余偉軍， 姚 紅， 孫瑞琦， 王桂青， 鐘淮欽， 黃敏玲，①， 曾黎輝，①

(1. 福建農林大學園藝學院， 福建 福州 350002； 2. 福建省農業(yè)科學院作物研究所， 福建 福州 350013)

鐵線蓮(ClematisfloridaThunb.)中觀花品種的觀賞性好、抗逆性強，是園林應用中不可多得的藤本花卉。 鐵線蓮在日本以及歐洲許多國家的各類花園和家庭園藝中均有應用[1]，深受人們喜愛。 鐵線蓮屬(ClematisLinn.)中部分種類具有清熱利尿和止痛祛風等功效[2]，藥用價值和經濟價值很高。 目前，越來越多的研究人員致力于鐵線蓮屬植物的開發(fā)與利用，以獲得更大的市場效益。

全世界鐵線蓮屬植物有350 多種[3]，除南極洲外，在全世界范圍內廣泛分布。 國內該屬植物超過140 種，在全國各地均有分布，其中，在華中和西南地區(qū)的分布面積較大，并且，該屬植物在云南分布的種類最多，約有60 種以及20 變種[4]。

《中國植物志》[5]89-235將鐵線蓮屬植物劃分為8 組：尾葉鐵線蓮組〔Sect.Viorna(Reichb.) Prantl〕、長瓣鐵線蓮組〔Sect.Atragene(Linn.) DC.〕、黃花鐵線蓮組〔Sect.Meclatis(Spach) Tamura〕、灌木鐵線蓮組(Sect.FruticellaTamura)、威靈仙組(Sect.ClematisTamurin)、鐵線蓮組(Sect.ViticellaDC.)、繡球藤組(Sect.CheiropsisDC.) 和絲鐵線蓮組( Sect.NaraveliopsisHand.-Mazz.)。 已有研究者對鐵線蓮屬植物的組織構造、細胞學和形態(tài)特征等方面[6-10]進行研究，為該屬植物的鑒定和分類奠定了基礎。 由于鐵線蓮屬植物分布廣泛，種類繁多，遺傳背景復雜多樣，僅通過花萼性狀和雄蕊被毛等生物學特征不能準確地鑒定和分類，因此，應在形態(tài)學研究的基礎上結合分子生物學方法，對該屬植物進行更全面的研究。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記使用的引物無需了解DNA 序列，且較RFLP、RAPD 和SSR 具有更高的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性[11-12]。 本研究利用ISSR 技術建立鐵線蓮ISSR-PCR 最佳反應體系，對收集的國內外32 個鐵線蓮屬植物(包括8 個野生種、1 個變種和23 個品種)以及2 個近緣屬植物〔包括鐵筷子品種‘水晶’ (Helleborusthibetanus‘Winterbells’) 和 耬 斗 菜 品 種 ‘ 喜 鵲 ’ (Aquilegia viridiflora‘Magpie’)〕進行親緣關系和遺傳多樣性分析，以期為鐵線蓮屬植物中種、變種和品種的分類提供科學依據，并為鐵線蓮屬植物種質資源的利用和新品種選育提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試34 份材料中，包括短柱鐵線蓮(Clematis cadmiaBuch.-Ham. ex Wall.)、 吳 興 鐵 線 蓮(C.huchouensisTamura)、 灰 葉 鐵 線 蓮 〔C.canescens(Turcz.) W. T. Wang et M. C. Chang〕、貴州鐵線蓮(C.kweichowensisC. Pei)、毛蕊鐵線蓮(C.lasiandraMaxim.)、棉團鐵線蓮(C.hexapetalaPall.)、曲柄鐵線蓮(C.repensFinet et Gagnep.)和厚葉鐵線蓮(C.

