劉玉飛，金基強(qiáng)，姚明哲，陳亮

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茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因稀有等位變異的篩選、克隆及功能

劉玉飛1,2，金基強(qiáng)1，姚明哲1，陳亮1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310008；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

【目的】茶樹(shù)咖啡堿合成酶1（TCS1）是山茶屬（）茶組植物咖啡堿合成的關(guān)鍵酶，具有豐富的等位變異。從我國(guó)豐富的茶樹(shù)種質(zhì)資源中發(fā)掘稀有等位變異并研究其功能，深入解析茶樹(shù)咖啡堿合成機(jī)制，為低咖啡堿育種提供新的基因資源?！痉椒ā坷锰禺愐颰CS1P InDel F/R對(duì)673份茶樹(shù)資源中的等位變異進(jìn)行鑒定；使用引物TCS1cDNAF/R，從含有新稀有等位變異的茶樹(shù)資源中克隆基因的cDNA全長(zhǎng)序列；利用生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和原核表達(dá)等方法研究新發(fā)現(xiàn)稀有等位基因的功能?！窘Y(jié)果】在部分大理茶（）資源中鑒定到一個(gè)新的稀有等位變異，命名為。從大理茶資源‘龍陵17’（LL17，含有的等位變異為和）中克隆了的編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為1 098 bp，編碼365個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)分別為40.9 kD和5.1。序列比對(duì)結(jié)果表明，與、、、、的相似度在94.1%—99.2%；與具有可可堿合成酶活性（TS）的和編碼蛋白序列相似度均大于96.7%，而與同時(shí)具有TS和咖啡堿合成酶（CS）活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4%，且TCS1g第221位氨基酸殘基與TCS1b、TCS1c同為組氨酸（His），而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f為精氨酸（Arg）。第221位氨基酸殘基位于TCS1g蛋白活性中心，該位點(diǎn)的突變（His突變?yōu)锳rg），可以導(dǎo)致TCS1g的等電點(diǎn)（5.05變?yōu)?.06）和親水性（-0.119變?yōu)?0.123）發(fā)生改變。此外，5′上游調(diào)控區(qū)域的比對(duì)結(jié)果顯示、、起始密碼子（ATG）比、、延后了15 bp。原核表達(dá)發(fā)現(xiàn)TCS1g具有TS活性，活性為44.3 pkat/mg，但未檢測(cè)到CS活性。qRT-PCR的結(jié)果表明LL17中等位變異有表達(dá)。LL17的咖啡堿和可可堿的含量分別為40.3 mg·g-1和5.4 mg·g-1?！窘Y(jié)論】鑒定并克隆了一個(gè)新的稀有等位變異，其在LL17中具有一定的表達(dá)水平，且其表達(dá)蛋白具有TS活性，而未檢測(cè)到CS活性；推測(cè)決定TCS1g僅具有TS活性的關(guān)鍵位點(diǎn)是第221位氨基酸殘基。

等位變異；咖啡堿合成酶；功能分析；嘌呤生物堿；茶樹(shù)

