣品均能擴(kuò)增到目標(biāo)大小的DNA片段，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照均無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明PCR體系和反應(yīng)程序沒有問題，引物沒有污染。NS3-6株系的10個(gè)植株均能獲得目標(biāo)大小的DNA片段（圖1-A），而NS3-9株系的10個(gè)植株中只有1個(gè)植株未能獲得目標(biāo)大小的DNA片段（圖1-B），因此，所檢測(cè)的NS3-6、NS3-9株系的陽性率分別為100%、90%。

2.2 PVX癥狀觀察

用含有PVX侵染性克隆農(nóng)桿菌GV3101浸潤(rùn)接種本氏煙后8 d，植株主要表現(xiàn)為輕型花葉，系統(tǒng)侵染葉片通常表現(xiàn)為壞死斑，稍有波紋，之后發(fā)展為大小不等、形狀不規(guī)則的壞死斑駁、褪綠、花葉等癥狀（圖2-B、2-C、2-D）。與未接種PVX野生型本氏煙（圖2-A）相比，野生型及轉(zhuǎn)的2個(gè)株系本氏煙接種PVX后均表現(xiàn)出花葉的癥狀，但轉(zhuǎn)本氏煙接種PVX后表現(xiàn)癥狀（圖2-C、2-D）與野生型本氏煙接種PVX后的癥狀（圖2-B）并無明顯差異。

A：轉(zhuǎn)基因本氏煙NS3-6株系NS3-transgenic N. benthamiana line 6；B：轉(zhuǎn)基因本氏煙NS3-9株系NS3-transgenic N. benthamiana line 9。M：Marker；a：陽性對(duì)照Positive control；b：陰性對(duì)照Negative control；c：ddH2O；1—10：1—10號(hào)樣品The ten plants of transgenic N. benthamiana

A：野生型本氏煙未接種PVX the healthwild-type N. benthamiana plants；B：野生型本氏煙接種PVX wild-type N. benthamiana inoculated with PVX；C：轉(zhuǎn)基因本氏煙NS3-6株系接種PVX NS3-transgenic N. benthamiana line 6 inoculated with PVX；D：轉(zhuǎn)基因本氏煙NS3-9株系接種PVX NS3-transgenic N. benthamiana line 9 inoculated with PVX

2.3 PVX在本氏煙中的積累量

提取受PVX侵染10 d的轉(zhuǎn)RSV的2個(gè)株系本氏煙（NS3-6、NS3-9）與野生型本氏煙（CK）的系統(tǒng)葉總RNA并進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，受PVX侵染的2個(gè)轉(zhuǎn)株系本氏煙的病毒積累量較野生型本氏煙的低。NS3-6、NS3-9株系的PVX積累量分別為野生型本氏煙的68.17%、81.01%，且NS3-6株系病毒的積累量與CK植株的積累量差異顯著（圖3），表明表達(dá)在一定程度上抑制了病毒的積累水平。

2.4 轉(zhuǎn)NS3本氏煙對(duì)青枯病的抗性

受青枯病菌侵染的轉(zhuǎn)株系（NS3-6、NS3-9）與野生型本氏煙（CK）均表現(xiàn)出青枯病的典型癥狀。初發(fā)病時(shí)，病株多向一側(cè)枯萎呈現(xiàn)“半邊瘋”狀態(tài)，有的先在葉片支脈間局部葉肉產(chǎn)生病變，莖上出現(xiàn)長(zhǎng)形黑色條斑，有的條斑擴(kuò)展到病株頂部或枯萎的葉柄上。發(fā)病中期全部葉片萎蔫，發(fā)病表皮變黑腐爛，根部也變黑腐爛，病株莖桿變黑。發(fā)病后期整株枯萎，葉片和莖變黑、猝倒。按照青枯病的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)病級(jí)的轉(zhuǎn)植株與野生型（CK）本氏煙表現(xiàn)癥狀并無差異（圖4）。