crassifoliaBenth.)8 個野生種，分別采自浙江省湖州市長興縣、浙江省湖州市吳興區(qū)、四川省阿壩藏族羌族自治州馬爾康縣、湖北省十堰市竹溪縣、湖南省懷化市沅陵縣、北京市懷柔區(qū)喇叭溝門滿族鄉(xiāng)、四川省樂山市峨眉山和廣東省從化市呂田鎮(zhèn)；還包括大花小木通〔C.armandiivar.farquhariana(Rehder et E.H. Wilson) W. T. Wang〕 1 個 變 種， ‘ 靈 感 ’(‘Inspiration’)、‘如古’(‘Rooguchi’)、‘包查德伯爵夫人’ (‘Comtesse de Bouchaud’)、 ‘ 魔 法 噴 泉’(‘Magic Fountain’)、‘翠鳥’(‘Kingfisher’)、‘鉆石’(‘Diamantina’)、‘紅星’ (‘Red Star’)、‘皇帝’(‘Kaiser’)、‘杰出’(‘Superba’)、‘斯托爾韋克’(‘Stolwijk Gold’)、‘檸檬之夢’(‘Lemon Dream’)、‘阿迪森’(‘Addisonii’)、‘帕斯卡’(‘Pascal’)、‘櫻桃 唇 ’ (‘ Cherry Lip ’)、 ‘ 蘋 果 花 ’ (‘ Apple Blossom’)、 ‘ 倒 影’ (‘Reflections’)、 ‘ 烏 托 邦’(‘Utopia’)、‘綠玉’(‘Alba Plena’)、‘鈴兒響叮當’(‘Jingle Bells’)、‘雀斑’(‘Freckles’)、‘波蘭精神’(‘Polish Spirit’)、‘前衛(wèi)’(‘Avant Garde’)和‘開心果’(‘Pistachio’)23 個鐵線蓮屬品種以及鐵筷子品種‘水晶’和耬斗菜品種‘喜鵲’2 個近緣屬植物，均購自浙江虹越花卉股份有限公司。

ISSR 分子標記使用的86 條通用引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。 10×ExTaqBuffer2+(MgPlus)、dNTPs 和TaKaRaExTaq酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用CTAB 法[13]提取基因組DNA，采用質量體積分數1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA，并用UV-9000S 紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定基因組DNA 的濃度和質量，于-18 ℃保存、備用。

1.2.2 ISSR-PCR 反應體系的優(yōu)化 在25.0 μL ISSR-PCR 反應體系中，包括TaKaRaExTaq酶0.2μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) 2.0 μL，模板DNA濃度分別為10、20、40、60、80 和100 ng·μL-1，引物濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol·L-1，dNTPs 濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 和0.35 mmol·L-1。 在進行其中某一因子或水平實驗時，其他因子固定為模板DNA 濃度 40 ng·μL-1、引 物 濃 度0.4 μmol · L-1及dNTPs 濃 度0.20mmol·L-1。 擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，50 ℃退火l min，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR 產物于4 ℃保存。擴增反應參數的優(yōu)化均使用引物879。

1.2.3 ISSR 引物的篩選及退火溫度的確定 利用優(yōu)化的ISSR-PCR 反應體系，以灰葉鐵線蓮和‘櫻桃唇’基因組DNA 為模板，對86 條ISSR 引物進行篩選，選出擴增結果重復性好、擴增條帶清晰且多態(tài)性高的引物。

設置45.7 ℃、47.7 ℃、50.4 ℃、51.8 ℃、54.0 ℃和55.4 ℃ 6 個退火溫度，確定所篩選引物的最佳退火溫度。

1.2.4 ISSR 擴增 利用篩選出來的引物、最佳退火溫度以及優(yōu)化的ISSR-PCR 反應體系對供試34 份材料的基因組DNA 進行擴增。 擴增產物在0.5×TAE電泳緩沖液中用質量體積分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色10 min，JS-2000 凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)掃描并保存電泳圖。

1.3 數據整理和統(tǒng)計

統(tǒng)計ISSR-PCR 擴增產物同一位置的條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，利用EXCEL 2003 軟件進行數據統(tǒng)計。 利用SPSS 13.0 統(tǒng)計分析軟件計算各材料間的遺傳距離。

2 結果和分析

2.1 DNA 提取及檢測

部分鐵線蓮屬植物基因組DNA 的電泳檢測結果見圖1。 結果顯示：擴增條帶明亮清晰。 各樣品的OD260/OD280比值在1.6 ～2.0 之間，說明蛋白質和多酚類等干擾物質含量少。

