田曉玲，劉廣超， 何 嬌，路登宇，黃承玲，①

(1.貴州民族大學(xué)人文科技學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州思源農(nóng)旅綜合開(kāi)發(fā)有限公司，貴州盤(pán)州553537)

‘金躑躅’(Rhododendronmolle‘Jinzhizhu’)是園林綠化植物中不可多得的黃色杜鵑花品種，由羊躑躅(Rhododendron molleG. Don)實(shí)生苗開(kāi)花植株經(jīng)芽變選育獲得，‘金躑躅’的花冠金黃色，與羊躑躅的純黃色花冠有明顯區(qū)別。 該品種無(wú)種子繁殖體，并且扦插繁殖困難。 目前，有關(guān)羊躑躅的繁育研究主要集中于繁殖生物學(xué)以及扦插和壓條方法等方面[1]，[2]1-4，[3]3-16，[4]，但對(duì)羊躑躅組培快繁的研究較少[2]4-8，不利于羊躑躅及其品種的繁殖和推廣應(yīng)用。 作者以‘金躑躅’莖段為外植體，對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的激素種類和濃度以及增殖培養(yǎng)基中的蔗糖濃度進(jìn)行篩選，以期建立穩(wěn)定、高效的‘金躑躅’離體再生體系，為該品種的規(guī)?；庇胺€(wěn)定生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試‘金躑躅’栽培苗取自中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物園。 于2016 年6 月初剪取長(zhǎng)7～10 cm 的‘金躑躅’當(dāng)年生枝條，切成帶1 或2 個(gè)腋芽的莖段，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇漂洗20 s、無(wú)菌水沖洗3～5 遍，再用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%氯化汞消毒5～8 min、無(wú)菌水沖洗3～5 遍，作為外植體備用。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素配比及培養(yǎng) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定WPM 培養(yǎng)基(含6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.6)為基本培養(yǎng)基，添加30 g·L-1蔗糖以及不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素組合。其中，細(xì)胞分裂素為1.0 mg·L-16-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、1.0 mg·L-12-ip (異戊烯基腺嘌呤)和1.0 mg·L-1KT(激動(dòng)素)；生長(zhǎng)素為0.1 mg·L-1NAA(萘乙酸)、0.1 mg·L-1IAA(吲哚乙酸)和0.1 mg·L-1IBA(吲哚丁酸)，采用完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置9 個(gè)處理組；每處理組10 瓶，每瓶接種3 個(gè)莖段。 于溫度20 ℃～23 ℃、空氣相對(duì)濕度50%～60%、光照度1 500～1 800 lx、光照時(shí)間8 h·d-1的條件下培養(yǎng)30 d；統(tǒng)計(jì)分化出不定芽的莖段數(shù)，按照公式“分化率=(分化出不定芽的莖段數(shù)/接種莖段數(shù))×100%”計(jì)算分化率，并據(jù)此確定適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基配比的正交試驗(yàn) 采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3 因子分別為2-ip 濃度、NAA 濃度和蔗糖濃度，其中，2-ip 濃度分別為0.5、1.0 和1.5 mg·L-1，NAA 濃度分別為0.05、0.10 和0.15 mg·L-1，蔗糖濃度分別為20、30 和40g·L-1，共設(shè)置9 個(gè)處理組；每處理組10 瓶，每瓶接種3 個(gè)不定芽。 在WPM 培養(yǎng)基中按上述正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別添加2-ip、NAA 和蔗糖，并按照上述條件培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)試管苗數(shù)，按照公式“增殖率=(試管苗數(shù)/接種不定芽數(shù))×100%”和“增殖倍數(shù)=試管苗數(shù)/出現(xiàn)試管苗的不定芽數(shù)”計(jì)算增殖率和增殖倍數(shù)，并據(jù)此確定適宜的增殖培養(yǎng)基。

1.2.3 生根培養(yǎng)基中激素配比及培養(yǎng) 在含有30 g·L-1蔗糖的WPM 培養(yǎng)基中分別添加NAA(濃度分別為0.10、0.50和1.00 mg·L-1)、IBA (濃度 分別為0.10、0.50 和1.00 mg·L-1)和NAA-IBA(NAA 和IBA 濃度均分別為0.05、0.25和0.50 mg·L-1)，共設(shè)置9 個(gè)處理組；每處理組10 瓶，每瓶接種3 株試管苗。 按照上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)生根苗數(shù)，按照公式“生根率=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%”計(jì)算生根率，并據(jù)此確定適宜的生根培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用EXCEL 2007 和SPSS 16.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素配比對(duì)‘金躑躅’莖段分化率的影響(±SE)Table 1 Effect of hormone proportion in induction medium on differentiation rate of stemsegmentof Rhododendron molle‘Jinzhizhu’ (±SE)

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素配比對(duì)‘金躑躅’莖段分化率的影響(±SE)Table 1 Effect of hormone proportion in induction medium on differentiation rate of stemsegmentof Rhododendron molle‘Jinzhizhu’ (±SE)

1)同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P ＜0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P ＜0.05)difference.