0 引言

【研究意義】咖啡堿（caffeine，Cf）是茶葉的重要功能成分之一，具有興奮和刺激神經(jīng)的作用[1-4]，但是過(guò)量的攝入會(huì)使一些敏感人群出現(xiàn)失眠等現(xiàn)象[5-7]。因此，保持茶葉應(yīng)有風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的低咖啡堿茶和茶制品受到了特殊需求消費(fèi)群體的青睞[8]。低咖啡堿茶樹(shù)育種是實(shí)現(xiàn)茶葉低（無(wú)）咖啡堿最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法[9]。從我國(guó)豐富多樣的茶樹(shù)種質(zhì)中發(fā)掘咖啡堿合成酶稀有等位基因資源，探析其遺傳機(jī)制，對(duì)低（無(wú)）咖啡堿茶樹(shù)育種具有重要理論和實(shí)踐指導(dǎo)作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】咖啡堿的生物合成是以黃嘌呤核苷（xanthosine，XR）為底物，通過(guò)三步甲基化、一步脫核苷酸化的核心途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10-12]（圖1）。核心途徑第一步（-7）、第二步（-3）和第三步（-1）甲基化反應(yīng)均由-甲基轉(zhuǎn)移酶類（-methyltransferases，NMTs）催化完成，其甲基供體是-腺苷-L-甲硫氨酸（-adenosyl-L-methionine，SAM）[13]。茶樹(shù)咖啡堿合成酶（tea caffeine synthase，TCS）屬于NMTs，可以催化-3和（或）-1甲基化反應(yīng)。Kato等[14]和YONEYAMA等[15]分別克隆到一個(gè)（和）的cDNA全長(zhǎng)，并通過(guò)原核表達(dá)發(fā)現(xiàn)TCS1具有催化-3和-1甲基化的活性，而TCS2不具有NMT活性。金基強(qiáng)等[16]克隆了6條茶樹(shù)咖啡堿合成酶的基因組全長(zhǎng)（—），其中為假基因，而、、在嫩葉中表達(dá)量很低。以上研究均表明TCS1是催化茶樹(shù)咖啡堿生物合成后兩步甲基化的關(guān)鍵酶。JIN等[17]發(fā)現(xiàn)在茶組（Sect.）植物中具有多個(gè)等位變異，根據(jù)5′上游調(diào)控區(qū)域的插入/缺失突變?cè)诓杞M植物中鑒定到6個(gè)等位變異（），并克隆了這6個(gè)等位變異的cDNA全長(zhǎng)，其中、、分別與NCBI上已登錄的、（來(lái)源于滇緬茶，）和（來(lái)源于毛葉茶）的序列一致，蛋白重組試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TCS1d、TCS1e、TCS1f與TCS1a（TCS1）都具有催化-3和-1甲基化的活性，而YONEYAMA等[15]研究發(fā)現(xiàn)ICS1（TCS1b）和PCS1（TCS1c）僅具有催化-3甲基化反應(yīng)的功能。具有多個(gè)等位變異是由茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因的獨(dú)立進(jìn)化和近期的快速演化機(jī)制導(dǎo)致[18-21]。也正是由于序列變異多樣，導(dǎo)致了我國(guó)茶樹(shù)資源嘌呤生物堿具有不同的分布模式：多數(shù)資源以咖啡堿為主（2.5%—4.5%）[16]，少數(shù)資源以可可堿[22-24]或茶葉堿[25]為優(yōu)勢(shì)組分?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】是茶樹(shù)咖啡堿合成的關(guān)鍵基因，具有豐富的等位變異，以往研究主要對(duì)茶種植物中含有的等位變異進(jìn)行了篩選，但對(duì)茶樹(shù)近源植物（多為野生茶樹(shù)資源）篩選較少，因此有必要對(duì)更多的茶樹(shù)近源植物進(jìn)行鑒定，發(fā)掘新的稀有等位變異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)進(jìn)一步篩選我國(guó)茶樹(shù)資源，從而確定是否還存在新的稀有等位變異；克隆新的稀有等位變異的基因序列，研究其序列特征和蛋白活性，進(jìn)一步解析茶樹(shù)咖啡堿合成的機(jī)制，為低咖啡堿茶樹(shù)育種尋找新的優(yōu)異等位基因。

（1）7-甲基黃嘌呤核苷合成酶（黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶）；（2）N-甲基核苷酶；（3）可可堿合成酶（單甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶）：TCS1b（ICS1）、TCS1c（PCS1）；（4）咖啡堿合成酶（二甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶）；（3-4）雙功能咖啡堿合成酶：TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f。SAM：S-腺苷-L-甲硫氨酸；SAH：S-腺苷-L-高半胱氨酸；Ribose：核糖。圖片參考文獻(xiàn)[10-12]

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2018年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃采集的200份（多為地方品種和野生茶樹(shù)資源）和云南采集的473份茶樹(shù)資源（來(lái)源于臨滄古茶樹(shù)群體：野生、栽培大理茶，阿薩姆茶var.及其中間過(guò)渡型茶樹(shù)）為試驗(yàn)材料，取一芽二葉新梢，迅速液氮固樣，并置于-80℃保存，待基因組DNA的提??；另采摘龍井43（LJ43，）、廣東可可茶（CCT，）和龍陵17（LL17，）春季第一輪一芽二葉新梢，一部分迅速液氮固樣，并置于-80℃保存，用于總RNA的提?。涣硪徊糠植捎?20℃熱風(fēng)干燥5 min，75℃烘干，作為生化成分測(cè)定的樣品。