每個(gè)柱子代表3次獨(dú)立試驗(yàn)平均值，*表示差異顯著（0.01≤P＜0.05）。下同

從開始發(fā)病進(jìn)行隔天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)（圖5、圖6）。接種煙草青枯病菌10 d后野生型本氏煙（CK）的發(fā)病率為60.00%，病情指數(shù)為29.67，NS3-6株系的發(fā)病率和病情指數(shù)均與CK的相當(dāng)，而NS3-9株系的發(fā)病率和病情指數(shù)均略高于CK，且隨著病害的發(fā)展，CK和轉(zhuǎn)株系的發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸升高。在接種14 d后，CK的發(fā)病率為100.00%，病情指數(shù)為78.67，而轉(zhuǎn)株系的發(fā)病率和病情指數(shù)均低于CK；在接種18 d后，CK和轉(zhuǎn)株系的發(fā)病率均為100.00%；CK的病情指數(shù)為85.67，株系的病情指數(shù)80.00。由此可見，在感染煙草青枯病菌時(shí)，與CK相比，轉(zhuǎn)本氏煙在發(fā)病初期發(fā)病率和病情指數(shù)稍高，后期發(fā)病率逐漸持平，發(fā)病14 d后，轉(zhuǎn)株系病情指數(shù)顯著低于野生型植株。

圖4 本氏煙接種青枯病菌后不同病害等級(jí)癥狀

圖5 接種青枯病菌后本氏煙的發(fā)病率

2.5 轉(zhuǎn)NS3本氏煙對(duì)黑脛病的抗性

受黑脛病菌侵染轉(zhuǎn)株系（NS3-6、NS3-9）與野生型本氏煙（CK）均表現(xiàn)出黑脛病的典型癥狀。莖基部出現(xiàn)黑斑，并環(huán)繞全莖向上延伸，有的植株猝倒，植株中部葉片發(fā)病后，病斑可通過主脈、葉基蔓延到莖部，造成莖中部出現(xiàn)黑褐色壞死，俗稱“腰爛”。濕度大時(shí)，病部長(zhǎng)滿白色菌絲，病株葉片自下向上依次變黃、萎蔫，以至全株葉片凋萎。按照煙草黑脛病菌的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)病級(jí)的轉(zhuǎn)株系與CK表現(xiàn)癥狀并無差異（圖7）。

從開始發(fā)病進(jìn)行隔天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)（圖8、圖9）。接種煙草黑脛病菌8 d后CK的發(fā)病率為75.00%，病情指數(shù)為57.08，NS3-6的發(fā)病率略高于CK，而NS3-9的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于CK。隨著病害的發(fā)展，CK和轉(zhuǎn)株系的發(fā)病率和病情指數(shù)逐漸上升，最后CK和NS3-6株系的所有植株均發(fā)病。從接種12 d開始，CK的發(fā)病率和病情指數(shù)均高于轉(zhuǎn)株系，且轉(zhuǎn)株系病情指數(shù)均顯著低于CK。接種18 d后，NS3-9株系的個(gè)別植株沒有發(fā)病，發(fā)病率為98.33%。由此可見在感染黑脛病菌時(shí)，轉(zhuǎn)本氏煙在煙草黑脛病發(fā)病初期發(fā)病率與CK并無較大差異，后期逐漸低于CK，且轉(zhuǎn)本氏煙的病情指數(shù)在不同發(fā)病時(shí)期均較CK低，表明轉(zhuǎn)基因植株的病害嚴(yán)重度低于對(duì)照植株。

圖6 接種青枯病菌后本氏煙的病情指數(shù)

圖7 本氏煙接種黑脛病菌后不同等級(jí)癥狀

圖8 接種黑脛病菌后本氏煙的發(fā)病率

圖9 接種黑脛病菌后本氏煙的病情指數(shù)

3 討論

RNA沉默抑制子（VSR）是病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中為抵御寄主的RNA沉默而產(chǎn)生的，幫助病毒順利侵入、復(fù)制和擴(kuò)散；同時(shí)，共表達(dá)異源VSR的重組病毒通常毒力增強(qiáng)并加重在寄主上造成的癥狀；而且通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)某些VSR可導(dǎo)致植物生長(zhǎng)與生殖器官的發(fā)育缺陷，比如蕪菁花葉病毒（，TuMV）編碼的VSR，P1/HC-Pro影響寄主miR171的調(diào)控作用，導(dǎo)致擬南芥生長(zhǎng)異常[28]；TAKAGI等[29]報(bào)道將黃瓜花葉病毒（，CMV）編碼的轉(zhuǎn)入大豆中導(dǎo)致其種皮顏色異常。相反，在筆者實(shí)驗(yàn)室前期工作中得到的轉(zhuǎn)RSV的本氏煙，其表型正常，與野生型本氏煙無差別，說明該基因不是致病決定因子；對(duì)其進(jìn)行摩擦接種RSV，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因本氏煙上的病毒癥狀較野生型要輕，且發(fā)病率和病毒積累量顯著降低，說明轉(zhuǎn)入使本氏煙對(duì)RSV抗性增加，這種抗性增加的根本機(jī)制需要進(jìn)一步研究，可能與定位于細(xì)胞核中的NS3活性有關(guān)[14]。

