陳 吟， 亓希武， 徐東北， 陳澤群， 房海靈， 梁呈元

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)隸屬于唇形科(Labiatae)薄荷屬(MenthaLinn.)，為常見的芳香植物之一，廣泛分布于北半球的溫帶地區(qū)，在中國南方和北方各省均有栽培[1]。 薄荷的莖為方柱形，葉具短柄，葉片呈寬針形，葉緣具細(xì)鋸齒，搓揉后散發(fā)出特殊的清涼香氣[2]。 薄荷葉中含有多種生物活性物質(zhì)，具有重要的藥用價值，包括清涼止癢、抗早孕著床、抑制子宮收縮、利膽、祛痰、抗真菌和抗病毒等[3]。

薄荷葉精油豐富，主要為萜類化合物。 不同薄荷屬植物精油成分差異較大[4]，留蘭香(M.spicataLinn.)葉精油的主要成分為香芹酮(carvone)，椒樣薄荷(M.piperitaLinn.)葉精油的主要成分為薄荷醇(menthol)和薄荷酮(menthone)，而薄荷葉精油的主要成分為薄荷醇。 根據(jù)揮發(fā)油成分差異，薄荷屬植物可分成不同的化學(xué)型，包括薄荷醇化學(xué)型(menthol chemotype)、薄荷酮化學(xué)型(menthone chemotype)、香芹酮化學(xué)型(carvone chemotype)和辣薄荷烯酮氧化物化學(xué)型(piperitenone oxide chemotype)[5-6]。 相關(guān)研究結(jié)果表明：薄荷精油的合成途徑起源于質(zhì)體中的丙酮酸-磷酸甘油醛(MEP)途徑，上游的牻牛兒基二磷酸(geranyl diphosphate)經(jīng)檸檬烯合酶(limonene synthase，LS)催化生成檸檬烯(limonene)，而檸檬烯是多種精油成分合成的共同前體[7-9]；檸檬烯-3-羥化酶(limonene-3-hydroxylase，L3OH)和檸檬烯-6-羥化酶(limonene-6-hydroxylase，L6OH)能夠催化檸檬烯羥基化反應(yīng)， 分別生成反式異紫堇醇(transisopipertenol)和反式香芹酮(trans-carvone)，其中，反式異紫堇醇可被進(jìn)一步催化成順式異戊酮(cisisopulegone)，而反式香芹酮可被進(jìn)一步催化成香芹酮[10-12]。 可見，檸檬烯羥基化反應(yīng)是薄荷屬植物精油合成的重要一步，對其精油組成具有重要影響，因此，研究檸檬烯羥化酶基因?qū)τ诹私獗『蓪僦参锞偷纳锖铣杉敖M成差異具有重要意義。

鑒于此，根據(jù)前期薄荷轉(zhuǎn)錄組測序獲得的L6OH基因序列設(shè)計1 對特定引物，以薄荷葉cDNA 為模板克隆到1 個L6OH基因，并對該基因進(jìn)行了序列分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析；并且，利用實時熒光定量PCR 技術(shù)分析了該基因在薄荷根、莖和葉中的表達(dá)特性；同時，對該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了原核表達(dá)分析，以期明確薄荷L6OH基因的組織表達(dá)特性及其與薄荷精油組成的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

以江蘇省中國科學(xué)院植物研究所種質(zhì)資源圃種植的薄荷品種‘68-7’的1 年生苗為實驗材料，隨機選擇3 株生長良好、長勢基本一致且無病害的植株，分別采集每個單株的根、莖(植株中部節(jié)間的莖段)和葉(植株頂端的葉)各1 g 左右，分別放入液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