1.2 TCS1稀有等位變異的篩選

利用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320-03，天根生化科技）進(jìn)行茶樹(shù)基因組DNA的提取，提取完畢后所有DNA均稀釋至50 ng·μL-1。利用特異引物TCS1P InDel F/R（表1），對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后在2.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槠鹗济艽a子ATG上游303 bp與第一外顯子67 bp處。

1.3 生化成分測(cè)定

采用高效液相色譜法（high performance liquidchromatography，HPLC）測(cè)定生化樣中生物堿含量，各樣品均獨(dú)立重復(fù)3次。待測(cè)樣品的前處理參照GB/T 8313—2018[26]，液相色譜測(cè)定條件參照金基強(qiáng)等[16]的測(cè)定方法。用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 總RNA的提取、cDNA的合成和TCS1等位變異cDNA全長(zhǎng)的克隆

茶樹(shù)總RNA的提取采用RNA快速提取試劑盒（RN5301，北京艾德萊生物科技），并利用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（Kr116-02，天根生化科技）進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取目的基因。參考JIN等[17]研究設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的引物TCS1cDNAF/R（表1）。

1.5 蛋白活性測(cè)定

表達(dá)載體pMAL-c5x和目標(biāo)基因（添加酶切位點(diǎn)的引物TCS1gF/R見(jiàn)表1）同時(shí)進(jìn)行雙酶切，酶切成功后進(jìn)行重組連接、鑒定，以構(gòu)建蛋白活性測(cè)定的表達(dá)載體。將成功構(gòu)建的表達(dá)載體和pMAL-c5x空載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3) pLysS（CD701-03，全式金）的感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行陽(yáng)性驗(yàn)證。

陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)到250 mL，然后利用IPTG（終濃度0.5 mmol?L-1）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)：37℃，120 r/min，誘導(dǎo)4 h。蛋白純化和蛋白活性檢測(cè)參考JIN等[17]的方法進(jìn)行，其中細(xì)胞破碎功率改為277 W。蛋白定量采用Bradford法進(jìn)行（DQ101-01，全式金），每個(gè)樣品均獨(dú)立重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以茶樹(shù)作為內(nèi)參基因（引物序列見(jiàn)表1）。其中TCS1-CS、TCS1-TS和TCS1-Total分別是研究表達(dá)蛋白同時(shí)具有可可堿和咖啡堿合成酶（caffeine synthase，CS）活性等位變異、表達(dá)蛋白僅具有可可堿合成酶（theobromine synthase，TS）活性等位變異和整體表達(dá)水平的引物。

Real-Time PCR反應(yīng)使用定量試劑盒（KK4601，Kapa Biosystems），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個(gè)循環(huán)；60—95℃分析溶解曲線。應(yīng)用ABI sequence detection system（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 試驗(yàn)引物及其序列

下劃線表示酶切位點(diǎn) The underlines are restriction enzyme cutting sites

1.7 序列分析

利用DNAMAN軟件包對(duì)序列進(jìn)行拼接；EXPASY（http://expasy.org/tools/）中的ProtParam工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行基本的生物信息學(xué)分析；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）對(duì)蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，EXPASY中的BoxShade輸出同源比對(duì)的結(jié)果；MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，選用Neighbor-joining法，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000；EXPASY中的SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白建模，并用Swiss-PdbViewer[27]進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 TCS1等位變異的篩選

利用特異引物TCS1P InDel F/R擴(kuò)增673份茶樹(shù)資源中等位變異的5′上游調(diào)控區(qū)域（目標(biāo)片段長(zhǎng)度為368 bp），從部分大理茶（）資源中擴(kuò)增出一條620 bp左右的特異條帶，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，該條帶大小為617 bp。序列比對(duì)（圖2）顯示該片段與已往鑒定的序列差異明顯，長(zhǎng)度長(zhǎng)95—347 bp，相似度在52.3%—94.6%，因此將具有該片段的稀有等位變異命名為。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)、、的起始密碼子“ATG”均比和、、延后15 bp（圖2）。

2.2 TCS1gcDNA全長(zhǎng)的克隆

通過(guò)等位變異的鑒定發(fā)現(xiàn)，具有這一等位變異的茶樹(shù)資源，同時(shí)還含有一個(gè)或多個(gè)其他類型的等位變異，為了更好地研究的功能，本研究選擇具有常規(guī)等位變異和特異等位變異的大理茶資源LL17為試驗(yàn)材料。從LL17總cDNA中獲得了的全長(zhǎng)cDNA序列，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 098 bp，編碼365個(gè)氨基酸，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示TCS1g分子量為40.9 kD，理論等電點(diǎn)為5.1，酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）有50個(gè)，堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）有33個(gè)，其中含量最高的3種氨基酸是：亮氨酸（10.7%）、谷氨酸（8.8%）和絲氨酸（8.8%）。