圖1 鐵線蓮屬部分植物基因組DNA 的電泳檢測結果Fig. 1 Electrophoresis detection result of genomic DNA from some of Clematis Linn. plants

2.2 ISSR-PCR 反應體系優(yōu)化

鐵線蓮屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 反應體系優(yōu)化結果見圖2。 結果顯示：當模板DNA 濃度為40 ng·μL-1、引物濃度為0.4 μmol·L-1和dNTPs 濃度為0.15 mmol·L-1時，擴增條帶較多且清晰度最好。 最終確定ISSR-PCR 最佳反應體系的總體積為25.0 μL，包括40 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、0.4μmol·L-1引物1.0 μL、0.15 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) 2.0 μL、TaKaRaExTaq酶0.2 μL 和ddH2O 18.8 μL。

圖2 鐵線蓮屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 反應體系優(yōu)化結果Fig. 2 Optimization result of ISSR-PCR reaction system of genomic DNA from Clematis Linn. plants

2.3 ISSR 引物的篩選和擴增結果

分別用灰葉鐵線蓮和‘櫻桃唇’的基因組DNA為模板，對86 條ISSR 引物進行篩選，選出擴增條帶多且清晰的引物13 條。 對篩選出的13 條引物分別設置6 個退火溫度進行PCR 擴增，確定各引物的最佳退火溫度(表1)。

表1 用于32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物基因組DNA ISSR-PCR 反應的引物和退火溫度及擴增結果Table 1 Primers and annealing temperature used for ISSR-PCR reaction of genomic DNA from 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera and their amplification results

利用篩選出的13 條引物對32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物基因組DNA 進行ISSR-PCR 反應，擴增結果(表1)顯示：13 條引物共擴增出172 個條帶(位點)，平均每條引物擴增出13.2 個位點，其中，多態(tài)性位點168 個，平均每條引物擴增出12.9 個多態(tài)性位點，平均多態(tài)性位點百分率為98.2%。 13條引物中，引物845 和892 擴增出的位點數最多，均為18 個。 其中，引物886 對32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 擴增圖譜見圖3。

圖3 引物866 對32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR 擴增圖譜Fig. 3 ISSR-PCR amplification pattern of genomic DNA from 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera using primer 886

2.4 遺傳多樣性分析

基于ISSR-PCR 擴增結果的32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物的聚類圖見圖4。

由圖4 可以看出：32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物的遺傳距離在0.22～1.21 之間，其中，32 個鐵線蓮屬植物的遺傳距離在0.22 ～1.09 之間，鐵筷子品種‘水晶’和耬斗菜品種‘喜鵲’與32 個鐵線蓮屬植物的遺傳距離較遠。 在遺傳距離1.02 處，將32 個鐵線蓮屬植物分為3 個大組，‘杰出’單獨聚為1 個大組，‘斯托爾韋克’和‘檸檬之夢’聚為1 個大組，其余29 個鐵線蓮屬植物聚為第3 大組；在遺傳距離0.92 處，將第3 大組進一步劃分為3 個亞組，第1 亞組包括‘阿迪森’、‘帕斯卡’和‘櫻桃唇’，第2 亞組包括短柱鐵線蓮、灰葉鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、曲柄鐵線蓮、‘鈴兒響叮當’和‘雀斑’，第3 亞組包括吳興鐵線蓮等20 個鐵線蓮屬植物；在遺傳距離0.77 處，將第3 亞組又進一步劃分為7 個小組，其中，吳興鐵線蓮和貴州鐵線蓮聚為1 個小組。

供試32 個鐵線蓮屬植物中，8 個野生種(短柱鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、灰葉鐵線蓮、曲柄鐵線蓮、吳興鐵線蓮、貴州鐵線蓮、棉團鐵線蓮和厚葉鐵線蓮)、1 個變種(大花小木通)與23 個品種間親緣關系的分析結果顯示：短柱鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、灰葉鐵線蓮和曲柄鐵線蓮與‘鈴兒響叮當’和‘雀斑’的親緣關系較近；吳興鐵線蓮、貴州鐵線蓮、棉團鐵線蓮和大花小木通與‘蘋果花’的親緣關系較近；厚葉鐵線蓮與‘靈感’、‘如古’和‘包查德伯爵夫人’等品種的親緣關系較近。