通過轉(zhuǎn)基因方法將病毒基因?qū)胫参?，從而獲得抗病毒植株的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展。劉玉樂等[30]研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CMV衛(wèi)星RNA的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙草花葉病毒（，TMV）的抗性比野生型強(qiáng)，其機(jī)制可能是衛(wèi)星RNA與病毒基因組RNA爭(zhēng)奪病毒RNA復(fù)制酶，從而干擾了病毒基因組RNA的復(fù)制；劉曉玲等[31]研究發(fā)現(xiàn)，將非翻譯的PVX轉(zhuǎn)入煙草中得到了在RNA水平上對(duì)PVX高度抗病的轉(zhuǎn)基因煙草；郭興啟等[32]研究表明，將非翻譯的馬鈴薯Y病毒（，PVY）的轉(zhuǎn)入煙草，獲得了由RNA介導(dǎo)的抗PVY的轉(zhuǎn)基因植株，其抗病性與轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)成正比，與轉(zhuǎn)基因mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的積累水平呈負(fù)相關(guān)，且這種抗病性不受接種物劑量的影響。本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)本氏煙上接種PVX，觀察其發(fā)病情況并檢測(cè)病毒積累量，發(fā)現(xiàn)受PVX侵染的轉(zhuǎn)本氏煙中病毒積累量較野生型本氏煙低，說明轉(zhuǎn)入不利于PVX在寄主中積累，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

ZHANG等[33-34]將大豆中的轉(zhuǎn)入煙草中誘導(dǎo)了病程相關(guān)基因的表達(dá)，而且轉(zhuǎn)基因煙草增強(qiáng)了對(duì)青枯病和TMV的抗性；Jaynes等[35]將天蠶素B類似物轉(zhuǎn)入煙草后，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草上青枯病癥狀出現(xiàn)延遲且病害程度和死苗率均較低；徐鶯等[36]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)煙草對(duì)煙草青枯病同樣具有一定的抗性；Hassan等[37]將轉(zhuǎn)入馬鈴薯，增強(qiáng)了馬鈴薯對(duì)青枯病的抗性。本試驗(yàn)中，本氏煙在接種煙草青枯病菌后，觀察其發(fā)病情況、統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)本氏煙在接種初期發(fā)病率和病情指數(shù)稍高，后期發(fā)病率逐漸與野生型持平但病情指數(shù)低于野生型對(duì)照，說明轉(zhuǎn)本氏煙對(duì)青枯病菌更為敏感，易感病，但后期隨著的表達(dá)，逐漸產(chǎn)生抗病反應(yīng)。

有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)入TEV的煙草對(duì)煙草霜霉菌抗性增強(qiáng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其抗性增強(qiáng)是依賴于水楊酸（salicylic acid，SA）途徑的防衛(wèi)反應(yīng)[21]，且轉(zhuǎn)煙草擁有更快和更有效的防御機(jī)制。進(jìn)一步將HC-Pro蛋白與煙草寄主蛋白進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HC-Pro蛋白和一個(gè)與RNA沉默有關(guān)的鈣調(diào)蛋白互作[21]，并且此蛋白還與寄主早期防御信號(hào)有關(guān)，表明轉(zhuǎn)入的還可能影響了寄主其他的防御機(jī)制。另外，有研究報(bào)道將大豆中一個(gè)茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號(hào)途徑的基因轉(zhuǎn)入本氏煙中能夠增強(qiáng)寄主的抗真菌以及抗鹽和抗旱能力[38]。WU等[9-10]研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)RSV水稻中病程相關(guān)蛋白基因和抗病基因NBS-LRR均發(fā)生上調(diào)，轉(zhuǎn)水稻對(duì)水稻白葉枯病和稻瘟病的抗性比野生型要強(qiáng)，且誘導(dǎo)寄主抗性增加并不依賴于SA和JA途徑。本試驗(yàn)在接種黑脛病菌后，觀察其發(fā)病情況、統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及病情指數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)RSV本氏煙在接種前期發(fā)病率低于野生型本氏煙，后期基本與野生型持平，而轉(zhuǎn)基因本氏煙病情指數(shù)在接種不同天數(shù)均較野生型對(duì)照低，說明與野生型相比轉(zhuǎn)本氏煙對(duì)煙草黑脛病菌敏感性較低，且轉(zhuǎn)入后使本氏煙對(duì)煙草黑脛病產(chǎn)生了抗性。