與—的核酸序列相似度在94.1%—99.2%，與TCS1a—TCS1f的蛋白序列的相似度均大于90%，其中與具有TS活性的TCS1b、TCS1c相似度都大于96%（表2）。與咖啡中現(xiàn)已克?。∟CBI登陸）的編碼區(qū)序列的相似性在29.3%—39.8%，與可可中分離的具有可可堿合成酶功能的（AB096699）[15]的序列相似度為55.0%。利用茶樹(shù)、可可和咖啡中的cDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析（圖3），發(fā)現(xiàn)不同物種的獨(dú)立成簇，茶樹(shù)中的不同等位變異聚為兩類，Ⅰ類包括新克隆的和表達(dá)蛋白僅具有可可堿合成酶活性的、，Ⅱ類包括、、、。

對(duì)已經(jīng)克隆的—和新克隆的的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)（圖4），結(jié)果顯示TCS1g與TCS1的其他等位變異一樣，都具有編碼蛋白的3個(gè)SAM結(jié)合域A、B和C以及一個(gè)保守域YFFF[17,28-29]。另外，TCS1b、TCS1c、TCS1g相比于TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f還有13個(gè)氨基酸殘基的變異（圖4）。TCS1g蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：47.4%為α-螺旋、13.2%為延伸鏈、4.9%為β-轉(zhuǎn)角、34.5%為無(wú)規(guī)則卷曲；通過(guò)同源建模的方式對(duì)TCS1g進(jìn)行了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬（圖5），綠色和紅色分別標(biāo)注是TCS1g與甲基受體和甲基供體結(jié)合的氨基酸殘基。

圖2 TCS1g與TCS1其他6個(gè)等位變異5′上游調(diào)控區(qū)域的多序列比對(duì)

空心圓、空心正方形和空心三角分別標(biāo)注山茶屬、咖啡屬和可可屬的N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因。TCS1g加粗突顯

表2 TCS1g與TCS1其他6個(gè)等位變異編碼區(qū)核酸序列（矩陣的上半部分）和蛋白序列（矩陣的下半部分）的相似性（%）比較

SAM的結(jié)合域A、B和C以及一個(gè)保守域YFFF用紅框標(biāo)出[15,28-29]。與底物特異性結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)用籃框標(biāo)出[15,17,30]。TCS1b、TCS1c、TCS1g相比于TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f的變異位點(diǎn)用棕黃色三角標(biāo)出

2.3 TCS1g編碼蛋白活性的測(cè)定

在甲基供體SAM存在下，將重組酶制劑與底物7-甲基黃嘌呤或可可堿一起27℃孵育1 h后，通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以7-甲基黃嘌呤為底物的反應(yīng)有可可堿的生成，以可可堿為底物的反應(yīng)中未檢測(cè)到有咖啡堿生成，說(shuō)明TCS1g與TCS1b、TCS1c功能相似，都只有TS活性，不具有CS活性。測(cè)定結(jié)果（表3）顯示，TCS1g的TS活性為44.3 pkat/mg，約為對(duì)照TCS1c的2.5倍，但小于對(duì)照TCS1a的TS活性。

2.4 TCS1g的表達(dá)水平分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖6）顯示，LL17（具有和兩種等位變異）中整體表達(dá)水平比LJ43低58.0%，比CCT高1.8倍。為了明確的表達(dá)水平，設(shè)計(jì)了引物TCS1-TS和TCS1-CS，來(lái)區(qū)分LL17中功能不同的和的表達(dá)水平，引物TCS1-TS用于檢測(cè)表達(dá)蛋白僅具有TS活性的基因：、，TCS1-CS用于檢測(cè)表達(dá)蛋白同時(shí)具有TS和CS活性的基因：。以僅具有等位變異的LJ43和僅具有的CCT分別作為引物TCS1-TS和TCS1-CS的陰性對(duì)照，圖6表明，使用TCS1-TS檢測(cè)LJ43和TCS1-CS檢測(cè)CCT時(shí)，表達(dá)水平均極低，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物特異性高，能區(qū)分兩種不同功能的等位變異。定量結(jié)果（圖6）表明，LL17中（TCS1-TS檢測(cè)結(jié)果）有表達(dá)，但表達(dá)水平較低：只有對(duì)照CCT中表達(dá)量的34.5%，另外LL17中（TCS1-CS檢測(cè)結(jié)果）的表達(dá)也較低，為對(duì)照LJ43中的41.6%。