擴增引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 合成 將薄荷樣品置于液氮中研磨成細(xì)粉，按照植物多糖多酚總RNA 快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)說明書提取總RNA，用V-1600 型紫外分光光度計(上海美普達(dá)儀器有限公司)檢測總RNA 的質(zhì)量；檢測合格后，取3 μg 總RNA，按照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶試劑盒〔普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司〕說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)本項目組前期對薄荷轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中預(yù)測的L6OH基因序列，利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計1 對特異引物，上游引物L(fēng)6OH-F的序列為5′-ATGGAGCTCAACCTTTTGTCG-3′，下游引物L(fēng)6OH-R 的序列為5′-TTATTTATGGAGTGT GGGAACC-3′。 擴增體系總體積50.0 μL，包括10×buffer 5.0 μL，25 mmol·L-1Mg2+4.0 μL，20 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL，葉cDNA 模板2.0 μL，10 μmol·L-1上游和下游引物各2.0 μL，ExTaqDNA聚合酶0.4 μL，ddH2O 30.6 μL。 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，切下目的條帶，用Agarose Gel DNA Extraction 試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector〔寶生物工程(大連)有限公司〕上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌〔Escherichia coli(Migula) Castellani et Chalmers〕DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)中，置于37 ℃條件下暗培養(yǎng)，挑取單菌落，篩選出陽性克隆并交給北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用BioEdit 軟件對克隆的L6OH基因序列進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)預(yù)測和氨基酸翻譯[13]，在ExPASy 網(wǎng)站(http：∥web. expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)對該基因編碼蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量和理論等電點進(jìn)行預(yù)測，使用SMART 軟件(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)對該基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，使用SOPMA 軟件(https：∥npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma. html)對該基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，使用DNAMAN 7.0 軟件將薄荷與NCBI 數(shù)據(jù)庫中椒樣薄荷和留蘭香的L6OH基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，并基于相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列、使用MEGA 4.0 軟件中的Neighbor-joining 法構(gòu)建薄荷及其他植物CYD71 家族D 亞家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]。

1.2.4 組織表達(dá)特性分析 根據(jù)測序得到的薄荷L6OH基因序列設(shè)計用于實時熒光定量PCR 反應(yīng)的引物，上游引物qL6OH-F 的序列為5′-CGATTTCG AGTTCATCCCATTC-3′，下游引物qL6OH-R 的序列為5′-GTCGGCATCAGTCATTCCTTG-3′；使用薄荷Actin基因作為內(nèi)參基因，用于Actin基因PCR 反應(yīng)的上游引物序列為5′-CCAGGAATTGCTGATAGGATG AG-3′，下游引物序列為5′-GCGCCACCACCTTAAT CTTC-3′。 使用qTOWER 2.2 熒光定量PCR 儀(德國Analytic Jena 公司)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴增體系總體積20.0 μL，包括SYBR?PremixExTaqTMⅡ 10.0 μL，10 μmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL，根、莖或葉cDNA 模板2.0μL，ddH2O7.0μL。 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火5 s、72 ℃延伸10 s，共40 個循環(huán)；最后72 ℃采集熒光信號。 采用2-ΔΔCT法[15]計算薄荷根、莖和葉中L6OH基因的相對表達(dá)量。 實驗進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 原核表達(dá)分析 使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ對原核表達(dá)載體pET28a 進(jìn)行雙酶切，使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification 試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕回收酶切后的載體；根據(jù)克隆的L6OH基因序列和pET28a 載體序列設(shè)計含有同源臂的引物，上游引物exL6OH-F 的序列為5′-AATGGGTCGCGGATCC ATGGAGCTCAACCTTTTG TCG-3′，下游引物exL6OH-R 的序列為5′-CCGCAAG CTTGTCGAC TTATTTATGGAGTGTGGGAACC-3′(引物中下劃線部分為同源臂序列)；利用同源重組法獲得重組載體pET28a-L6OH；提取重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含25 mg·L-1卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下暗培養(yǎng)；挑取單菌落，置于LB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)；當(dāng)OD600值為0.6～0.8 時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)至終濃度1 mmol·L-1，置于37 ℃條件下暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)L6OH 蛋白表達(dá)。 分別取誘導(dǎo)0(誘導(dǎo)前)、1、2、3和4 h 的菌液，在4 ℃條件下6 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀，使用SDS-PAGE 法[16]檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因克隆及序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)預(yù)測的L6OH基因序列設(shè)計引物，以薄荷葉cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增，結(jié)果(圖1)表明：從薄荷葉cDNA 中克隆到1 條長度約1 500 bp 的明亮條帶。 經(jīng)測序，該條帶為L6OH基因，命名為MhL6OH，GenBank 登錄號為MK285052。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：MhL6OH基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)全長1 479 bp，共編碼492 個氨基酸殘基(圖2)；該基因編碼的蛋白質(zhì)命名為MhL6OH，該蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量為55 855.69，理論等電點為pI 8.71；該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋的比例為51.02%，無規(guī)則卷曲的比例為30.49%，延伸鏈的比例為12.40%，β-轉(zhuǎn)角的比例為6.10%(圖3)。 此外，該蛋白質(zhì)還含有保守的細(xì)胞色素P450 結(jié)構(gòu)域(圖4)，根據(jù)細(xì)胞色素P450 超家族分類標(biāo)準(zhǔn)[17]，MhL6OH蛋白屬于CYP71 家族的D 亞家族。