編號(hào)No.激素配比Hormone proportion分化率/%1)Differentiation rate1)1 1.0 mg·L-1 2-ip-0.1 mg·L-1 NAA 83.3±5.6a 2 1.0 mg·L-1 2-ip-0.1 mg·L-1 IAA 60.0±6.7b 3 1.0 mg·L-12-ip-0.1 mg·L-1 IBA 56.7±7.1b 4 1.0 mg·L-1 6-BA-0.1 mg·L-1 NAA 36.7±7.8c 5 1.0 mg·L-16-BA-0.1 mg·L-1IAA 30.0±7.8cd 6 1.0 mg·L-1 6-BA-0.1 mg·L-1 IBA 33.3±7.0cd 7 1.0 mg·L-1KT-0.1 mg·L-1NAA16.7±5.6de 8 1.0 mg·L-1 KT-0.1 mg·L-1IAA 6.7±4.4e 9 1.0 mg·L-1KT-0.1 mg·L-1IBA3.3±3.3e

2 結(jié)果和分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素配比對(duì)‘金躑躅’莖段分化的影響

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度對(duì)‘金躑躅’莖段分化率的影響見(jiàn)表1。 結(jié)果顯示：總體上看，在添加1.0 mg·L-12-ip 的培養(yǎng)基中，莖段分化率(分化率均值為66.7%)顯著高于添加1.0 mg·L-16-BA 或1.0 mg·L-1KT的培養(yǎng)基(分化率均值分別為33.3%和8.9%)，而在添加0.1 mg·L-1NAA 的培養(yǎng)基中，莖段分化率(分化率均值為45.6%)顯著高于添加0.1 mg·L-1IAA 或0.1 mg·L-1IBA 的培養(yǎng)基(分化率均值分別為32.2%和31.1%)。 其中，在添加1.0 mg·L-12-ip 和0.1 mg·L-1NAA 的培養(yǎng)基中，莖段基部分化出大量不定芽，分化率達(dá)到83.3%，顯著高于其他培養(yǎng)基。

2.2 增殖培養(yǎng)基配比對(duì)‘金躑躅’不定芽增殖的影響

增殖培養(yǎng)基中2-ip、NAA 和蔗糖濃度對(duì)‘金躑躅’不定芽增殖率的影響見(jiàn)表2。 結(jié)果顯示：在添加0.5 mg·L-12-ip、0.05 mg·L-1NAA 和20 g·L-1蔗糖，添加1.0 mg·L-12-ip、0.05 mg·L-1NAA 和30 g·L-1蔗糖以及添加1.5 mg·L-12-ip、0.10 mg·L-1NAA 和20 g·L-1蔗糖的3 組培養(yǎng)基中，不定芽增殖率均大于90%，且總體上顯著大于其他培養(yǎng)基，其中后2 組培養(yǎng)基中不定芽增殖率均達(dá)到93.3%，增殖倍數(shù)也較大，分別為3.4 和3.5。 在添加0.5 mg·L-12-ip、0.15 mg·L-1NAA 和40 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基中，不定芽增殖率最低，僅為13.3%。

表2 增殖培養(yǎng)基配比對(duì)‘金躑躅’不定芽增殖率影響效應(yīng)的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果(±SE)Table 2 Result of L9(34) orthogonal experiment on effect of proportion of proliferationmediumon proliferation rate of adventitious bud of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ (±SE)

表2 增殖培養(yǎng)基配比對(duì)‘金躑躅’不定芽增殖率影響效應(yīng)的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果(±SE)Table 2 Result of L9(34) orthogonal experiment on effect of proportion of proliferationmediumon proliferation rate of adventitious bud of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ (±SE)

1)A：2-ip 濃度Concentrationof2-ip(mg·L-1)；B：NAA 濃度Concentration of NAA (mg·L-1)； C： 蔗糖濃度Concentration of sucrose (g·L-1).2)同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P ＜0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P ＜0.05)difference.