表3 TCS1g重組蛋白活性分析

TCS1a[17]和TCS1c[31]的酶活性結(jié)果來(lái)自以往發(fā)表文獻(xiàn)。ND表示未檢出。下同

TCS1a[17]and TCS1c[31]were taken from reference. ND, not detected. The same as below

黃色氨基酸殘基為139—287區(qū)間TCS1b、TCS1c、TCS1g與TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f不同的氨基酸殘基。綠色和紅色分別標(biāo)注是與甲基受體和甲基供體結(jié)合的氨基酸殘基

2.5 具有TCS1g茶樹(shù)資源LL17生物堿的含量

為了明確具有等位變異的大理茶資源LL17（含有和兩個(gè)等位變異）生物堿含量，本研究通過(guò)HPLC法進(jìn)行了測(cè)定（表4），可可堿和咖啡堿的含量分別為5.4 mg·g-1和40.3 mg·g-1。

TCS1-CS，TCS1-TS和TCS1-Total分別表示表達(dá)蛋白同時(shí)具有可可堿和咖啡堿合成酶活性的等位變異、表達(dá)蛋白僅具有可可堿合成酶活性的等位變異和整體TCS1的表達(dá)水平

雖然LL17具有可可堿合成酶基因，但是其生物堿分布模式與僅具有可可堿合成酶基因的CCT（高可可堿、無(wú)咖啡堿）不同，而是與僅具有的LJ43（可可堿和咖啡堿的含量分別為1.8 mg·g-1和31.2 mg·g-1）相似。編碼的蛋白能將大部分可可堿轉(zhuǎn)化生成咖啡堿，從而導(dǎo)致具有的茶樹(shù)資源沒(méi)有大量可可堿的積累，LL17具有這一等位基因，所以LL17沒(méi)能像CCT（只具有可可堿合成酶基因）那樣積累大量的可可堿。

表4 含等位變異TCS1g的茶樹(shù)資源LL17嘌呤生物堿的含量

3 討論

3.1 TCS1具有豐富的等位變異

本研究通過(guò)對(duì)673份茶樹(shù)資源進(jìn)行篩選，鑒定到一個(gè)新的等位變異。與JIN等[17]克隆的、、、、、的氨基酸序列相似度均大于90%，核酸序列相似度均大于94%（表2），與茶樹(shù)中其他的相似度也都大于91%，而與咖啡中家族的基因序列的相似度均低于40%，與可可中分離的具有可可堿合成酶功能的的序列相似度約55%。以NCBI中已登錄的茶樹(shù)、咖啡和可可中的的cDNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明不同物種的獨(dú)立成簇，而不是不同屬中相同功能的聚在一起。新克隆的具有可可堿合成酶功能的也同樣與茶樹(shù)中的聚在一起，這一新的聚類分析與前人[18-21,32]的結(jié)果相符，表明不同植物中咖啡堿的生物合成是獨(dú)立進(jìn)化形成的。茶樹(shù)的獨(dú)立和近期快速的進(jìn)化機(jī)制[20]導(dǎo)致了具有豐富的等位變異，本研究的發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步表明了等位變異極其豐富。也正是由于序列變異多樣，導(dǎo)致TCS1酶活性多樣，從而形成了我國(guó)茶樹(shù)資源嘌呤生物堿具有不同的分布模式。