圖1 薄荷MhL6OH 基因擴增結(jié)果Fig. 1 Amplification result of MhL6OH gene of Mentha haplocalyx Briq.

圖2 薄荷MhL6OH 基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)及其氨基酸序列Fig. 2 Coding sequence region (CDS) of MhL6OH gene of Mentha haplocalyx Briq. and its amino acid sequence

圖3 薄荷MhL6OH 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Prediction of secondary structure of MhL6OH protein of Mentha haplocalyx Briq.

圖4 薄荷MhL6OH 蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 4 Prediction of domain of MhL6OH protein of Mentha haplocalyx Briq.

2.2 多重比對和進(jìn)化分析

對獲得的薄荷MhL6OH 蛋白與NCBI 網(wǎng)站中薄荷屬植物椒樣薄荷MpL6OH 蛋白(登錄號AIS36970)和留蘭香MsL6OH 蛋白(登錄號Q6WKZ1.1)的氨基酸序列進(jìn)行多重比對。 比對分析結(jié)果(圖5)表明：MhL6OH 蛋白與MpL6OH 蛋白和MsL6OH 蛋白的氨基酸序列高度相似，均具有細(xì)胞色素P450 的血紅素結(jié)合區(qū)(heme binding region)；這3 種薄荷屬植物L(fēng)6OH 蛋白的底物識別位點(substrate recognition site，SRS)中SRS3 和SRS5 的序列完全相同，且SRS1、SRS2、SRS4 和SRS6 的序列僅有個別氨基酸存在差異。 并且，MhL6OH 蛋白與MpL6OH 蛋白的SRS 序列的相似性更高，二者的SRS2、SRS3、SRS5 和SRS6序列完全相同，僅分別在SRS1 和SRS4 序列上存在1 個氨基酸的差異，說明MhL6OH 蛋白與MpL6OH 蛋白可能具有相似的底物識別特異性。

圖5 薄荷MhL6OH 蛋白與椒樣薄荷和留蘭香L6OH 蛋白的氨基酸序列的多重比對Fig. 5 Multiple alignment of amino acid sequences of MhL6OH protein of Mentha haplocalyx Briq. with L6OH proteins of M. piperita Linn. and M. spicata Linn.