圖4 基于ISSR-PCR 擴增結果的32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物的聚類圖Fig. 4 Dendrogram of 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera based on ISSR-PCR amplification result

3 討 論

本研究建立的鐵線蓮屬植物基因組DNA ISSRPCR 最佳反應體系的總體積為25.0 μL，包括40 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、0.4 μmol·L-1引物1.0μL、0.15 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10×ExTaqBuffer2+(MgPlus)2.0μL、TaKaRaExTaq酶0.2μL 和 ddH2O18.8μL。 篩選出的13 條引物對32 個鐵線蓮屬植物及2 個近緣屬植物基因組DNA 的ISSR-PCR反應結果顯示：共擴增出172 個條帶(位點)，其中，多態(tài)性位點168 個，平均多態(tài)性位點百分率為98.2%，說明ISSR 分子標記可以應用于鐵線蓮不同品種以及野生種間的鑒別，也為進一步的雜交育種工作中親本選擇與雜交組合的制定提供依據。

《鐵線蓮栽培12 月計劃》[14]將鐵線蓮品種劃分為常綠組(包括常綠大洋組、常綠木通組和常綠卷須組)、華麗雜交組、葡葉組、大葉組、西藏組、蒙大拿組、全緣組、德克薩斯組、尾葉組、長瓣組、早花大花組、晚花大花組、南歐組和佛羅里達組。 本研究對32個鐵線蓮屬植物的聚類結果與鐵線蓮的園藝分類結果較為一致，如第1 等級劃分出蒙大拿組(‘杰出’)和長瓣組(‘金葉子’和‘檸檬之夢’)與其他組間的差異；第2 等級劃分出德克薩斯組(‘阿迪森’、‘帕斯卡’和‘櫻桃唇’)與其他組之間的差異；第3 等級劃分出常綠組(‘蘋果花’)、全緣組(‘靈感’和‘如古’)和大花組(‘包查德伯爵夫人’、‘魔法噴泉’、‘翠鳥’、‘鉆石’、‘紅星’和‘皇帝’)與其他組間的差異，由此可見，ISSR 分子標記不僅能夠區(qū)分鐵線蓮不同品種的分組，對于同一分組中親緣關系較近的類群也能檢測出較高的多態(tài)性[15]。

本研究首次從分子水平鑒定了鐵線蓮屬野生種與品種間的親緣關系，結果顯示：短柱鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、灰葉鐵線蓮和曲柄鐵線蓮與常綠卷須組的親緣關系較近；吳興鐵線蓮、貴州鐵線蓮和棉團鐵線蓮與常綠木通組的親緣關系較近；厚葉鐵線蓮與全緣組和早花大花組的親緣關系較近。 相關研究結果表明：短柱鐵線蓮和吳興鐵線蓮屬于鐵線蓮組[16]，毛蕊鐵線蓮、曲柄鐵線蓮和貴州鐵線蓮屬于尾葉鐵線蓮組[17]，灰葉鐵線蓮屬于灌木鐵線蓮組[18]，棉團鐵線蓮屬于威靈仙組棉團鐵線蓮亞組(Subsect.AngustifoliaTamura)[5]153-156，[19]，而本文的研究結果顯示短柱鐵線蓮和毛蕊鐵線蓮的親緣關系更近，吳興鐵線蓮和貴州鐵線蓮的親緣關系更近。 推測導致這一結果的原因可能是由于生物學性狀容易受到環(huán)境等外界因子的影響，說明傳統(tǒng)的生物學形態(tài)分類方法不能完全準確鑒定鐵線蓮屬植物的親緣關系，建議結合分子標記等生物學方法與形態(tài)學性狀進行進一步驗證。

本研究結果還顯示：‘魔法噴泉’與‘鉆石’并非市場上所說的同物異名，而是2 個不同的園藝品種。此外，2 個近緣屬植物鐵筷子品種‘水晶’和耬斗菜品種‘喜鵲’與 ‘杰出’的遺傳距離較近，建議進行授粉雜交，觀察這2 個品種是否能夠通過與鐵線蓮屬植物進行屬間遠緣雜交來改造鐵線蓮屬植物的基因組，獲得更多的優(yōu)良性狀。