3.2 TCS1g編碼蛋白無(wú)咖啡堿合成酶活性的重要位點(diǎn)

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，TCS1g的蛋白序列與TCS1b和TCS1c的相似性程度都大于96%，并且、、明顯聚為Ⅰ類（圖3），即TS類[17]（表達(dá)蛋白僅具有可可堿合成酶活性）。本研究原核表達(dá)蛋白的結(jié)果也表明TCS1g僅具有催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿的功能，不具有催化可可堿生成咖啡堿的功能，這與聚類結(jié)果相符；另外，、、、屬于Ⅱ類，即CS類（表達(dá)蛋白具有可可堿和咖啡堿合成酶活性）。TS類編碼的氨基酸序列相比于CS類的TCS1a、TCS1d、TCS1e（氮端缺少一個(gè)蘇氨酸殘基）、TCS1f的氮端缺少一個(gè)“ELATA”序列；此外，TS類編碼的氨基酸序列還有多個(gè)殘基的變異。YONEYAMA等[15]通過(guò)構(gòu)建雜交酶（TCS1a和TCS1c）發(fā)現(xiàn)決定TCS1蛋白底物結(jié)合特異性的區(qū)域是139—287這一段氨基酸殘基，說(shuō)明這一區(qū)域僅有的4個(gè)氨基酸殘基（188、221、230和263位）的變異決定了TS類與CS類底物特異性。

分析發(fā)現(xiàn)188位的賴氨酸（Lys）-精氨酸（Arg）、230位的谷氨酸（Glu）-天冬氨酸（Asp）和263位的纈氨酸（Val）-異亮氨酸（Ile）這3個(gè)位點(diǎn)的變異均是同性質(zhì)氨基酸殘基的變異，對(duì)蛋白的等電點(diǎn)和親水性影響很小。另外，通過(guò)同源建模發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)突變位點(diǎn)的氨基酸殘基都位于蛋白的外側(cè)，距離酶活性中心較遠(yuǎn)，因此，推測(cè)其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響不大。221位的組氨酸（His）突變?yōu)锳rg導(dǎo)致編碼蛋白的等電點(diǎn)（5.05變?yōu)?.06）和親水性（-0.119變?yōu)?0.123）都發(fā)生改變，圖5顯示221位氨基酸殘基位于酶活性的中心，以往研究指出221位的His突變?yōu)锳rg會(huì)改變酶與底物結(jié)合的位阻[17]。另外，YONEYAMA等[15]通過(guò)定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)僅具有TS活性的TCS1c第221位氨基酸殘基（對(duì)應(yīng)于TCS1a的第225位氨基酸殘基的位置）由His突變?yōu)锳rg后，TCS1c不僅具有TS活性，還具有CS活性；李萌萌等[32]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)?25位的Arg突變?yōu)镠is，TCS1a則不再具有CS活性。綜上所述，茶樹(shù)編碼蛋白的第221位氨基酸殘基（對(duì)應(yīng)于TCS1a的第225位氨基酸殘基的位置）的突變將直接決定其是否具有CS活性。本研究克隆得到的編碼蛋白的第221位氨基酸殘基也為His（對(duì)應(yīng)于TCS1a的第225位氨基酸殘基的位置），并且僅具有TS活性，所以根據(jù)以上分析，可以推斷第221位氨基酸殘基是導(dǎo)致TCS1g僅具有TS活性（不具有CS活性）的關(guān)鍵位點(diǎn)，其他位點(diǎn)的變異可能對(duì)蛋白活性的高低有影響。

3.3 TCS1稀有等位變異在低咖啡堿茶樹(shù)育種中的作用

利用特異引物TCS1P InDel F/R鑒定了673份茶樹(shù)資源具有的等位變異，發(fā)現(xiàn)這些茶樹(shù)資源中大多數(shù)都含有這一等位變異，而—以及類型的稀有等位變異只存在于個(gè)別的茶樹(shù)資源中。常規(guī)茶樹(shù)資源中的表達(dá)蛋白能將茶樹(shù)中的大部分可可堿轉(zhuǎn)化生成咖啡堿，這也是多數(shù)茶樹(shù)資源咖啡堿較高含量[17]的主要原因，所以在茶樹(shù)資源中很難直接篩選得到低咖啡堿植株，并且也很難利用常規(guī)的茶樹(shù)資源通過(guò)雜交育種的方式育成低（無(wú)）咖啡堿茶樹(shù)品種。另外，有報(bào)道通過(guò)理化方法降低茶葉中咖啡堿的含量[33]，但是這種方法生產(chǎn)的茶葉風(fēng)味會(huì)發(fā)生變化，并且生產(chǎn)成本較高[34]。因此，利用特異的茶樹(shù)資源作為親本進(jìn)行雜交育種是快速選育出綜合性狀優(yōu)良、低咖啡堿含量茶樹(shù)新品種的有效方法。