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖6)表明：MhL6OH 蛋白與MpL6OH 蛋白首先聚在一起，并與蘇格蘭薄荷(Mentha

gracilisSole)CYP71D94 蛋白和MsL6OH 蛋白聚為一組，與其他植物CYD71 家族D 亞家族蛋白明顯分離，說明薄荷與椒樣薄荷的親緣關(guān)系最近，與蘇格蘭薄荷和留蘭香的親緣關(guān)系也較近，但與其他植物的親緣關(guān)系卻相對較遠(yuǎn)。

2.3 組織表達(dá)特性分析

實時熒光定量PCR 分析結(jié)果(圖7) 表明：MhL6OH基因的相對表達(dá)量在薄荷葉中最高，在莖中次之，在根中最低；并且，該基因在葉中的相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于其在莖和根中的相對表達(dá)量。

圖6 薄荷MhL6OH 蛋白與其他植物CYP71 家族D 亞家族蛋白的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 6 Phylogenetic tree analysis on amino acid sequences of MhL6OH protein of Mentha haplocalyx Briq. and proteins of D subfamily of CYP71 family of other species

圖7 薄荷不同器官中MhL6OH 基因的相對表達(dá)量Fig. 7 Relative expression level of MhL6OH gene in different organs of Mentha haplocalyx Briq.

2.4 原核表達(dá)分析

SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果(圖8)表明：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在理論相對分子質(zhì)量60 000 附近有1 條明顯的條帶，該蛋白質(zhì)大小與目的蛋白MhL6OH 的理論相對分子質(zhì)量相符；在誘導(dǎo)1 h 即可大量表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)時間延長，該蛋白質(zhì)的表達(dá)量逐漸增大。

圖8 不同誘導(dǎo)時間薄荷MhL6OH 蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig. 8 SDS-PAGE electrophoresis pattern of MhL6OH protein of Mentha haplocalyx Briq. at different induction times

3 討論和結(jié)論

L6OH 蛋白能夠催化檸檬烯發(fā)生羥基化反應(yīng)，是薄荷屬植物精油合成途徑中的一個重要酶。 目前，已經(jīng)在部分薄荷屬植物中克隆到編碼L6OH 蛋白的基因[18-19]，其CDS 長度為1 485～1 491 bp，且編碼的蛋白質(zhì)均屬于細(xì)胞色素P450 超家族CYP71 家族的D亞家族。 本研究克隆到的薄荷MhL6OH基因CDS 全長1 479 bp，含有保守的細(xì)胞色素P450 結(jié)構(gòu)域，也屬于CYP71 家族的D 亞家族。

不同薄荷屬植物的精油組成差異很大，L6OH 蛋白催化活性差異是造成薄荷屬植物精油組成差異的重要原因[11]。 底物識別位點對L6OH 蛋白的催化活性具有重要作用，留蘭香MsL6OH 蛋白的底物識別位點中單個氨基酸的變化就能改變其催化活性[20]。 薄荷MhL6OH 蛋白與椒樣薄荷MpL6OH 蛋白的底物識別位點高度相似，僅分別在SRS1 和SRS4 序列上存在1 個氨基酸差異，說明二者具有相似的底物識別特異性。 薄荷精油的主要成分為薄荷醇[4]，該成分與椒樣薄荷中的薄荷酮為同一類型的成分，據(jù)此推測MhL6OH 蛋白和MpL6OH 蛋白底物識別位點的特異性導(dǎo)致其催化檸檬烯6-羥基化反應(yīng)的活性降低，致使薄荷和椒樣薄荷精油中的香芹酮含量很低；并且，L3OH 蛋白催化檸檬烯3-羥基化反應(yīng)是薄荷和椒樣薄荷的主要反應(yīng)，導(dǎo)致薄荷醇和薄荷酮累積。

Wang[21]發(fā)現(xiàn)，薄荷精油主要在腺毛中合成和儲存，而腺毛主要分布在葉表面，說明薄荷精油主要在葉中積累；Ahkami 等[11]發(fā)現(xiàn)，薄荷屬植物精油合成途徑的相關(guān)基因均可在腺毛中表達(dá)。 本研究結(jié)果表明：MhL6OH基因在薄荷的根、莖和葉中均可表達(dá)，且該基因在葉中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于莖和根，可見薄荷MhL6OH基因的組織表達(dá)模式與其精油分布一致。