編號(hào)No.因子和水平1)Factor and level1)A B C增殖率/%2)Proliferation rate 2)增殖倍數(shù)Proliferation multiple 1 0.5 0.05 20 90.0±5.1a 2.5 2 0.5 0.10 30 43.3±5.1cd 1.5 3 0.5 0.15 40 13.3±5.4d 2.0 4 1.0 0.05 30 93.3±4.4a 3.4 5 1.0 0.10 40 73.3±4.4b 1.5 6 1.0 0.15 20 86.7±5.1ab 1.7 7 1.5 0.05 40 56.7±5.1c 2.7 8 1.5 0.10 20 93.3±7.4a 3.5 9 1.5 0.15 30 56.7±5.4c 2.5

2.3 生根培養(yǎng)基中激素配比對(duì)‘金躑躅’試管苗生根的影響

生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素濃度對(duì)‘金躑躅’試管苗生根的影響見(jiàn)表3。 結(jié)果顯示：在添加0.50 和1.00 mg·L-1NAA 的培養(yǎng)基中試管苗的生根率較高；其中，在添加0.50 mg·L-1NAA的生根培養(yǎng)基中試管苗的生根率最高，達(dá)到70.0%，顯著高于其他培養(yǎng)基。 在添加0.50 mg·L-1NAA 和0.50 mg·L-1IBA的生根培養(yǎng)基中試管苗的生根率最低，僅為13.3%。 總體上看，在生根培養(yǎng)基中組合添加NAA 和IBA 對(duì)‘金躑躅’試管苗生根無(wú)明顯的促進(jìn)作用。

表3 生根培養(yǎng)基中激素配比對(duì)‘金躑躅’試管苗生根狀況的影響(±SE)Table 3 Effect of hormone proportion in rooting medium on rooting status of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ plantlet (±SE)

表3 生根培養(yǎng)基中激素配比對(duì)‘金躑躅’試管苗生根狀況的影響(±SE)Table 3 Effect of hormone proportion in rooting medium on rooting status of Rhododendron molle ‘Jinzhizhu’ plantlet (±SE)

1)同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P ＜0.05) Different lowercasesinthesamecolumnindicatethesignificant(P ＜0.05)difference.

編號(hào)No.激素配比Hormone proportion生根率/%1)Rooting rate1)1 0.10 mg·L-1 NAA 16.7±5.6c 2 0.50 mg·L-1NAA 70.0±6.0a 3 1.00 mg·L-1NAA 40.0±6.7b 4 0.10 mg·L-1IBA 23.3±8.7bc 5 0.50 mg·L-1IBA 33.3±7.0b 6 1.00 mg·L-1IBA 20.0±7.4c 7 0.05 mg·L-1NAA-0.05 mg·L-1IBA 13.3±5.4c 8 0.25 mg·L-1NAA-0.25 mg·L-1IBA 30.0±9.2bc 9 0.50 mg·L-1 NAA-0.50 mg·L-1 IBA 33.3±7.0bc

3 討 論

杜鵑屬(RhododendronLinn.)在中國(guó)包含9 個(gè)亞屬，且各亞屬種類具有不同的特性，因而，雖然對(duì)杜鵑屬植物的組培已有較多研究報(bào)道[5-8]，[9]4-9，[10-13]，但杜鵑屬不同種類對(duì)應(yīng)的最適培養(yǎng)條件存在較大差別[9]36-39。 毛元榮等[6]認(rèn)為，對(duì)多數(shù)杜鵑屬植物而言，低鹽度的培養(yǎng)基較為適合；本研究使用的基本培養(yǎng)基為WPM 培養(yǎng)基，屬于中低鹽度培養(yǎng)基，較適宜‘金躑躅’莖段的組培，佐證了毛元榮等[6]的研究結(jié)果。

在杜鵑屬植物的組培過(guò)程中，使用不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可導(dǎo)致外植體分化率差異明顯[10]；常用的細(xì)胞分裂素多為2-ip、6-BA 和KT 單獨(dú)使用或組合使用[6]。 苗永美等[13]的研究結(jié)果表明：6-BA 僅有利于某些杜鵑屬種類的組培，而2-ip 則有利于多數(shù)杜鵑屬種類的組培，且某些種類的叢生芽需轉(zhuǎn)移至含2-ip 的培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)良好。 本研究中，在添加2-ip 的培養(yǎng)基上‘金躑躅’莖段分化率顯著高于添加6-BA 或KT 的培養(yǎng)基，并以2-ip 和NAA 組合使用的促分化效果最好，說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2-ip 有利于‘金躑躅’莖段的分化。

羊躑躅扦插生根困難，生根率最高只能達(dá)到43.2%[3]34。通常情況下在生根培養(yǎng)基中添加NAA、IBA 和IAA 可促進(jìn)試管苗生根，但單一生長(zhǎng)素及生長(zhǎng)素組合對(duì)生根的作用效應(yīng)存在差異，其中組合使用生長(zhǎng)素對(duì)某些植物試管苗的生根有協(xié)同促進(jìn)作用[14]。 在本研究中，僅添加NAA 可使‘金躑躅’試管苗的生根率顯著提高，但NAA 過(guò)高則導(dǎo)致其生根率降低，這可能與‘金躑躅’內(nèi)在特性或內(nèi)源激素水平有關(guān)[11]，因此，在‘金躑躅’試管苗的生根培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)將生長(zhǎng)素濃度控制在適宜范圍內(nèi)。