筆者課題組前期開(kāi)發(fā)了有效的InDel標(biāo)記，可以對(duì)茶樹(shù)資源具有的等位基因進(jìn)行鑒定。JIN等[17]利用該標(biāo)記發(fā)現(xiàn)具有多個(gè)等位變異（、、、、、），筆者通過(guò)進(jìn)一步的鑒定又獲得了一個(gè)新的等位變異。其中只具有TS活性的等位變異（、、）和具有低轉(zhuǎn)錄水平的等位變異（）均是低咖啡堿茶樹(shù)育種可利用的優(yōu)異等位變異，具有這些有利等位變異的茶樹(shù)資源是低咖啡堿茶樹(shù)育種的優(yōu)異茶樹(shù)資源。本研究篩選到的多份茶樹(shù)資源都可以作為以后低咖啡堿雜交育種的親本。

4 結(jié)論

獲得了一個(gè)新的茶樹(shù)稀有等位變異的全長(zhǎng)cDNA，其編碼蛋白的分子量為40.9 kD，理論等電點(diǎn)為5.1，具有催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿的能力，未檢測(cè)到催化可可堿生成咖啡堿的活性，TS活性大小為44.3 pkat/mg；TCS1g與TCS1b、TCS1c的序列相似度均大于96%，都屬于TS類；推測(cè)第221位氨基酸殘基是導(dǎo)致TCS1g僅具有TS活性（不具有CS活性）的關(guān)鍵性位點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Screening, Cloning and Functional Research of the Rare Allelic Variation of Caffeine Synthase Gene () in Tea Plants

LIU YuFei1,2, JIN JiQiang1, YAO MingZhe1, CHEN Liang1

(1Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Objective】Tea caffeine synthase 1 (TCS1), a key enzyme in the caffeine biosynthesis pathway, shows a wide range of allelic variation withinsect.germplasm. Discovery of the specific alleles ofas the genetic basis of natural variation in caffeine levels will increase the understanding of the mechanism of caffeine synthesis and accumulation, and provide new genetic resources for improving caffeine content in tea plant. 【Method】An unique PCR primer set, namely TCS1P InDel F/R, was used to detectalleles in 673 accessions of tea germplasm. The primer set (TCS1cDNAF/R) was used to clone the full-length cDNA sequence of novelallele, whose function was subsequently validated by bioinformatics quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and prokaryotic expression analysis. 【Result】The novel rare allele,, was identified in the several germplasm of. Thesequence was obtained by using the accession ‘LL17’, which contained bothand. The CDS ofwas 1098 bp, encoding 365 amino acids with a calculated molecular weight of 40.9 kD and a theoretical isoelectric point 5.1. The sequence similarities betweenand,,,,e,ranged from 94.1% to 99.2%. The TCS1g showed a high level (>96%) of amino acid sequence identity with the alleles (and) which had only theobromine synthase (TS) activity, while it was slightly lower for other alleles (,,and) having both TS and caffeine synthase (CS) activity. The amino acid residue in position 221, located at the active center motif of TCS1, was histidine (His) in the TCS1g, as well as TCS1b and TCS1c, however it was arginine (Arg) for the others. The mutation (His to Arg) would change the isoelectric point and hydrophilicity from 5.05 to 5.06, and from -0.119 to -0.123, respectively. Meanwhile, the 5' upstream regulatory region of TCS1g, TCS1b and TCS1c was 15 bp longer than that of TCS1a, TCS1d, TCS1e and TCS1f. The results of prokaryotic expression analysis indicated that TCS1g had only TS activity (44.3 pkat/mg), and qRT-PCR analysis showed thewas expressed in the ‘LL17’. The contents of caffeine and theobromine in the ‘LL17’ were 40.3 mg·g-1and 5.4 mg·g-1, respectively. 【Conclusion】A novel rare allele of() was cloned, and the expression was detected in the ‘LL17’. TCS1g had TS activity, but no CS activity, which might be caused by the change of amino acid residue in position 221.

allelic variation; caffeine synthase; functional analysis; purine alkaloids; tea plant

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.010

2018-12-04；

2019-02-25

國(guó)家自然科學(xué)基金（31670685）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAASASTIP-2017-TRICAAS）

劉玉飛，Tel：18737616921；E-mail：chaye18@163.com。通信作者姚明哲，Tel：13588718222；E-mail：yaomz@tricaas.com。通信作者陳亮，Tel：13958093541；E-mail：liangchen@tricaas.com