4 結(jié)論

在轉(zhuǎn)RSV本氏煙上接種PVX、煙草青枯病菌和煙草黑脛病菌，結(jié)果表明表達(dá)不影響這3種病原在植株上的癥狀，但是在一定程度上影響了PVX的積累，同時(shí)在一定程度上抑制了青枯病、黑脛病的發(fā)生和病害的嚴(yán)重度。研究結(jié)果再次佐證了RSV NS3在寄主體內(nèi)具有病毒RNA沉默抑制子和寄主防衛(wèi)反應(yīng)誘導(dǎo)因子雙重功能。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Disease resistance of-transgenic

WU Gentu, CHEN Guangxiang, ZHANG Jiayuan, HU Qiao, MA Mingge, DOU Yanxia, LI Mingjun, QING Ling

(Chongqing Key Laboratory of Plant Disease Biology, College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The protein encoded byis a suppressor of RNA silencingof(RSV). In previous study, it was found thatexpression enhanced the resistance ofto RSV using transgenic technology. In order to reveal the detailed function of NS3 in host plants, the resistance of-transgenicto other tobacco diseases will be analyzed in this study.【Method】Wild-typeand-transgenicwere used to study the infection of(PVX),, andvar.. PVX infectious clone was inoculated by agro-infiltration, viral symptoms were observed. The total RNA of infected leaves was extracted, and viral relative accumulation was detected by RT-qPCR. The method of filling root was used to inoculateandvar., respectively, disease symptoms were observed, and the incidence and disease index were analyzed.【Result】The main symptoms of PVX inleaves were mosaic and chlorosis, and the-transgenicplants had the same PVX symptoms as those of wild-type plants. At 10 days past inoculation (dpi), the results of RT-qPCR showed thatexpression inhibited the accumulation of PVX in, the relative accumulation of PVX in NS3-6line and NS3-9 line was 68.17% and 81.01% of that of wild-type,respectively.After the infection of, the symptoms both in wild-type and-transgenicplants were wilting and damping-off.In the early stage of disease, the expression ofwas beneficial to the infectionofto a certain extent, which showed that it was more sensitivity to bacterial wilt. At 14 dpi, the incidence and disease index of bacterial wilt of wild-typewere 100.00% and 78.67, while the incidence of NS3-6, NS3-9 line was 95.00%, 98.33%, and the disease index was 70.00, 73.00, respectively.After 14 dpi, the incidence and disease index increased gradually, while the disease index of-transgenic lines was lower than that of wild-type plants. The black-brown necrotic patches at the base of stem were observed both in wild-type and transgenic plants aftervar.infection, and the expression ofdid not affect the symptoms of. At the early stage ofvar.infection, the incidence of black shank disease in NS3-6 was higher than that of wild-type, however, during the whole process of black shank disease, the disease index of-transgenic lines was lower than that of wild-type. At 12 dpi, the incidence and disease index of black shank diseasein wild-typewere 96.67% and 77.50, while the incidence of NS3-6, NS3-9 line was 90.00%, 86.67%, and the disease index was 64.17, 62.08,respectively.【Conclusion】The observation of pathogen infection process showed that the expression ofaffected the infection and severity of tobacco diseases onto a certain extent, and the effects on different pathogens were also different.

(RSV);; transgenic; disease resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.005

2019-01-15；

2019-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31601607）、重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項(xiàng)（cstc2017jcyjAX0129）、浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2010DS700124-KF1709）

吳根土，E-mail：wugtu6066@swu.edu.cn。通信作者青玲，E-mail：qling@swu.edu.cn